涂楓 趙為民 曹靜

摘要：將黑曲霉屬XynB基因和豬RELMβ基因核心啟動子區(qū)克隆到pcDNA3.1（-）中，構(gòu)建攜帶綠色熒光和Myc雙標(biāo)記的腸道特異表達(dá)載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)將載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT29）和人肝癌細(xì)胞（Bel7402），熒光顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)，該載體可在HT29細(xì)胞特異表達(dá)綠色熒光蛋白;對轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體的HT29細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測和WB分析，結(jié)果表明，XynB基因在HT29細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄，并且在細(xì)胞內(nèi)檢測到目的蛋白表達(dá)。

關(guān)鍵詞：木聚糖酶;特異表達(dá)載體;抵抗素樣β基因;WB檢測;RT-PCR檢測

中圖分類號： Q786 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）11-0053-04

收稿日期：2019-07-24

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31872338）;國家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（編號：CARS-35）;江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（編號：PZCZ201733）。

作者簡介：涂楓（1989—），男，江蘇南京人，主要從事豬育種研究。E-mail：530538145@qq.com。

通信作者：陳哲，副研究員，主要從事畜禽繁殖和環(huán)境控制研究。E-mail：chenzzju@163.com。 ?木聚糖是含量僅次于纖維素的半纖維素多糖，作為玉米-豆粕型日糧中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，無法被單胃動物內(nèi)源性消化酶獨立消化[1]。木聚糖酶（xylanase B，XynB）可以破壞木聚糖的大分子結(jié)構(gòu)，是水解木聚糖的關(guān)鍵酶。黑曲霉屬的木聚糖酶具有良好的耐酸性，畜禽胃腸道溫度和pH值對該木聚糖酶活性影響不明顯，目前木聚糖酶被作為添加劑應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)飼料生產(chǎn)[2]?？紤]到外源性木聚糖酶降解效率和木聚糖存在的廣泛性，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)木聚糖酶在動物腸道內(nèi)表達(dá)，為實現(xiàn)飼料中木聚糖的徹底降解提供可能。

抵抗素樣β基因（resistin-like molecule β，RELMβ）是腸道免疫保護(hù)相關(guān)的重要候選基因，在近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸特異性高表達(dá)[3]。本研究將黑曲霉屬XynB基因和豬RELMβ基因核心啟動子區(qū)克隆到pcDNA3.1（-）中，擬構(gòu)建攜帶綠色熒光和Myc雙標(biāo)記的腸道特異表達(dá)載體，旨在為木聚糖酶內(nèi)源性表達(dá)提供材料，也為進(jìn)一步提高飼料利用率、降低家畜糞便污染提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 pcDNA3.1（-）質(zhì)粒，購于上海Invitrogen生命技術(shù)有限公司;pMD18T質(zhì)粒，購于大連寶生物有限公司;pRSETA-XynB質(zhì)粒，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院吳珍芳教授課題組構(gòu)建并惠贈，pEGFP-C3質(zhì)粒和pMD18-RELMβ（-574～+215）質(zhì)粒，為筆者所在實驗室保存;人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT29和人肝癌細(xì)胞株Bel7402，購自凱基生物（南京）公司。

1.1.2 主要試劑和工具酶 限制性內(nèi)切酶NheⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ，Prime STAR 高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Premix Taq（La Taq version 2.0）酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自寶生物（大連）有限公司;中量無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、快速連接試劑盒（Liga FastTM Rapid DNA Ligation System）購自Promega公司。

轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM LTX，購自Invitrogen公司;胰酶、PBS、DMEM（高糖）、胎牛血清（FBS）為Gibco產(chǎn)品;抗Myc的小鼠一抗、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗小鼠二抗、Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑，均購于天根生化公司。Western Blot相關(guān)試劑，購自生工生物工程（上海）股份有限公司，顯影液、定影液，購自南京思泰樂公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體pcDNA3.1-XynB-Myc的構(gòu)建 以原核載體pRSETA-XynB為模板，根據(jù)XynB基因序列，設(shè)計PCR引物P1F/P1R（表1），其中5′端引物P1F帶有Xho Ⅰ酶切位點（CTCGAG）及其保護(hù)堿基，5′端引物P1R末端引入Myc-Tag序列，帶有Kpn Ⅰ酶切位點（GGTACC）及其保護(hù)堿基。PCR產(chǎn)物與pMD18T載體連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-XynB-Myc，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，陽性質(zhì)粒采用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定并送測序驗證。將pcDNA3.1（-）載體和pMD18-XynB-Myc重組質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，純化回收載體pcDNA3.1（-）和目的片段 XynB-Myc，利用T4連接酶將純化回收后的 XynB-Myc目的片段連接到線性化的pcDNA3.1（-）載體，構(gòu)建XynB真核表達(dá)載體pcDNA3.1-XynB-Myc，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)過LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后少量提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.2 pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP的構(gòu)建 根據(jù)質(zhì)粒pcDNA3.1-XynB-Myc設(shè)計PCR引物 P1F/P2R（表1），P1F引物5′端帶有酶切位點XhoⅠ，P2R引物5′端序列與GFP序列5′末端互補。PCR條件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s;30個循環(huán);72 ℃ 10 min，擴增的XynB-Myc片段大小為682 bp。以pEGFP-C3序列為模板，設(shè)計PCR反應(yīng)引物 P3F/P3R（表1），P3F的5′端序列與XynB-Myc序列3′末端一致，引物P3R的5′端帶有酶切位點Kpn Ⅰ。擴增程序：98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min，擴增的片段大小為768 bp。

以上述擴增產(chǎn)物XynB-Myc片段及GFP片段為模板，使用引物為P1F和P3R，采用重疊PCR方法將2種組件融合，獲得XynB-Myc-GFP融合片段（1 398 bp），擴增的程序：98 ℃ 4 min;98 ℃ 10 s，52 ℃ 10 s，72 ℃ 130 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴增的片段大小為1 398 bp。

利用T4連接酶將XynB-Myc-GFP純化后融合片段與pMD18T連接，得到中間載體pMD18T-XynB-Myc-GFP，雙酶切鑒定。采用XhoⅠ和KpnⅠ對pMD18T-XynB-Myc-GFP進(jìn)行雙酶切，回收得到XynB-Myc-GFP片段，克隆至pcDNA3.1（-）相應(yīng)的酶切位點，獲得重組載體pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP，并進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3 豬RELMβ基因啟動子指導(dǎo)的腸道特異表達(dá)載體構(gòu)建 利用NheⅠ和XhoⅠ對pMD18-RELMβ（-574～+215）和pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP進(jìn)行雙酶切，凝膠回收目的片段，將RELMβ核心啟動子片段克隆到pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP相應(yīng)的酶切位點，獲得重組載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP，酶切鑒定載體。

1.2.4 XynB在HT29細(xì)胞的特異表達(dá) HT29細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)孔中，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP重組載體，轉(zhuǎn)染12 h后在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況并拍照。

1.2.5 XynB基因在HT29細(xì)胞中的表達(dá)鑒定 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的HT29細(xì)胞系復(fù)蘇，以培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western-blot試驗，選擇Myc抗體檢測目的蛋白XynB在細(xì)胞中的表達(dá)。收集培養(yǎng)4 d的轉(zhuǎn)基因HT29細(xì)胞系、同代正常培養(yǎng)HT29細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染的HT29細(xì)胞抽提RNA，經(jīng)過DNase處理后，通過RT-PCR檢測其轉(zhuǎn)錄情況，設(shè)計引物擴增XynB-GFP基因片段部分序列，跨內(nèi)含子β-action內(nèi)參引物檢測用于排除模板DNA污染（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達(dá)載體pcDNA3.1-XynB-Myc的構(gòu)建

以原核載體pRSETA-XynB為模板，PCR擴增獲得目的基因片段XynB-Myc，大小為678 bp（圖1-A）。雙酶切鑒定顯示，XynB-Myc成功連接到pMD18T載體中（圖1-B）。重組載體pcDNA3.1-XynB-Myc經(jīng)雙酶切，獲得2條條帶，與預(yù)期相符（圖1-C），表明XynB-Myc成功插入到表達(dá)載體pcDNA3.1中。

2.2 載體pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP的構(gòu)建

擴增的XynB-Myc片段大小為682 bp，以pEGFP-C3為模板，擴增的GFP片段大小為 768 bp，XynB-Myc片段及GFP片段為模板，重疊PCR獲得XynB-Myc-GFP融合片段，大小為 1 398 bp，酶切產(chǎn)物電泳檢測符合預(yù)期大小（圖2-A）。雙酶切鑒定顯示，XynB-Myc-GFP成功連接到pMD18T載體中（圖2-B）。構(gòu)建的pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP表達(dá)載體XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，凝膠電泳檢測，觀察到大小符合預(yù)期的目的連接片段和空質(zhì)粒片段（圖2-C），表明XynB-Myc-GFP片段成功克隆到pcDNA3.1載體。

2.3 腸道特異表達(dá)載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP構(gòu)建

在前期的研究中，對豬RELMβ基因表達(dá)特性及啟動子活性進(jìn)行了分析，選擇核心啟動子區(qū)域（-574～+215）作為腸道特異性啟動子，克隆至表達(dá)載體內(nèi)。構(gòu)建的pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP載體雙酶切后凝膠電泳檢測，觀察到大小約為2 000 bp的目的連接片段和空質(zhì)粒片段，表明RELMβ啟動子片段成功插入到pcDNA3.1- XynB-Myc-GFP載體中（圖3）。

2.4 XynB在HT29細(xì)胞中的特異表達(dá)

采用脂質(zhì)體法，將重組表達(dá)載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HT29細(xì)胞，培養(yǎng)12 h時，通過熒光顯微鏡可以觀察到融合表達(dá)的綠色熒光蛋白，而在Bel7402細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體 12 h 未觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)（圖

4）。結(jié)果表明，構(gòu)建的腸道特異表達(dá)載體能夠指導(dǎo)XynB基因在腸道細(xì)胞特異表達(dá)。

2.5 XynB基因在HT29細(xì)胞表達(dá)鑒定

由圖5可知，轉(zhuǎn)XynB基因的HT29細(xì)胞蛋白中含有目的蛋白，大小約為50 ku，陰性對照組未檢測到目的蛋白。

提取RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測，由圖6可知，轉(zhuǎn)基因HT29細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄合成XynB酶mRNA序列。跨內(nèi)含子引物擴增β-action基因顯示無內(nèi)含子片段擴增，排除了DNA污染可能。

3 討論

天然的啟動子數(shù)量眾多且各具特點，進(jìn)行基因重組體外表達(dá)研究時，研究者通常采用導(dǎo)入特異啟動子來實現(xiàn)目的基因的組織特異性表達(dá)。β-乳球

蛋白（β-lactoglobulin，BLG）是反芻動物最主要的乳清蛋白，利用BLG基因啟動子和5′端調(diào)控序列構(gòu)建的融合α-抗胰蛋白酶、降鈣素和人血清白蛋白等轉(zhuǎn)基因動物均實現(xiàn)目的基因在乳汁的表達(dá)[4-6]，在目前科研中廣泛用來指導(dǎo)外源基因在乳汁中的表達(dá)。腮腺分泌蛋白（parotid secretory protein，PSP）是唾液中特異性高表達(dá)的一種蛋白，豬PSP基因是研制豬腮腺轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器及進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種研究的最佳候選基因[7-8]，綿羊毛囊角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（keratin-associated protein 6.1，KAP6.1）基因已被證實在綿羊毛囊中特異表達(dá)[9]，針對這一特點，已用綿羊KAP6.1啟動子構(gòu)建了一系列毛囊特異表達(dá)載體[10-11]。

RELMβ基因已被證實在嚙齒動物和人的腸道組織特異表達(dá)[3]。研究表明，RELMβ基因啟動子區(qū)包含多個腸上皮特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，而啟動子區(qū)（-574～+215）片段是核心區(qū)域，包含有關(guān)鍵順式作用元件[12]。本研究構(gòu)建的表達(dá)載體pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP在腸道特異表達(dá)啟動子RELMβ調(diào)控下，可有效指導(dǎo)XynB在腸細(xì)胞系HT29特異表達(dá);下一步將利用體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗，測定構(gòu)建的重組載體真核表達(dá)分泌和酶活性，以及分泌的XynB酶穩(wěn)定性、最適pH值等，為運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)XynB內(nèi)源性表達(dá)提供重要材料。

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