白琳 官玲亮 查英 于福來 王凱 謝小麗 龐玉新 陳松筆

摘? 要：采用RT-PCR和RACE（Rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)，從艾納香（Blumea balsamifera （L.） DC.）葉片中克隆到4條編碼艾納香脫氫酶（BbADH1、BbADH2、BbADH3、BbADH4）基因的cDNA序列，并對4條核苷酸及其編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析。結(jié)果顯示：4條艾納香脫氫酶序列開放閱讀框均在900 bp左右，蛋白質(zhì)等電點（pI）值在5.0～9.0之間，含量最多的氨基酸為亮氨酸（Leu），最少的為色氨酸（Try），具有明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，N端未發(fā)現(xiàn)信號肽，且無跨膜區(qū);同源性比對結(jié)果顯示，艾納香BbADH蛋白與其他植物中ADH蛋白具有高度的相似性，且具有脫氫酶的特征功能域;系統(tǒng)發(fā)育分析表明，艾納香（B. balsamifera（L.） DC.）BbADH1和BbADH3同處于一個分支，且與胡楊（Populus euphratica Oliv.）PeADH物種親緣關(guān)系較近，而艾納香BbADH4和BbADH2處于不同分支，且分別與葡萄（Vitis vinifera）VvADH和煙草（Nicotiana tabacum）NtADH物種親緣關(guān)系較近。

關(guān)鍵詞：艾納香;艾納香脫氫酶（BbADH）;氨基酸序列;保守區(qū);系統(tǒng)發(fā)育分析中圖分類號：Q78 ?????文獻標識碼：A

Bioinformatics Analysis of Dehydrogenase Genes Family from theBlumea balsamifera（L.） DC.

BAI Lin^1，2， GUAN Lingliang^1*， ZHA Ying^1，2， YU Fulai¹， WANG Kai¹， XIE Xiaoli¹， PANG Yuxin¹，CHEN Songbi^1*

1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Provincial Engineering Research Center forBlumea balsamifera/ Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Danzhou， Hainan 571737， China; 2. College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang 163319， China

Abstract： Four dehydrogenase genes， named asBbADH1，BbADH2，BbADH3，BbADH4， were cloned fromBlumea balsamifera （L.） DC. by the reverse transcription polymerase chain reaction approach （RT-PCR） and rapid amplification of cDNA ends （RACE） andanalyzed by bioinformatics. The open reading frames of the four dehydrogenase sequences were all around 900 bp， and the isoelectric point （pI） of the proteins was 5.0–9.0. The most abundant amino acid ofBbADHwas leucine （Leu）， and the least was tryptophan （Try）. BbADH showed obvious hydrophobic and hydrophilic regions， no signal peptide at the N-terminus， and no transmembrane region. BbADH fromB. balsamifera（L.） DC showed a high similarity with BbADH from other plants， containing the characteristic functional domain of dehydrogenase. Phylogenetic analysis indicated that BbADH1 and BbADH3 were in the same branch and were closely related to PeADH ofPopulus euphraticaOliv.， while BbADH4 and BbADH2 were in different branches， and were closely related to VvADH ofVitis vinifera and NtADH ofNicotiana tabacum， respectively.

Keywords：Blumea balsamifera（L.） DC; dehydrogenase （BbADH）; amino acid sequence; conserved region; phylogenetic analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.011

艾納香（Blumea balsamifera（L.） DC.）為菊科（Compositae）艾納香屬（Blumea）多年生木質(zhì)草本植物，全株均可入藥，性微溫，味辛、微苦^[1]，是一種重要的民族藥，在我國黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)有著悠久的藥用歷史。艾納香主要藥用成分為L-龍腦，其相對含量達46.56%^[2]。在植物次生代謝中產(chǎn)生的龍腦屬于莰烷型雙環(huán)單萜類化合物，具有左旋（L/?）體和右旋（D/+）體之分（圖1）。大多數(shù)植物中龍腦會通過（+）-龍腦脫氫酶[（+）-borneol dehydrogenase]進一步氧化形成D-樟腦（D-cam?phor）^[3]。對于L-龍腦而言，1985年，Croteau等^[4]從含有L-龍腦和L-樟腦的菊蒿（Tanacetum vulgare）中分離到具有活性的（?）-龍腦焦磷酸合酶，揭示其催化特性，并推測L-龍腦的生物合成與D-龍腦相似：通過（?）-龍腦焦磷酸合酶催化GPP形成L-BPP，逐級水解形成L-龍腦，再通過（?）-龍腦脫氫酶氧化形成L-樟腦。研究發(fā)現(xiàn)艾納香揮發(fā)性成分中，沒有檢測到D-龍腦和L-樟腦，僅存在少量D-樟腦^[5]。然而，通過艾納香轉(zhuǎn)錄組序列分析發(fā)現(xiàn)，艾納香葉片中存在多個與其他植物脫氫酶相似的基因。這是否因為艾納香中脫氫酶基因的底物特異性，只針對D-龍腦進行氧化脫氫，從而導(dǎo)致L-龍腦的大量積累尚不清楚。

為此，本研究對艾納香中脫氫酶基因進行克隆和生物信息學序列分析，以期為揭示L-龍腦在艾納香葉片中的代謝調(diào)控途徑提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 材料

植物材料：艾納香栽培于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所南藥種質(zhì)資源圃。

試劑：RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、載體連接試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal、多功能DNA 純化回收試劑盒均購自廣州飛揚生物工程有限公司。

1.2? 方法

按照Plant RNA Kit試劑盒說明書，提取艾納香葉片的總RNA，采用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，并按試劑盒步驟合成cDNA第一鏈。

通過從本課題組前期對艾納香葉片轉(zhuǎn)錄組的信息，挖掘艾納香中脫氫酶相關(guān)基因信息，再采用RACE技術(shù)克隆基因全長序列。首先利用Prim?er Premier 5.0軟件設(shè)計這些基因的3?和5?引物，3?RACE的下游引物和5?RACE的上游引物使用試劑盒中的通用引物。其中特異引物如表1所示。

參考SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒操作使用說明書，進行3?RACE和5?RACE克隆。艾納香脫氫酶3?RACE / 5?RACE克隆。反應(yīng)體系（20?μL）：3?RACE cDNA / 5'RACE-Ready cDNA模板1.0?μL， PremixTaq （ExTaqTM Version 2.0） 10.0?μL，3?RACE/5?RACE通用引物0.5?μL，UPM 0.5?μL，蒸餾水8.0?μL。PCR擴增程序設(shè)定為：5個循環(huán)：94?℃ 30?s， 72?℃ 3?min，5個循環(huán)：94?℃ 30?s，70?℃ 30?s，72?℃ 3?min，20個循環(huán)：94?℃ 30?s，68?℃ 30?s，72?℃ 3?min。然后收集反應(yīng)產(chǎn)物作為模板1.0?μL，Premix Taq （ExTaqTM Version 2.0） 10.0?μL，加入特異引物0.5?μL，UPM 0.5?μL，滅菌蒸餾水8.0?μL（體系總共20?μL）。PCR 擴增程序設(shè)定為：25個循環(huán)：94?℃ 30?s，68?℃ 30?s，72?℃ 3?min。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行電泳檢測是否有特異條帶，如有條帶，用膠回收試劑盒對目的片段進行回收，回收后將其連接到pEASY-Blunt cloning vector載體上，轉(zhuǎn)化E. coliTrans1-T1感受態(tài)細胞，涂布于添加氨芐青霉素、IPTG、X-gal的LB平板上，37?℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，隨機挑取陽性克隆，挑取白色陽性單菌落于加有100?g/mL氨芐霉素的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37?℃，200?r/min搖床培養(yǎng)，直到足夠渾濁。PCR檢測，反應(yīng)體系：M13通用引物（10?μmol/L）各1.0?μL，2×EcoTaq PCR SuperMix 2.0?μL，菌液1?μL，ddH₂O 21.0?μL，總體積25.0?μL。PCR反應(yīng)程序為：94?℃ 10?min，30個循環(huán)：94?℃ 30?s，55?℃ 30?s，72?℃ 1?min，后72?℃延伸10?min。

反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行電泳檢測。選取片段大小不一致和一致的各兩管分裝成200?μL，委托南京金斯瑞生物科技有限公司測序。根據(jù)RACE測序的結(jié)果設(shè)計特異引物擴增BbADH基因的全長cDNA序列。其引物序列如表1所示。

以cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系：cDNA模板2.0?μL，BbADH Pf（10?μmol/L）1.0?μL，BbADH Pr（10?μmol/L）1.0?μL，10×Trans Taq? HiFi BufferⅠ5.0?μL，2.5?mmol/L dNTPs 4.5?μL，Trans Taq? HiFi DNA Polymerase 0.5?μL，ddH₂O 36.0?μL，總體積50.0?μL。反應(yīng)條件：94?℃ 5?min;94?℃ 30?s，60?℃ 30?s，72?℃ 60?s，30個循環(huán);后72?℃延伸10?min，4?℃ 1?min。回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆檢測，擴菌培養(yǎng)，送樣均與上面步驟相同。獲得重組載體pEASY-Blunt-BbADH，克隆并測序。其余序列均從NCBI中下載。序列登錄號、物種以及基因種類詳見表2。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用DNAMAN軟件分析艾納香BbADH基因的cDNA序列，找到對應(yīng)的開放閱讀框（ORF），并翻譯為氨基酸序列;采用DNAMAN軟件進行序列比對;采用ExPASy-ProtScale工具中的Kyte & Doolittle法（K-D法）對艾納香BbADH蛋白質(zhì)的疏水性進行在線分析^[6-9]，窗口參數(shù)（Window size）設(shè)定為9;采用TMHMM Sever 2.0預(yù)測BbADH的跨膜區(qū)域^[6-9]，輸出格式選擇為默認的圖形化顯示;采用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹;采用DNAMAN和Swiss-model工具對艾納香BbADH蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

2? 結(jié)果與分析

2.1 艾納香BbADH基因cDNA序列分析

本研究總共獲得4條脫氫酶相關(guān)基因。其中，艾納香BbADH1的cDNA序列全長1349?bp，開放閱讀框（ORF）在cDNA序列上的區(qū)域為第129～1029個核苷酸，ORF全長900?bp，編碼300個氨基酸殘基。艾納香BbADH2的cDNA序列全長1226?bp，開放閱讀框（ORF）在cDNA序列上的區(qū)域為第130～1042個核苷酸，ORF全長912?bp，編碼304個氨基酸殘基。艾納香BbADH3的cDNA序列全長1050?bp，開放閱讀框（ORF）在cDNA序列上的區(qū)域為第35～922個核苷酸，ORF全長

887?bp，編碼295個氨基酸殘基。艾納香BbADH4的cDNA序列全長1230?bp，開放閱讀框（ORF）在cDNA序列上的區(qū)域為第148～1057個核苷酸，ORF全長909 bp，編碼303個氨基酸殘基。

2.2 艾納香BbADH氨基酸序列理化性質(zhì)分析

艾納香BbADH氨基酸序列的4個肽鏈分別含有20種氨基酸（圖2），包括天冬酰胺和谷氨酰胺。含量最多的氨基酸種類為亮氨酸（Leu），其次是丙氨酸（Ala）和頡氨酸（Val）。而半胱氨酸（Cys）、組氨酸（His）、蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）的含量相對較少，其中色氨酸（Trp）最少。帶負電荷氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）分別為38、35、39、41個，帶正電荷氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為33、39、33、38個。等電點（pI）分別為5.56、8.70、5.30、6.3。蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)分別為23.33、39.19、32.79、37.87，均屬于穩(wěn)定蛋白。

2.3 艾納香BbADH氨基酸序列疏水性及信號肽分析

本研究對艾納香BbADH蛋白質(zhì)的疏水性進行在線分析發(fā)現(xiàn)（圖3）：BbADH1、BbADH3、BbADH4在第150～250個氨基酸殘基之間，有1個強親水區(qū)域，而BbADH2的強親水區(qū)域在200～ 300個氨基酸殘基之間，4個BbADH序列的GRA?VY（grand average of hydropathicity）值分別為?0.108、?0.254、?0.038、?0.187。分析結(jié)果顯示，GRAVY值均小于0，表明艾納香脫氫酶為親水性蛋白。預(yù)測BbADH的跨膜區(qū)域結(jié)果表明，4種脫氫酶均無跨膜區(qū)，屬于膜外在蛋白。分析4個艾納香脫氫酶蛋白，均沒有發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白為非分泌蛋白。

2.4 艾納香BbADH氨基酸序列比對分析

4條BbADH序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果表明艾納香BbADH蛋白與其他植物ADH蛋白具有高度的同源性，其中青蒿素脫氫酶序列相似性最高，分別為82%、86%、80%、79%，其次是萵苣脫氫酶，且均具有脫氫酶的特征功能域（圖4）。

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