林啟凰，鮑紅娟，張 崗*

（1.廈門醫(yī)學(xué)院，廈門市海洋天然產(chǎn)物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361023； 2.廈門醫(yī)學(xué)院閩臺(tái)青草藥研究室，福建廈門 361023）

大戟科大戟屬植物是被子植物的一個(gè)龐大家族，全世界有2 000 種以上［1］，《中國(guó)植物志》 記載該屬植物有80種［2］，部分是臨床上常見中藥，如大戟、狼毒、甘遂、飛揚(yáng)草等，在民間應(yīng)用也十分普遍，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等藥理活性［3］。通奶草Euphorbia hypericifoliaL.為大戟屬聚生花序組植物［4］，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省，具有清熱利濕、收斂止癢的功效［3］，可用于治療腹瀉及瘙癢性皮膚病，主要含有黃酮、鞣花酸、三萜、甾體類物質(zhì)［5］，但其藥理活性評(píng)價(jià)未見報(bào)道。課題組前期發(fā)現(xiàn)，通奶草乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑制作用，為了進(jìn)一步發(fā)掘其藥用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS／MS） 對(duì)其乙酸乙酯萃取物成分進(jìn)行分析，共鑒定出21 種，包括3 種有機(jī)酸、8 種可水解鞣質(zhì)、10 種黃酮，除鞣花酸和槲皮素外均為首次從該植物中鑒定。

1 材料

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀［Waters 科技（上海） 有限公司］；Q Exactive Focus 組合型四極桿Orbitrap 質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Diaion MCI樹脂（日本三菱化學(xué)公司）。沒食子酸、鞣花酸、異槲皮苷、木犀草苷、紫云英苷、槲皮素對(duì)照品均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；瑞諾苷、番石榴苷、juglalin 對(duì)照品均購(gòu)自成都普利斯生物科技有限公司；金絲桃苷［6］、柯里拉京［7］、老鸛草素［7］對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制。MH 瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；MH 液體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由廈門醫(yī)學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；氨芐青霉素、諾氟沙星藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）。藥材于2018 年10 月采自福建廈門市灌口鎮(zhèn)，經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系鮑紅娟副教授鑒定為大戟科大戟屬植物通奶草Euphorbia hypericifoliaL.的地上部分。

2 方法

2.1 樣品溶液制備 取通奶草地上部分50 g （干重） 粉碎成粗粉，分別用10 倍量75%甲醇加熱回流提取2 次，每次2 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加入適量水混旋后，依次用等量的石油醚、乙酸乙酯各萃取3 次，合并萃取液，減壓蒸干得總萃取物（2.5 g），取適量過MCI樹脂，90%甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓干燥，適量甲醇溶解，即得（1 mg／mL）。

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫 （0～50 min，5%～30% B；50～51 min，30%～100%B；51～57 min，100%～100%B；體積流量0.4 mL／min；全波長(zhǎng)掃描；進(jìn)樣量2.5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源負(fù)離子檢測(cè)模式，輔助氣體積流量5 L／min；噴霧電壓2.00 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；掃描模式Full MS／dd-MS2，m／z100～1 500；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量-30 eV。

2.4 抗菌實(shí)驗(yàn)

2.4.1 抑菌圈測(cè)定［8］取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（-80 ℃超低溫保存），活化后挑取單菌落接種于100 mL MH 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，最后將菌液調(diào)整至約1.5×108CFU／mL 的含菌量。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的陽性對(duì)照品分別為氨芐青霉素、諾氟沙星藥敏紙片，空白對(duì)照為甲醇和活化菌液。將各活化菌液用滅菌棉簽均勻鋪于MH 瓊脂培養(yǎng)基板上，用鑷子夾取直徑6 mm 的無菌濾紙片放在平板中，貼緊MH固體培養(yǎng)基表面，吸取2 mg／mL 樣品溶液10 μL 滴于濾紙上，陽性藥敏紙片同法貼于培養(yǎng)基表面，待甲醇揮干后密封，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h 后觀察。

2.4.2 最小抑菌濃度測(cè)定［9］采用96 孔板法，每孔培養(yǎng)體系為200 μL，含有MH 液體培養(yǎng)液180 μL、不同質(zhì)量濃度的待測(cè)樣品10 μL、菌液10 μL。測(cè)試前配制樣品溶液，并稀釋成2、1.8、1.6、1.4、1、0.8 mg／mL。用空白培養(yǎng)基和甲醇溶液作對(duì)照，吸取稀釋好的待測(cè)樣品10 μL，置于已加入180 μL 培養(yǎng)液的96 孔板中，加入菌液10 μL，密封，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h 后觀察并計(jì)算MIC 值。

公式為MIC （μg／mL） ＝ （V1×C×1 000） ／V2，其中V1為待測(cè)樣品體積（μL），V2為體系總體積（μL），C為使培養(yǎng)液澄清的最低待測(cè)溶液質(zhì)量濃度（mg／mL）。

3 結(jié)果

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合同屬植物化學(xué)成分報(bào)道，推斷通奶草主要成分可能為酚類，故采用負(fù)離子模式采集總離子流數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖1、表1。根據(jù)離子流出峰的相對(duì)保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)荷比、碎片離子信息，同時(shí)參照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，最終鑒定出21 種成分，包括3 種有機(jī)酸、8 種可水解鞣質(zhì)、10 種黃酮，結(jié)合相關(guān)對(duì)照品信息，鑒定了沒食子酸（1）、柯里拉京（5）、老鸛草素（6）、鞣花酸（11）、金絲桃苷（12）、異槲皮苷（13）、木犀草苷（14）、瑞諾苷（15）、番石榴苷（16）、紫云英苷（17）、juglalin （20）、槲皮素（21），除鞣花酸和槲皮素外均首次從該植物中鑒定。體外抗菌實(shí)驗(yàn)顯示，通奶草乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的的抑制作用。具體如下。

圖1 通奶草乙酸乙酯萃取部位負(fù)離子檢測(cè)模式下總離子流圖

3.1 化合物鑒定

3.1.1 沒食子酸類 化合物1 （tR＝6.00 min） 的準(zhǔn)分子離子峰為m／z169.013 3 ［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測(cè)分子式為C7H6O5，二級(jí)碎片離子m／z125.023 1 ［M-H-CO2］-是由為分子中失去一個(gè)質(zhì)子和一個(gè)中性碎片CO2產(chǎn)生，根據(jù)對(duì)照品的相關(guān)信息，鑒定化合物1 為沒食子酸?；衔? （tR＝18.05 min） 的準(zhǔn)分子離子峰為m／z183.029 1 ［MH］-，根據(jù)元素組成，推測(cè)分子式為C8H8O5，二級(jí)碎片離子m／z168.005 4 ［M-H-·CH3］-是由為分子中失去1 個(gè)質(zhì)子和1 個(gè)甲基自由基·CH3產(chǎn)生，初步鑒定化合物2 為沒食子酸甲酯［10］。

3.1.2 沒食子酸鞣質(zhì) 化合物3、7、10 的二級(jí)質(zhì)譜均有m／z169 ［M-H］-特征信號(hào)，且為基峰，提示分子中均有沒食子?；?；其碎片離子在準(zhǔn)分子離子峰基礎(chǔ)上連續(xù)失去沒食子酰基 （-galloyl，152 u）［11］，也可能失去中性碎片H2O。以化合物10 （tR＝33.92 min） 為例，準(zhǔn)分子離子峰為m／z787.100 1 ［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測(cè)分子式C34H28O22，二級(jí)質(zhì)譜顯示了635.090 8 ［M-H-galloyl］-、617.080 9 ［M-H-galloyl-H2O］-、483.078 0 ［M-H-2galloyl］-、465.067 3 ［M-H-2galloyl-H2O］-、169.013 2［GA］-等特征碎片離子信息，根據(jù)文獻(xiàn)［12］鑒定為四沒食子酰基葡萄糖苷。同理，化合物3 （tR＝24.43 min）、7（tR＝28.41 min） 的準(zhǔn)分子離子峰分別為m／z635.089 9、635.089 7 ［M-H］-，根據(jù)碎片離子信息和文獻(xiàn)［12］鑒定均為三沒食子?；咸烟擒眨ㄍ之悩?gòu)體）。

3.1.3 鞣花酸及鞣花鞣質(zhì) 化合物11 （tR＝34.80 min）的準(zhǔn)分子離子峰為m／z300.998 8 ［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測(cè)分子式為C14H6O8，特征碎片離子有m／z283.305 4［M-H-H2O］-、257.008 5 ［M-H-CO2］-。根據(jù)碎片離子和對(duì)照品的相關(guān)信息，鑒定為鞣花酸。

化合物4～6、8～9 鑒定為鞣花鞣質(zhì)，分子中均有六羥基聯(lián)苯二甲酸結(jié)構(gòu)，二級(jí)質(zhì)譜均出現(xiàn)m／z301 ［M-H］-［13］，且為基峰，其碎片離子可能失去沒食子酰基或中性碎片H2O。該類化合物另一個(gè)典型特征是一級(jí)質(zhì)譜上易見［M-2H］2-峰［14］。以化合物5 （tR＝26.60 min）、6 （tR＝27.11 min） 為例，化合物5 準(zhǔn)分子離子峰為m／z633.074 5［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測(cè)分子式C27H22O18，二級(jí)質(zhì)譜顯示了615.063 0 ［M-H-H2O］-、463.051 9 ［M-Hgalloyl-H2O］-、300.999 3 ［ellagic acid］-、169.013 4［GA］-等特征性碎片離子信息，根據(jù)文獻(xiàn)［15］并結(jié)合對(duì)照品質(zhì)譜和色譜信息，鑒定為柯里拉京；化合物6 準(zhǔn)分子離子峰為m／z951.076 2 ［M-H］-，根據(jù)元素組成，推測(cè)分子式C41H28O27，二級(jí)質(zhì)譜顯示了475.034 1 ［M-2H］2-特征性碎片離子，以及933.064 6 ［M-H-H2O］-、933.053 1 ［M-HH2O］-、475.034 1 ［M-2H］2-、300.999 1 ［ellagic acid］-、169.012 9 ［GA］-等特征性碎片離子信息，根據(jù)文獻(xiàn)［15］結(jié)合對(duì)照品質(zhì)譜和色譜信息，鑒定為老鸛［12］草素。同理，

鑒定化合物4、8、9 分別為chebulanin［16］、digalloyl-HHDPglucose、chebulagic acid［12］。

表1 通奶草乙酸乙酯部位化學(xué)成分鑒定

3.2 黃酮類化合物鑒定

3.2.1 槲皮素類 負(fù)離子模式下，黃酮醇苷的ESI 串聯(lián)質(zhì)譜中易形成［M-H］-分子離子峰，脫去糖基形成苷元離子［Y0］-，也可以均裂方式形成［Y0-H］-·自由基負(fù)離子［17］，后者在3-O 取代黃酮中極易形成［18］?；衔?2～13、15～16 鑒定為以槲皮素為母核的黃酮苷，二級(jí)質(zhì)譜均顯示了槲皮素母核的特征信號(hào)為m／z301 為 ［Y0］-，m／z300 為［Y0-H］-·，后者為基峰，說明可能為3-O取代黃酮苷；m／z271 為［Y0-H2CO］-碎片離子，m／z151 為RDA 裂解產(chǎn)生的碎片離子?；衔?2 （tR＝35.18 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z463.088 5 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個(gè)己醛糖基，推斷3-O上連有己醛糖；化合物13 （tR＝35.91 min）準(zhǔn)分子離子峰為m／z463.088 4 ［M-H］-，與苷元m／z301相比少了一個(gè)己醛糖基，推斷3-O上也連有己醛糖，根據(jù)對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定12 為槲皮素-3-Oβ-吡喃半乳糖苷，即金絲桃苷；13 為槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷，即異槲皮苷?；衔?5 （tR＝37.46 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z433.077 8 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個(gè)戊醛糖基，推斷3-O上連有戊醛糖；16 （tR＝38.31 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z433.077 6 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個(gè)戊醛糖基，推斷3-O上也連有戊醛糖，根據(jù)對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定化合物15 為槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷，即瑞諾苷；16 為槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，即番石榴苷。根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子和對(duì)照品信息，鑒定化合物21 （tR＝53.39 min） 為槲皮素。

3.2.2 山柰酚類 化合物17、19～20 鑒定為以山柰酚為母核的黃酮苷，二級(jí)質(zhì)譜均顯示其特征信號(hào)為m／z285 為［Y0］-，m／z284 為［Y0-H］-·，后者為基峰，說明可能為3-O取代黃酮苷；m／z255 為［Y0-H2CO］-碎片離子，m／z151 為RDA 裂解產(chǎn)生的碎片離子?；衔?7 （tR＝39.86 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z447.093 5 ［M-H］-，與苷元m／z285 相比少了一個(gè)己醛糖基，推斷3-O上連有己醛糖，根據(jù)對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，即紫云英苷。化合物19 （tR＝41.50 min） 和20 （tR＝42.43 min） 為同分異構(gòu)體，準(zhǔn)分子離子峰均為m／z417 ［M-H］-，與苷元m／z285 相比均少了一個(gè)戊醛糖基，推斷3-O上連有戊醛糖，根據(jù)對(duì)照品相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，鑒定20 為山柰酚-3-O-α-阿拉伯糖苷，即juglalin；根據(jù)同屬植物化學(xué)成分報(bào)道和相對(duì)保留時(shí)間［19-20］，初步鑒定19 為山柰酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷。

3.2.3 其他黃酮 在實(shí)驗(yàn)條件下，未實(shí)現(xiàn)化合物14 （tR＝35.98 min） 與15 的色譜分離，一級(jí)質(zhì)譜上顯示了m／z447.093 5 ［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰，與化合物17 互為同分異構(gòu)體，但卻顯示了與17 不同的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。表1 顯示，基峰m／z285 為［Y0］-，提示黃酮分子3 位氫未被取代，可能為木犀草素母核，此外還顯示了m／z327.050 8 的碎片離子峰，與文獻(xiàn)［21］報(bào)道一致。結(jié)合對(duì)照品信息，鑒定化合物14 為木犀草苷?；衔?8 （tR＝40.90 min） 準(zhǔn)分子離子峰為m／z417.083 5 ［M-H］-，根據(jù)元素組成推測(cè)分子式為C21H20O10，碎片離子顯示了m／z269 ［Y0］-的芹菜素母核信息，初步鑒定為芹菜素-7-O-β-吡喃葡萄糖苷［21］。

3.3 抗菌活性 結(jié)果見圖2。在質(zhì)量濃度為2 mg／mL時(shí)，通奶草乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為（9±0.2） mm ［陽性對(duì)照為（31±0.2） mm］，見圖2A；對(duì)大腸桿菌為（8±0.3） mm ［陽性對(duì)照為（30±0.3） mm］，見圖2B；MIC 值分別為90、100 μg／mL，表明萃取物對(duì)兩者具有一定的抑制作用。

圖2 通奶草乙酸乙酯萃取物抗菌活性實(shí)驗(yàn)

4 討論

LC-MS／MS 聯(lián)用技術(shù)用于復(fù)雜天然成分分析，具有快速、高效、靈敏等特點(diǎn)［22］，是研究中草藥等天然藥物的有力工具。本研究采用UPLC-MS／MS 聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合對(duì)照品對(duì)照，鑒定了通奶草乙酸乙酯萃取物的21 種成分，以可水解鞣質(zhì)和黃酮類化合物為主，基本闡明通奶草乙酸乙酯萃取部位的成分組成。通奶草中所含化合物類型及種類與同屬植物地錦草［19］及同科植物烏桕［23］等相似，表明同科特別是同屬植物之間的化學(xué)成分存在共性，這對(duì)于開發(fā)藥用資源具有重要意義。本研究所鑒定的諸多化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病原微生物、降血糖等多種生物活性，對(duì)于揭示通奶草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定意義。沒食子酸對(duì)早幼粒細(xì)胞白血?。℉L-60RG）、人胃癌細(xì)胞（KATOⅢ）和結(jié)腸腺癌細(xì)胞（COLO 205） 均有抑制作用［24］；老鸛草素對(duì)單純皰疹病毒（HSV-1 和HSV-2） 具有顯著抑制活性［25］；鞣花酸對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗炎和抗氧化有關(guān)［26］；金絲桃苷能有效抑制COX-2 蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)炎癥因子對(duì)肝細(xì)胞造成的損傷，進(jìn)而保護(hù)肝細(xì)胞［27］；異槲皮苷（15 mg／kg） 可顯著降低四氧嘧啶升高的血糖濃度，其機(jī)制與6-葡萄糖磷脂酶活性抑制以及抗氧化清除自由基密切相關(guān)［28］，這些文獻(xiàn)報(bào)道為通奶草的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。同時(shí)，乙酸乙酯萃取物對(duì)2 種常見的革蘭氏致病菌有一定的抑菌作用，對(duì)后續(xù)的研究有一定的借鑒意義。