陳海燕，劉華東*，李 冰，韋素華

（1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530023； 2.廣西明合藥業(yè)有限責(zé)任公司，廣西南寧 530020）

藤黃健骨膠囊現(xiàn)收錄于《國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品標(biāo)準(zhǔn)》 （YBZ06272008），由熟地黃、雞血藤、淫羊藿、鹿銜草、肉蓯蓉、炒萊菔子、燙骨碎補(bǔ)7 味藥材加工而成，具有補(bǔ)腎、活血、止痛的功效，臨床上主要用于肥大性脊椎炎、頸椎病、跟骨刺、增生性關(guān)節(jié)炎、大骨節(jié)病等病癥的治療［1］，對(duì)腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松癥［2］、腰椎間盤突出癥［3］、腰椎骨折合并嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥［4］、椎動(dòng)脈型頸椎?。?］、原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥［6］、骨性關(guān)節(jié)炎［7］、早期四肢骨折［8］、腰肌勞損［9］等疾病的臨床療效顯著。但目前該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)［10-11］僅對(duì)方中臣藥淫羊藿所含淫羊藿苷進(jìn)行定量分析，尚無多組分含有量測定的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測定藤黃健骨膠囊中君藥熟地黃活性成分梓醇、地黃苷D、益母草苷，臣藥淫羊藿活性成分淫羊藿苷、寶藿苷I，佐藥雞血藤活性成分兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素的含有量，建立該制劑多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制模式，以期為全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

Dionex UltiMate3000 型高效液相色譜儀 （美國Thermo Fisher 公司）；BS110S 型電子分析天平（德國Sartorious 公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。兒茶素（批號(hào)110877-201604，純度99.2%）、表兒茶素（批號(hào)110878-201703，純度99.7%）、淫羊藿苷（批號(hào)110737-201516，純度94.2%）、寶藿苷I（批號(hào)111852-201603，純度99.9%） 對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；地黃苷D （批號(hào)14061708，純度98.8%） 對(duì)照品購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；梓醇（批號(hào)17071021，純度98.6%）、益母草苷（批號(hào)18052422，純度94.6%）、甘草素（批號(hào)18111522，純度99.4%）、美迪紫檀素（批號(hào)18040322，純度100.0%） 對(duì)照品均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。熟地黃、雞血藤、淫羊藿、鹿銜草、肉蓯蓉、炒萊菔子、燙骨碎補(bǔ)均購自廣西岑溪市安陽堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院陳海燕講師鑒定為正品，按2015 年版《中國藥典》 一部各藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合相關(guān)規(guī)定。藤黃健骨膠囊 （每粒裝0.25 g，批號(hào)181104、190105、190406） 購于甘肅省西峰制藥有限責(zé)任公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shim-pack GIST C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～10.0 min，5.0%A；10.0～25.0 min，5.0%～10.0% A；25.0～47.0 min，10.0% →39.0% A；47.0～63.0 min，39.0%～45.0%A；63.0～70.0 min，45.0%～5.0%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；0～25.0 min在210 nm 波長處檢測梓醇、地黃苷D、益母草苷［12-13］，25.0～47.0 min 在280 nm 波長處檢測兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素［14-15］，47.0～70.0 min 在270 nm 波長處檢測淫羊藿苷、寶藿苷I［1，10-11，16-17］；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷和寶藿苷I 對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.178、0.982、1.354、0.918、1.212、0.108、0.136、3.012、1.988 mg／mL 的貯備液，各精密量取2.5 mL，置于50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（含梓醇108.9 μg／mL、地黃苷D 49.1 μg／mL、益母草苷67.7 μg／mL、兒茶素45.9 μg／mL、表兒茶素60.6 μg／mL、甘草素5.4 μg／mL、美迪紫檀素6.8 μg／mL、淫羊藿苷150.6 μg／mL、寶藿苷I 99.4 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊20 粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)混勻后精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（300 W、40 kHz） 提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按膠囊處方比例和生產(chǎn)工藝，分別制備缺熟地黃、缺雞血藤、缺淫羊藿的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，色譜圖基線平穩(wěn)，各成分與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均不低于3 500，陰性無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6 個(gè)20 mL 量瓶中，甲醇制成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 峰面積RSD 分別為 0.77%、0.95%、0.78%、0.81%、0.99%、1.12%、1.06%、0.51%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 峰面積RSD 分別為1.02%、1.35%、1.20%、1.47%、1.19%、0.85%、1.79%、0.97%、1.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 峰面積RSD 分別為0.79%、0.96%、0.75%、0.86%、1.03%、1.11%、1.07%、0.53%、0.67%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 含有量已知 （1.478、0.656、0.894、0.536、0.722、0.058、0.072、2.124、1.198 mg／mL） 的膠囊內(nèi)容物9 份，每份1.0 g，置于具塞錐形瓶中，按照2015 年版《中國藥典》 規(guī)定加入對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 平均加樣回收率分別為99.71%、98.91%、99.26%、97.94%、98.32%、96.97%、96.95%、100.01%、98.96%，RSD 分別為 0.83%、0.96%、1.09%、1.45%、1.32%、0.99%、1.17%、0.76%、1.25%。

2.9 樣品含有量測定 取3 批膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg／粒， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／capsule， n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分篩選 藤黃健骨膠囊中熟地黃補(bǔ)血滋陰，益精填髓，為君藥，梓醇、益母草苷、地黃苷D 等環(huán)烯醚萜苷類為其主要活性成分；淫羊藿補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕，為臣藥，淫羊藿苷、寶藿苷I 等黃酮類為其主要活性成分；雞血藤活血補(bǔ)血，舒筋活絡(luò)，為佐藥，兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素等黃酮類為其主要活性成分。根據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，本實(shí)驗(yàn)選擇梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 作為指標(biāo)成分。

3.2 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)首先考察不同提取溶劑（甲醇［10，13，16］、50%甲醇［12］、乙醇、50%乙醇［1，11，15，17］） 對(duì)藤黃健骨膠囊中9 種成分綜合提取率的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇提取時(shí)最高，色譜圖中雜質(zhì)峰數(shù)量少。再考察不同提取方式（超聲提取法［1，10-14］、回流提取法［15］、索氏提取法），發(fā)現(xiàn)各成分綜合提取率差異不大，考慮到制備便捷性和結(jié)果準(zhǔn)確性，采用超聲提取。最后考察不同提取時(shí)間（30、60、90 min）。最終確定，供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。

3.3 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)考察乙腈-水［1，10-12，16-17］、乙腈-0.2%磷酸［13-14］、乙腈-0.1%甲酸［15］流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.2%磷酸洗脫時(shí)色譜峰分離度較好，基線平穩(wěn)，故選擇其作為流動(dòng)相。進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化，最終確定為“2.1”項(xiàng)下梯度洗脫程序。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC 法同時(shí)測定藤黃健骨膠囊中梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 的含有量，再按照2015 年版《中國藥典》 四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。