李睿文,白 云,徐瑞濤,白雪峰

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,河北保定071000 ； 2.河北省豐寧滿族自治縣農(nóng)牧局大閣區(qū)域站,河北豐寧068350)

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)感染引起的急性病毒性疾病，主要通過糞-口途徑傳播。戊型肝炎病毒，為肝炎病毒屬肝炎病毒科(Genus Hepevirus in the family Hepeviridae)，并且是本科中唯一成員[1]。世界上首次記載的戊型肝炎，于1955年12月-1956 年1月暴發(fā)流行于印度新德里，暴發(fā)的原因由于飲用水被糞便污染而引起的，共計發(fā)病97 000例，其中29 000例為黃疸型肝炎[2]。迄今為止，戊型肝炎在全世界范圍內(nèi)均有發(fā)病報道，其暴發(fā)或流行主要集中在亞洲、非洲的一些發(fā)展中國家，特別在一些貧窮落后、衛(wèi)生習(xí)慣較差的地區(qū)。

圖1 屠宰豬肝臟HEV陽性染色結(jié)果(免疫組化，40×)
Fig.1 HEV positive staining of slaughtered pig liver(Immunohistochemistry, 40×)
白色箭頭：陽性信號 White arrow: Positive signal

圖2 屠宰豬肝臟HEV陰性染色結(jié)果(免疫組化，20×)
Fig.2 HEV negative staining of
slaughtered pig liver(Immunohistochemistry, 20×)

圖3 屠宰豬HEV陽性肝臟病理變化(H.E.染色，20×)
Fig.3 Pathological changes of HEV positive liver inslaughtered pigs(H.E. staining, 20 ×)

圖4 屠宰豬HEV陽性肝臟病理變化(Mallory三色染色，40×)
Fig.4 Pathological changes of HEV positive liver inslaughtered pigs(Mallory staining, 40 ×)

在美國、加拿大、英國、法國、荷蘭、德國、意大利及日本、韓國等國家均有戊型肝炎散發(fā)病例的報道[3-4]。過去認(rèn)為主要疫源地為亞非拉等發(fā)展中國家，在歐美等發(fā)達(dá)國家僅有散發(fā)病例，主要是由于患者到疫源地旅行感染所致，但有證據(jù)表明，在發(fā)達(dá)國家中也存在沒有到過HE疫源地而自發(fā)的病例，而且呈逐年遞增趨勢。

自1997年Meng等發(fā)現(xiàn)豬HEV以后，很多研究資料已證實豬是HEV重要的天然動物宿主，而且在HE的傳播過程中起著重要的媒介作用[5]?，F(xiàn)已證實HEV可在人、豬間進(jìn)行種間傳播。很多國家如日本、韓國、中國、蒙古、阿根廷、加拿大、英國、法國、荷蘭、印度尼西亞、意大利、丹麥等均有豬感染HEV的報道，廣泛存在HEV自然感染現(xiàn)象，且呈全球性分布。我國為戊型肝炎高流行區(qū)，豬群中HEV抗體陽性率較高，而且不斷有HEV毒株被鑒定[6]。

我國是傳統(tǒng)養(yǎng)豬大國，但養(yǎng)殖規(guī)模較小，散養(yǎng)戶居多，因此豬養(yǎng)殖環(huán)境不易控制。再者，豬肉是我國漢族大多數(shù)人比較喜歡的動物性食品之一。因此，豬的健康狀況如何直接關(guān)系到人類的食品安全，同時豬HEV的感染可能通過豬肉制品傳播給人類。因此應(yīng)加強(qiáng)對豬群中 HEV流行的監(jiān)測。我國多個地方已報道豬HEV血清學(xué)、分子病毒學(xué)的調(diào)查結(jié)果，但河北地區(qū)豬戊型肝炎流行狀況資料較少。

1 材料與方法

1.1 豬肝臟的來源 從河北部分地區(qū)的屠宰場隨機(jī)采集55份屠宰豬肝臟樣品，多聚甲醛-戊二醛混合固定液中固定備用。

1.2 試劑 兔抗人HEV多克隆抗體(一抗)、SP免疫組化染色試劑盒，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。試劑盒中試劑為3%H2O2去離子水；封閉用正常山羊血清工作液；生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液。顯色劑DAB為美國ZYMED公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 病理組織切片制作和免疫組織化學(xué)染色 按常規(guī)石蠟切片制作技術(shù)制作連續(xù)切片, 分別進(jìn)行HEV 免疫組織化學(xué)染色、蘇木素-伊紅(H.E.)染色及Mallory三色染色法。H.E.染色和Mallory三色染色法按常規(guī)方法進(jìn)行, 免疫組織化學(xué)染色方法按試劑操作說明書進(jìn)行。陰性染色對照不加一抗。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定 在光學(xué)顯微鏡下, HEV 免疫組織化學(xué)染色陽性反應(yīng)信號為棕紅色或棕黃色團(tuán)塊狀或顆粒狀。

1.3.3 Mallory三色染色法結(jié)果判定方法 在光學(xué)顯微鏡下，膠原組織和網(wǎng)狀纖維呈藍(lán)色，淀粉樣物質(zhì)呈淡藍(lán)色，酸性顆粒呈紅色，紅細(xì)胞呈桔紅色。

2 結(jié)果

2.1 屠宰豬肝臟中HEV抗原(HEV-Ag)免疫組化檢測 在被檢的55例屠宰豬肝臟中，檢出戊肝病毒抗原陽性有52例，占被檢樣品總數(shù)的94.55%；其中陰性3例，占被檢測樣品的5.45%(見表1)。結(jié)果表明，河北省部分地區(qū)豬HEV感染比較嚴(yán)重。

2.2 屠宰豬肝臟中HEV-Ag定位 肝被膜附近的肝組織中，HEV-Ag陽性反應(yīng)信號常散在分布，而且常常僅見肝細(xì)胞核呈明顯的陽性反應(yīng)，胞漿多呈陰性反應(yīng)(見中插彩版圖1)。遠(yuǎn)離被膜的肝組織，陽性反應(yīng)信號常成片分布，胞漿多呈陽性反應(yīng)，而胞核卻較少呈陽性反應(yīng)。有時，在一個雙核的肝細(xì)胞內(nèi)?？梢娨粋€核呈陽性反應(yīng)，另一個呈陰性反應(yīng)。在肝小葉的周邊區(qū)，陽性反應(yīng)信號常散在分布，且常出現(xiàn)于核內(nèi)間質(zhì)淋巴細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。匯管區(qū)的小葉間動脈和靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞及小葉間膽管的上皮細(xì)胞均呈陽性反應(yīng)。而HEV-Ag陰性樣品不出現(xiàn)棕紅色或棕黃色團(tuán)塊狀或顆粒狀物質(zhì)(見中插彩版圖2)。

表1 屠宰豬肝臟中HEV-Ag免疫組化檢測結(jié)果Table 1 Results of immunohistochemical detection of HEV-Ag in liver of slanghtered pigs

2.3 免疫組化陽性屠宰豬肝臟的H.E.染色觀察 光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HEV陽性肝臟組織均有不同程度的病理變化。其病變主要為肝細(xì)胞變性萎縮，散在單個核固縮性壞死，淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤、匯管區(qū)膽管增生，纖維結(jié)締組織增生等變化(見中插彩版圖3)。免疫組化陰性屠宰豬肝臟病理變化不明顯。

2.4 免疫組化陽性屠宰豬肝臟的Mallory三色染色觀察 Mallory三色染色法染色結(jié)果表明，在免疫組化陽性的屠宰豬肝臟中，鏡檢發(fā)現(xiàn)29.1%的肝組織中纖維結(jié)締組織增生(見中插彩版圖4)。而免疫組化陰性屠宰豬肝臟中纖維結(jié)締組織增生不明顯。

3 討論

人戊型肝炎是一種對人類危害性較大的疾病。在醫(yī)學(xué)臨床上，肝臟中HEV抗原的存在，是診斷戊型肝炎的重要依據(jù)[7]。免疫組化染色作為一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)，在病理診斷上的作用日趨重要。免疫組化染色反應(yīng)的基本原理是抗原抗體的反應(yīng)，是通過對針對樣品中相應(yīng)抗原的抗體上標(biāo)記某種發(fā)色劑或酶類，再通過激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標(biāo)本中抗原抗體反應(yīng)的部位產(chǎn)生肉眼可觀察到的顏色，以確定所要檢測的抗原是否存在。通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下即可檢測到所要研究的蛋白類物質(zhì)的存在與否。免疫組化染色具有陽性率高，敏感性強(qiáng)，背景清晰，試劑商品化，使用方便等特點(diǎn)，也是診斷戊型肝炎常用的方法之一。本試驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測屠宰豬肝臟中戊型肝炎病毒抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，55例屠宰豬肝臟中HEV抗原陽性率為94.55%；其中陰性3例，占被檢測樣品的5.45%；弱陽性20例，占被檢測樣品的36.36%；陽性27例，占被檢測樣品的49.09%；強(qiáng)陽性5例，占被檢測樣品的9.09%。結(jié)果表明，在河北部分地區(qū)日常生活中食用的屠宰豬群中HEV的感染是非常普遍的，而且感染率也很高。此外，本試驗結(jié)果還表明，HEV免疫組化陽性屠宰豬肝臟中均表現(xiàn)出較為明顯的肝炎病變。主要表現(xiàn)為肝實質(zhì)損傷病變，即肝細(xì)胞變性、壞死，同時伴有炎性細(xì)胞浸潤；間質(zhì)出現(xiàn)了結(jié)締組織不同程度增生和炎性細(xì)胞浸潤。在HEV免疫組化陽性肝臟中，肝臟病變主要為淋巴細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞變性、壞死、匯管區(qū)膽管增生、纖維結(jié)締組織增生。從本試驗結(jié)果中HEV抗原陽性屠宰豬肝臟的組織病理學(xué)變化情況來看，其病理變化與人戊型肝炎的病理變化相似[8]。反映了當(dāng)前河北部分地區(qū)屠宰豬戊型肝炎感染方面存在著比較嚴(yán)重的問題。本試驗結(jié)果表明，目前河北部分地區(qū)屠宰豬肝臟存在有戊型肝炎的感染痕跡，并且病變情況與戊型肝炎病毒感染相似，這個結(jié)果與以往報道相符合。目前可以證實河北部分地區(qū)屠宰豬的肝臟中存在與戊型肝炎病毒相關(guān)的抗原。

本試驗中檢測的免疫組化陽性屠宰豬肝臟樣品中，29.1%的肝臟組織學(xué)都有不同程度的纖維化，表明戊型肝炎病毒可引起豬慢性肝炎，呈現(xiàn)明顯纖維化，為進(jìn)一步研究戊型肝炎致病機(jī)理提供了流行病學(xué)資料。