俞 燕，周 生，李建梅，高明燕，程 旭，姜 逸，趙秀美，徐 步

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125）

禽白血病是垂直傳播性疾病，控制該病最有效的措施是對(duì)雞群進(jìn)行種源凈化。主要通過對(duì)種雞核心群定期進(jìn)行外源性禽白血病病毒（Avian leukosis vi?rus，ALV）檢測，及時(shí)淘汰陽性雞，建立無外源性ALV 感染的種雞群。因此，高效、快速、便捷的檢測方法有助于控制ALV 的傳播。國內(nèi)外對(duì)ALV 的檢測和鑒定方法主要有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）及基于PCR 的分子生物學(xué)檢測技術(shù)等[1-5]。病毒分離方法最可靠，但檢測周期長，需要結(jié)合其它方法才能鑒定亞群。群特異性抗原ELISA 檢測方法在我國臨床上應(yīng)用最廣，操作相對(duì)簡便，有商品化試劑盒可以使用，但不能區(qū)分內(nèi)源性和外源性ALV。IFA 比較直觀，但需要用到特異性單克隆抗體。針對(duì)ALV 的PCR 方法已有報(bào)道，但多為鑒定一種亞群的單一PCR 或熒光定量PCR[6-8]。多重PCR 可在同一體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因，節(jié)省時(shí)間和成本，檢測效率顯著高于單一PCR。已有報(bào)道建立了針對(duì)ALV-A、ALV-B 和ALV-J 的多重PCR 方法[9-10]，但對(duì)于目前新鑒定且在黃羽肉雞和地方品種雞中廣泛流行的ALV-K 并未涉及。鑒于此，本研究擬建立一種能同時(shí)檢測主要流行亞群ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 的多重PCR 方法，為禽白血病流行病學(xué)調(diào)查及外源性ALV初步鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料ALV-A 分離株JS15AJH03、ALV-B 分離株JS15BJ01、ALV-J 分離株JS15YXB01和ALV-K 分離株JS17LK01 均為本實(shí)驗(yàn)室在開展禽白血病凈化中分離所得，并經(jīng)env 基因測序鑒定。對(duì)內(nèi)源性ALV 有抵抗力的雞成纖維細(xì)胞系DF-1，為本實(shí)驗(yàn)室傳代并保存。

H9 亞型禽流感病毒（AIV）cDNA、新城疫病毒（NDV）cDNA、馬立克氏病病毒（MDV）DNA、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）cDNA、傳染性支氣管炎病毒（IBV）cDNA 及禽呼腸孤病毒（ARV）cDNA 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。臨床樣品，包括表觀健康雞抗凝血樣品及病死雞肝、脾、腎等腫瘤組織樣品，均來自于開展禽白血病凈化的地方品種雞。

Premix ExTaq DNA 聚合酶、pMD19-T 載體、JM109 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、 DNAiso Reagent、RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購自寶生物工程（大連）有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；ALV 抗原檢測試劑盒購自IDEXX 公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成參考Gao[10]建立的檢測ALV-A、ALV-B 和ALV-J 多重PCR 方法，根據(jù)Gen?Bank 登錄及本實(shí)驗(yàn)室測序驗(yàn)證的ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 病毒株基因序列設(shè)計(jì)多重PCR 引物組：在pol 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用上游引物PF；在gp85 基因設(shè)計(jì)亞群特異性下游引物：ALV-A 下游引物AR、ALV-B 下游引物BR、ALV-J 下游引物JR 及ALV-K 下游引物KR（表1）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病毒分離與檢測采集無菌抗凝血樣品，離心分離血漿備用；肝、脾、腎等腫瘤組織樣品用含青鏈霉素的滅菌PBS 研磨后離心，取上清經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后取濾液；上述樣品各取100 μL，接種DF-1 細(xì)胞，5%CO237 ℃孵育2 h 后，棄去培養(yǎng)基，用含1%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基維持培養(yǎng)7 d后，-20 ℃反復(fù)凍融2 次，收集細(xì)胞上清利用ALV抗原檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

表1 引物序列及相關(guān)信息Table 1 Primer sequences and relative information

1.4 病毒RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄無菌抗凝血樣品離心后取血漿和白細(xì)胞層；病料組織樣品研磨后，離心取上清，上述樣品各取200 μL 利用RNAiso Plus 提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品的構(gòu)建與鑒定將ALV 分離株JS15AJH03、JS15BJ01、JS15YXB01 和JS17LK01 感染后的DF-1 細(xì)胞分別利用DNAiso Reagent 提取各病毒株前病毒DNA 為模板，分別以PF/AR、PF/BR、PF/JR、PF/KR 為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃1 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min；4 ℃保存。膠回收PCR 產(chǎn)物，分別連接pMD19-T 載體并轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)的菌液在氨芐抗性LB 固體平皿上劃線接種，過夜培養(yǎng)。每個(gè)平皿各選3 個(gè)陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。經(jīng)測序驗(yàn)證的陽性克隆用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，分別命名為pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K，采用Eppendorf 6131核酸蛋白檢測儀測定濃度，并計(jì)算拷貝數(shù)。

1.6 多重PCR 方法的建立

1.6.1 多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化將構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 等比例混合，稀釋至混合物中各質(zhì)粒濃度為2.5×106拷貝/μL，以此作為模板，以PF/AR、PF/BR、PF/JR、PF/KR 為引物，采用方陣法進(jìn)行多重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化：包括各引物濃度（0.8 μmol/L、0.6 μmol/L、0.4 μmol/L、0.3 μmol/L、0.2 μmol/L、0.15 μmol/L、0.1 μmol/L、0.075 μmol/L、0.05 μmol/L、0.0375 μmol/L、0.025 μmol/L、0.05 μmol/L）、退火溫度（50.0 ℃、50.7 ℃、51.8 ℃、53.6 ℃、55.7 ℃、57.8℃、59.9 ℃、61.9 ℃、64.1 ℃、65.8 ℃、67.1 ℃、68.0 ℃）、循環(huán)數(shù)（20、25、30、35、40）等，以確定多重PCR 的最佳反應(yīng)條件。

1.6.2 多重PCR特異性試驗(yàn)分別將ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 分 離 株JS15AJH03、 JS15BJ01、JS15YXB01 和JS17LK01 前病毒DNA 稀釋至10 ng/μL，以單獨(dú)及混合物作為模板；同時(shí)以實(shí)驗(yàn)室保存的H9亞型AIV cDNA、NDV cDNA、MDV DNA、REV cD?NA、IBV cDNA 及ARV cDNA 作為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行多重PCR 檢測，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.6.3 多重PCR 敏感性試驗(yàn)分別將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì) 粒pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 單 獨(dú)及混合后做10 倍倍比稀釋至各質(zhì)粒濃度為1×109～1×100拷貝/μL，以優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行單模板單重PCR 和混合模板多重PCR 檢測，驗(yàn)證該方法的敏感性。

1.6.4 多重PCR 重復(fù)性試驗(yàn)采用優(yōu)化的反應(yīng)條件，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 的三個(gè)濃度混合模板（1×106拷貝/μL、1×105拷貝/μL、1×104拷貝/μL）進(jìn)行多重PCR 檢測，每個(gè)濃度模板設(shè)3 個(gè)重復(fù)，以驗(yàn)證該方法的批內(nèi)重復(fù)性；并在不同時(shí)間對(duì)上述三個(gè)濃度質(zhì)粒模板進(jìn)行4 次重復(fù)檢測，以驗(yàn)證該方法的批間重復(fù)性。

1.6.5 多重PCR 與病毒分離檢測方法比較將采集的96 份表觀健康雞抗凝血樣品及21 份腫瘤組織樣品按1.3 方法進(jìn)行病毒分離檢測；同時(shí)以1.4 方法制備病毒cDNA，并用建立的多重PCR 方法進(jìn)行檢測，比較兩種方法的檢測結(jié)果；將陽性樣本利用可擴(kuò)增env 基因全長的ALV 通用引物Env-F：5'-CGA GAGTGGCTCGCGAGATGG-3'/Env-R：5'-ACTACATT TCCCCCTCCCTAT-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和亞群鑒定。

1.7 多重PCR 檢測方法臨床應(yīng)用對(duì)2012 年～2017年收集的119 份經(jīng)病毒分離、ALV 抗原ELISA 檢測為陽性的樣品，包括101 份血漿及18 份肝、脾、腎等腫瘤組織樣品，按1.5 方法提取前病毒DNA，采用本實(shí)驗(yàn)建立的ALV 多重PCR 方法對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測，以了解我國地方品種雞群禽白血病流行情況及感染類型。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品的構(gòu)建分別以各ALV 分離株前病毒DNA 為模板，以PF/AR、PF/BR、PF/JR、PF/KR 為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，分離株JS15AJH03、JS15BJ01、JS15YXB01 和JS17LK01 分別在567 bp、417 bp、195 bp 和742 bp 處出現(xiàn)各目的條帶，均與預(yù)期大小相符（圖1）。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示，陽性克隆目的序列與親本病毒株完全一致，表 明 重 組 質(zhì) 粒pMD19A、 pMD19B、 pMD19J 和pMD19K 構(gòu)建正確。經(jīng)計(jì)算，各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為4.2×1010拷貝/μL、4.9×1010拷貝/μL、5.0×1010拷貝/μL、4.7×1010拷貝/μL，將其分別稀釋至1×1010拷貝/μL。

圖1 各ALV 分離株P(guān)CR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of ALV-A,ALV-B,ALV-J and ALV-K

2.2 多重PCR 檢測方法的優(yōu)化與建立以構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K作為模板，PF/AR、PF/BR、PF/JR、PF/KR 為引物，對(duì)多重PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，PF為0.2 μmol/L，AR、BR、JR、KR為0.1 μmol/L，退火溫度為56.0 ℃，30 個(gè)循環(huán)時(shí)，擴(kuò)增效果最佳；對(duì)ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K 單一及各組合模式下的質(zhì)粒模板均能擴(kuò)增出目的條帶（圖2）。表明優(yōu)化和建立的多重PCR 方法能有效檢測ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K。

2.3 多重PCR 的特異性試驗(yàn)結(jié)果使用優(yōu)化的多重PCR 反應(yīng)條件，對(duì)各ALV 分離株前病毒DNA 模板，以及AIV、NDV、MDV、REV、IBV、ARV 的DNA 或cDNA 模板進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，多重PCR 方法對(duì)ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K 單模板及混合模板均能擴(kuò)增出目的條帶；而對(duì)AIV、NDV、MDV、REV、IBV 及ARV 模板均未擴(kuò)增出特異性條帶（圖3）。表明所建立的多重PCR方法特異性強(qiáng)。

圖2 多重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of reaction conditions of multiple PCR

圖3 多重PCR 特異性的檢測結(jié)果Fig.3 Specificity of multiplex PCR

2.4 多重PCR 的敏感性試驗(yàn)結(jié)果分別使用常規(guī)PCR 和多重PCR 方法，對(duì)梯度稀釋的pMD19A、pMD19B、pMD19J、pMD19K 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和混合質(zhì)粒進(jìn)行敏感性檢測。結(jié)果顯示，常規(guī)PCR 對(duì)pMD19K、pMD19A、pMD19B、pMD19J 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢出下限均為1×103拷貝/μL；多重PCR 對(duì)其混合質(zhì)粒的檢出下限也為1×103拷貝/μL（圖4）。表明所建立的多重PCR 方法具有較高的敏感性。

2.5 多重PCR 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果使用優(yōu)化的多重PCR 反應(yīng)條件，對(duì)pMD19A、pMD19B、pMD19J、pMD19K 3 個(gè)濃度混合質(zhì)粒模板分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，每個(gè)濃度模板批內(nèi)3 個(gè)重復(fù)檢測（圖5A）和批間4 次重復(fù)檢測（圖5B），均能擴(kuò)增出與目的片段大小一致的條帶，且同一濃度模板重復(fù)結(jié)果較為一致。表明所建立的多重PCR 方法具有良好的重復(fù)性。

圖4 多重PCR 敏感性的檢測結(jié)果Fig.4 Sensitivity of multiplex PCR

圖5 多重PCR 重復(fù)性的檢測結(jié)果Fig.5 Repeatability of multiplex PCR

2.6 兩種檢測方法的比較結(jié)果對(duì)采集的117 份臨床樣品同時(shí)進(jìn)行病毒分離和多重PCR 檢測。結(jié)果顯示，多重PCR 共檢出39 份陽性樣品，陽性率33.3%；病毒分離檢測出38 份陽性樣品，陽性率32.5%，二者符合率99.1%。其中，對(duì)血漿樣品的檢測，兩種方法符合率100%；但對(duì)組織樣品的檢測，有1 份病毒分離為陰性的樣品，多重PCR 檢測為ALV-K 感染（表2）。陽性樣品的測序結(jié)果與多重PCR 檢測結(jié)果完全相符。表明所建立的多重PCR 方法具有較高的臨床檢測能力。

2.7 多重PCR 檢測方法的臨床應(yīng)用結(jié)果使用本研究建立的多重PCR 方法對(duì)病毒分離檢測為陽性的101 份血漿樣品和18 份腫瘤組織樣品前病毒DNA 進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，所有樣品，單一感染ALV-J 檢出率最高，達(dá)43.7%；新發(fā)現(xiàn)的ALV-K 檢出率為17.6%，顯 著 高 于 經(jīng) 典 的ALV-A 和ALV-B 檢 出 率1.7%、4.2%；存在ALV-B+J、ALV-J+K 的二重感染，檢出率分別為2.5%、21.0%；以及ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K 的三重感染，檢出率分別為1.7%、5.0%、2.5%（表3）。結(jié)果表明，ALV在地方品種雞感染具有多樣性與復(fù)雜性，ALV-J 仍為主要流行亞群。

病毒株來源上，分離自病料組織的絕大部分病毒株為ALV-J，占44.4%；ALV-J+K 二重感染居其次，為27.8%；ALV-K 的單重感染率為16.7%；同時(shí)存在ALV-A 的單重感染和ALV-A+B+J 的三重感染，各占5.6%（表3）。其它病毒株均來源于表觀健康雞血漿樣品，具有與病料組織同樣的感染趨勢，但感染類型更為復(fù)雜多樣。結(jié)果表明，對(duì)地方品種雞致病性最強(qiáng)的仍為ALV-J，但同時(shí)不能忽視ALV-K 的影響。

不同雞種間，ALV-J 檢出率最高，達(dá)95.8%（23/24）；ALV-K 其 次，為70.8%（17/24）；ALV-A 和ALV-B 檢出率均為25.0%（6/24）。結(jié)果表明，ALV-J和ALV-K 在地方品種雞中感染具有普遍性。

表2 多重PCR 與病毒分離檢測比較結(jié)果Table 2 Comparison of multiplex PCR and virus isolation

表3 多重PCR 對(duì)血漿和組織樣品檢測結(jié)果Table 3 Detection of plasma and tissue samples by multiplex PCR

3 討 論

禽白血病是由ALV 引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，對(duì)雞具有致病性的主要為外源性ALV。通過筆者前期及其他學(xué)者流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國雞群中流行的外源性ALV 主要為ALV-J、ALV-A、ALV-B，以及地方品種雞群中的ALV-K[11-13]。國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種ALV 檢測方法，包括病原學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測技術(shù)，每種方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用性。本研究針對(duì)目前我國雞群中流行的主要外源性ALV，首次建立了檢測ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 的多重PCR 方法，能夠有效鑒別ALV 單一或多重感染，比常規(guī)PCR 更為簡便、快捷，極大地提高了檢測效率。

目的基因的選擇與引物設(shè)計(jì)是PCR 方法成敗的關(guān)鍵。為盡量減少多重PCR 引物間的相互干擾，本研究參考Gao[10]引物設(shè)計(jì)方法，根據(jù)不同亞群ALV基因組特征，在ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K的pol 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)一條通用上游引物，在gp85 基因分別設(shè)計(jì)4 條亞群特異性下游引物，能擴(kuò)增出567 bp、417 bp、195 bp 和742 bp 電泳時(shí)可有效區(qū)分的目的條帶。使用該引物組建立的多重PCR，對(duì)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 檢測效果良好，能擴(kuò)增出ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K 單一、二重、三重、四重混合模板的目的條帶，而與AIV、NDV、MDV、REV、IBV、ARV 等禽類常見病毒無特異性反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了引物設(shè)計(jì)的有效性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的多重PCR 對(duì)pMD19A、pMD19B、pMD19J 和pMD19K 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品的檢測，四重混合模板檢測下限為1×103拷貝/μL，與單重PCR 敏感性相當(dāng)，且與其它研究報(bào)道的ALV PCR 方法敏感性在同一水平[9-10]。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果亦表明，所建立的多重PCR方法具有良好的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

ALV 病毒分離檢測只能檢出具有一定量活病毒的樣品，對(duì)樣品的采集、運(yùn)輸和保存要求較高，且檢測過程需要7 d～9 d，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。多重PCR 能直接從病料DNA 或cDNA 樣品檢出ALV，大大提高了檢測效率[9-10]。本研究結(jié)果亦表明，所建立的多重PCR方法對(duì)臨床樣品的檢測，與病毒分離法相比，檢出率更高，這可能與組織樣品經(jīng)凍融后病毒失活有關(guān)，也可能與ALV-K 的低復(fù)制效率相關(guān)。使用分子生物學(xué)檢測技術(shù)對(duì)ALV 亞群進(jìn)行鑒定，通常使用env 基因通用引物擴(kuò)增并測序，將gp85 基因與參考株進(jìn)行比對(duì)分析，以鑒定亞群[14-15]。將本研究多重PCR 檢測結(jié)果與分離株env 基因測序亞群鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)單重感染env 基因測序結(jié)果與多重PCR 結(jié)果完全一致；但多重感染，env 基因測序需要篩選更多的陽性克隆進(jìn)行測序，才能鑒定出所有亞群。因此，在測序數(shù)量有限的情況下，多重PCR 比env 基因測序?qū)喨鸿b定更具優(yōu)勢。本研究建立的多重PCR 目的亞群為ALV-A、ALV-B、ALV-J 和ALV-K，并不能檢出其它亞群ALV，這也是該方法的局限，后續(xù)可在反應(yīng)體系中增加針對(duì)其它亞群的特異性引物以擴(kuò)大檢測范圍。

從建立的多重PCR 對(duì)24 個(gè)雞種的陽性樣品檢測結(jié)果看，地方品種雞禽白血病感染類型復(fù)雜、多樣，ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K 單重感染占陽性樣本的67.2%，并存在ALV-B+J、ALV-J+K 的二重感染，及ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K 的三重感染。盡管過去也有禽白血病多重感染的報(bào)道[10,16]，但如此多感染類型同時(shí)存在地方品種雞還是首次發(fā)現(xiàn)。不同亞群ALV 在同一雞體內(nèi)共感染，很可能造成病毒間的基因重組，使毒株致病性增強(qiáng)甚至產(chǎn)生新亞群[17]，進(jìn)而威脅到種質(zhì)資源安全，這一潛在風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)引起重視。從檢出率來看，不管是表觀健康雞血漿樣品還是病料組織樣品，ALV-J 檢出率最高，其次為ALV-J+K 二重感染，再次為ALV-K。因此，對(duì)地方品種雞致病性最強(qiáng)、危害最為嚴(yán)重的仍為ALV-J，這與陳靜[12]、李陽[13]等調(diào)查結(jié)果一致，但也不能忽視ALV-K 的影響。本研究中，24 個(gè)雞種有23 個(gè)檢測到了ALV-J，17 個(gè)檢測到了ALV-K，顯著高于ALV-A 和ALV-B 檢出率。ALV-K 已成為除ALV-J 外，對(duì)地方品種雞威脅最大的一個(gè)亞群。ALV-K 致病性如何、其存在是否會(huì)協(xié)同ALV-J 致病有待研究。同時(shí)，還應(yīng)加快實(shí)施對(duì)我國地方品種雞的外源性ALV 凈化，以保護(hù)我國豐富的種質(zhì)資源。