姜建萍，袁 翔，邱慶慶，黃光華，楊秀榮，蔣和生，楊學(xué)明*，蔣欽楊*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021)

【研究意義】羅氏沼蝦在我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)主導(dǎo)地位，但存在規(guī)格不均勻、個(gè)體小型化及產(chǎn)量低等問(wèn)題，嚴(yán)重制約羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而亟需選育羅氏沼蝦優(yōu)良新品種[1]。胰蛋白酶(TRY)基因是重要的生長(zhǎng)性狀候選基因，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，挖掘水產(chǎn)動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因，探索其生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，將常規(guī)育種與分子育種有效地結(jié)合起來(lái)，對(duì)提高水產(chǎn)動(dòng)物數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的準(zhǔn)確性及加速育種進(jìn)程至關(guān)重要[2-3]。因此，開展羅氏沼蝦TRY基因生物信息學(xué)分析及其mRNA表達(dá)情況研究，對(duì)深入探究TRY基因生物學(xué)功能和提高羅氏沼蝦產(chǎn)量具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】TRY是動(dòng)物體內(nèi)的主要消化酶類，主要通過(guò)組氨酸殘基、天冬氨酸殘基和絲氨酸殘基組成的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)發(fā)揮消化作用[3]。已有研究表明，羅非魚[5]、鱖魚[6]、烏鱧[7]及斑節(jié)對(duì)蝦[8]、中國(guó)對(duì)蝦、克式原螯蝦和日本對(duì)蝦[9]等多種水產(chǎn)動(dòng)物的TRY基因已被克隆獲得，且眾多學(xué)者對(duì)克隆獲得的TRY基因相繼開展了生物信息學(xué)分析，主要包括氨基酸序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析、同源性分析、編碼蛋白理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等[10-13]。關(guān)于TRY基因mRNA表達(dá)在水產(chǎn)動(dòng)物方面的研究，李運(yùn)東[8]發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對(duì)蝦TRY基因在肝胰腺組織中顯著高表達(dá)，且在整個(gè)生長(zhǎng)階段均有表達(dá)，但存在不同的表達(dá)模式和表達(dá)規(guī)律；馬誠(chéng)[11]研究認(rèn)為瓦氏黃顙魚TRY基因在其胰臟中表達(dá)最高，在肝臟中次之；李運(yùn)東[8]研究發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦TRY基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)與頭胸甲長(zhǎng)、頭胸甲寬、第一腹節(jié)長(zhǎng)和第二腹節(jié)長(zhǎng)呈顯著相關(guān)；Klein等[14-15]研究表明，TRY基因在凡納濱對(duì)蝦蛻皮過(guò)程中發(fā)揮重要作用?？梢?，TRY基因是重要的生長(zhǎng)性狀候選基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)羅氏沼蝦TRY基因生物信息學(xué)分析及其TRY基因mRNA表達(dá)的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于候選基因法，結(jié)合NCBI已公布的EST序列分析TRY基因生物學(xué)信息及其mRNA表達(dá)情況，為深入揭示TRY基因?qū)α_氏沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以廣西南寧國(guó)家級(jí)羅氏沼蝦良種場(chǎng)5月齡羅氏沼蝦為試驗(yàn)材料(n=14，雌雄各半)，采集其腹部神經(jīng)、胃、心臟、鰓、性腺、肝胰腺、肌肉和腸道共8個(gè)組織樣品，以及生長(zhǎng)快速家系(FG)和生長(zhǎng)慢速家系(SG)中體重和體長(zhǎng)極端性狀的雌性羅氏沼蝦肌肉組織，分別置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

TRY基因mRNA表達(dá)所用試劑：TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Premix ExTaqTMⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；TaqPCR MasterMix購(gòu)自Vazyme公司。

TRY基因生物信息學(xué)分析所用軟件：同源性比分析對(duì)使用MegAlign，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析使用Lasergene v8.0，蛋白理化性質(zhì)分析使用Expasy-ProParam，親/疏水性預(yù)測(cè)分析使用ExPASy-ProtScale，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析使用MLRC。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照TaKaRa公司的TRIzol試劑盒操作流程提取樣品總RNA，RNA濃度及其完整性分別采用微量分光光度計(jì)Nanodrop 2000和1.0 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析候選基因mRNA表達(dá)

根據(jù)GenBank已公布的羅氏沼蝦TRYEST序列，利用Primer 3.0和Oligo 7.0設(shè)計(jì)引物，以18S rRNA基因作為內(nèi)參，引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μl：Premix ExTaqTMII 10.0 μl，cDNA 5.0 μl，上/下游引物各0.5 μl，RNase Free ddH2O 4.0 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 羅氏沼蝦TRY基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1TRY基因同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 根據(jù)NCBI已公布的EST序列可知，羅氏沼蝦TRY基因編碼266個(gè)氨基酸。同源性比較結(jié)果(圖1)顯示，羅氏沼蝦TRY氨基酸序列與刀額新對(duì)蝦(Metapenaeusensis)TRY氨基酸序列的同源性最高，與三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)TRY氨基酸序列的同源性最低。利用Lasergene v8.0構(gòu)建羅氏沼蝦(AMQ98968.1)、凡納濱對(duì)蝦(AEZ68613.1)、中國(guó)對(duì)蝦(ACQ45454.1)、脊尾白蝦(ABQ02534.1)、眼斑龍蝦(ADB66713.1)、中華絨螯蟹(AKN46052.1)、三疣梭子蟹(AHJ81099.1)、刀額新對(duì)蝦(ABQ02531.1)和擬穴青蟹(AGO02163.1)的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果(圖2)顯示，羅氏沼蝦和刀額新對(duì)蝦的遺傳距離最近，與凡納濱對(duì)蝦的遺傳距離最遠(yuǎn)，說(shuō)明羅氏沼蝦與刀額新對(duì)蝦的親緣關(guān)系最近，與凡納濱對(duì)蝦的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖1 羅氏沼蝦TRY氨基酸序列與其他水產(chǎn)動(dòng)物TRY氨基酸序列的同源比對(duì)分析結(jié)果

圖2 基于TRY蛋白氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.1.2 TRY蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 經(jīng)ProtParam在線預(yù)測(cè)分析得知羅氏沼蝦TRY蛋白的分子量為28.54 kD，理論等電點(diǎn)為4.44；甘氨酸(Gly)含量較高，占總氨基酸含量的11.7 %；帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)為32個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)為12個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為27.62，脂肪數(shù)為81.39，親水性平均值為0.027。羅氏沼蝦TRY蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)分析結(jié)果如圖3所示，TRY蛋白具有一定的疏水性。TRY蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，羅氏沼蝦TRY蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占17.67 %，延伸鏈占21.05 %，無(wú)規(guī)則卷曲占61.28 %。

圖3 羅氏沼蝦TRY蛋白的親/疏水性預(yù)測(cè)分析結(jié)果

2.2 TRY基因的mRNA表達(dá)分析

2.2.1TRY基因的組織表達(dá)譜分析 從圖4可看出，TRY基因在雄性羅氏沼蝦組織中的表達(dá)量以肝胰腺最高，其次為胃、心臟、腸道、腹節(jié)神經(jīng)、鰓、精巢和肌肉；在雌性羅氏沼蝦組織中的表達(dá)量也以肝胰腺最高，其次為腸道、卵巢、胃、腹節(jié)神經(jīng)、心、肌肉和鰓。其中，在雄性個(gè)體胃、心臟和肝胰腺中的表達(dá)量極顯著(P<0.01，下同)或顯著(P<0.05)高于雌性個(gè)體，在性腺中的表達(dá)量極顯著低于雌性個(gè)體，在腹節(jié)神經(jīng)、鰓、肌肉和腸道中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。初步推測(cè)TRY基因在羅氏沼蝦中可能存在性別表達(dá)特異性。

雄性和雌性羅氏沼蝦胃、心臟、性腺和肝胰腺圖柱上的**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2TRY基因在不同生長(zhǎng)速度家系個(gè)體的表達(dá)規(guī)律分析 以本研究課題組前期采集FG和SG中體重和體長(zhǎng)極端表型雌性羅氏沼蝦的肌肉組織為試驗(yàn)材料(n=8)，進(jìn)一步探究TRY基因在不同生長(zhǎng)速度個(gè)體中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果(表2)表明，F(xiàn)G中個(gè)體的體重、體長(zhǎng)、頭胸甲長(zhǎng)、頭胸甲寬、腹節(jié)長(zhǎng)和腹節(jié)寬等表型值均極顯著大于SG中的個(gè)體。

表2 16尾FG和SG雌性羅氏沼蝦個(gè)體的表型值比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果(圖5)顯示，TRY基因在FG個(gè)體肌肉組織中的表達(dá)量極顯著高于在SG個(gè)體肌肉組織中的表達(dá)量，且在FG個(gè)體中的表達(dá)量是SG個(gè)體中表達(dá)量的7.63倍。說(shuō)明TRY基因在羅氏沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

羅氏沼蝦FG個(gè)體肌肉組織圖柱上的**表示差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

TRY屬絲氨酸蛋白酶家族，其主要功能是消化蛋白質(zhì)食物和活化所有胰腺分泌的酶原[14-16]，主要作用于靶蛋白的精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵[17]。相關(guān)研究表明，TRY作為重要的蛋白消化酶類，與小龍蝦能量供應(yīng)和生長(zhǎng)所需的氨基酸代謝相關(guān)[18]，且與體型呈正相關(guān)，能解釋體型大小68 %的遺傳變異[19]。在大西洋鮭魚中的研究發(fā)現(xiàn)，TRY顯著影響游離氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，其蛋白消化速率和游離氨基酸吸收效率與肌肉中的蛋白合成速率呈正比[20]。以上研究均表明，TRY與水生動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育顯著相關(guān)。本研究選取TRY基因作為羅氏沼蝦生長(zhǎng)性狀候選基因進(jìn)行深入研究，并基于NCBI已公布的EST序列，對(duì)羅氏沼蝦TRY基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同源性比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果均顯示，羅氏沼蝦TRY氨基酸序列與刀額新對(duì)蝦的同源性最高，即羅氏沼蝦與刀額新對(duì)蝦的親緣關(guān)系最近。

蝦蟹類動(dòng)物的TRY主要由肝胰腺分泌[21]，而肝胰腺作為蝦類的主要物質(zhì)代謝器官，在各種消化酶類合成、分泌及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、消化和能量?jī)?chǔ)存等方面扮演重要角色[22]，是影響甲殼類動(dòng)物生長(zhǎng)的重要器官[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，TRY基因在雌雄羅氏沼蝦肝胰腺組織中高表達(dá)，與李運(yùn)東[8]對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的研究結(jié)果一致；TRY基因在雌性和雄性羅氏沼蝦個(gè)體的胃、心臟、肝胰腺和性腺中的表達(dá)水平存在極顯著或顯著差異，推測(cè)該基因可能存在性別表達(dá)特異性，與詹湉湉[25]、許麗惠等[26]研究認(rèn)為TRY基因在黃羽肉雞各組織中廣泛表達(dá)且在雌、雄黃羽肉雞的胰腺組織中表達(dá)量最高及不同發(fā)育階段、不同組織的TRY基因均存在性別差異性的觀點(diǎn)吻合。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)G中個(gè)體的體重、體長(zhǎng)、頭胸甲長(zhǎng)、頭胸甲寬、腹節(jié)長(zhǎng)和腹節(jié)寬等表型值均極顯著大于SG中的個(gè)體。TRY基因在FG個(gè)體肌肉組織中的表達(dá)極顯著高于SG個(gè)體，與前人研究認(rèn)為斑節(jié)對(duì)蝦的TRY基因表達(dá)量在幼體和仔蝦期很低，但隨著幼體的發(fā)育表達(dá)量逐漸升高[8]、隨著黃顙魚的生長(zhǎng)發(fā)育，TRY基因的表達(dá)逐漸升高[27-28]及隨著凡納濱對(duì)蝦幼體的不斷發(fā)育，其TRY活力逐漸升高[29]的觀點(diǎn)相似。因此證實(shí)，TRY基因在羅氏沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，推測(cè)TRY基因表達(dá)量高的FG個(gè)體，其TRY活性相應(yīng)也較高，因而生長(zhǎng)速率快，與Ueberschar[30]研究認(rèn)為大西洋鮭的TRY活性與生長(zhǎng)速率呈明顯正相關(guān)、TRY活性可作為衡量其生長(zhǎng)速率重要指標(biāo)的觀點(diǎn)一致，進(jìn)一步提示TRY基因可能通過(guò)肝胰腺組織介導(dǎo)并調(diào)控羅氏沼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié) 論

羅氏沼蝦與刀額新對(duì)蝦的親緣關(guān)系最近；TRY基因在羅氏沼蝦各組織中廣泛表達(dá)，以在雌、雄羅氏沼蝦肝胰腺組織中表達(dá)量最高，且存在性別差異性；TRY基因在羅氏沼蝦生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，可能正向調(diào)控羅氏沼蝦的生長(zhǎng)發(fā)育。