傅曉春，葉輝銘(廈門市婦幼保健院醫(yī)學(xué)檢驗科，福建廈門 361003)

HBV作為一種含不完全閉合雙鏈的DNA病毒，至今在全球仍約有2.4億慢性感染者[1]。HBsAg作為HBV感染常見的篩查標(biāo)志物，與HBV DNA定量檢測的聯(lián)合應(yīng)用能更好地監(jiān)測患者的HBV感染自然史，基線HBsAg水平可幫助改進(jìn)免疫調(diào)節(jié)治療和核苷類似物(nucleotide analogues, NAs)治療的方案[2]。然而，近年較多報道HBsAg上存在一種新增N-糖基化(N-linked glycosylation)突變，可對其自身抗原性、病毒復(fù)制力、宿主免疫應(yīng)答和HBV相關(guān)肝臟疾病進(jìn)程產(chǎn)生影響[3-15]，可能影響疫苗接種、HBV檢測及臨床治療評估[5-8,10,12-15]。因此，本文對此作一綜述，以指導(dǎo)乙肝疫苗的改良、HBsAg檢測試劑的研發(fā)、降低HBV傳播風(fēng)險并優(yōu)化臨床治療策略。

1 HBsAg的新增N-糖基化突變及其檢測

N-糖基化是一種在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)和高爾基體(golgi apparatus，GA)中進(jìn)行的新生肽鏈的翻譯后修飾方式，其修飾位點(diǎn)須有一致的氨基酸序列N-X-S/T(N為天冬酰胺，X為脯氨酸以外的任意氨基酸，S為絲氨酸，T為蘇氨酸)，因此可以依靠質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索手段實現(xiàn)大規(guī)模位點(diǎn)鑒定[16-18]。N-糖基化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺少特征的吸收光譜，通常情況下為電中性，并且雖然其是生物體內(nèi)普遍發(fā)生的一種翻譯后修飾，但豐度通常較低，需要經(jīng)過凝集素親和法、酰肼化學(xué)法、親水作用色譜法及硼親和法等進(jìn)行富集[19]，并通過分子熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記法、抗體標(biāo)記、化學(xué)衍生和凝集素標(biāo)記等進(jìn)行衍生化，使之具有熒光特性、紫外吸收或其他一些可測定的物理化學(xué)性質(zhì)，才能實現(xiàn)深度覆蓋分析[20]。

HBV進(jìn)入肝細(xì)胞須借用細(xì)胞器完成自身蛋白質(zhì)的合成與修飾，其部分外膜蛋白需經(jīng)過N-糖基化修飾，每增加1個糖基化，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量則增大約3 000，其糖基可被糖苷內(nèi)切酶 PNGase F或Endo H移除[16,18]。 HBV主蛋白(S-HBsAg)有糖化型(GP27，位于主蛋白的sN146)和非糖化型(GP24)，中蛋白(M-HBsAg)有單糖化(GP33，位于主蛋白的sN146)和雙糖化(GP36，位于前S2蛋白的N4和主蛋白的sN146)，大蛋白(L-HBsAg)有非糖化型(GP39)和糖化型(GP42，位于主蛋白的sN146)，糖化型/非糖化型數(shù)量比約1∶1[5]，以sN146對HBsAg分泌最為重要[4]。研究表明，N-糖基化在蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸、免疫應(yīng)答、病毒感染及維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定等過程中扮演著重要角色[11]。目前，對于HBsAg新增N-糖基化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)主要通過測序分析進(jìn)行預(yù)測，并構(gòu)建融合蛋白表達(dá)相應(yīng)突變蛋白，同時使用糖基化酶抑制劑(衣霉素)進(jìn)行干擾試驗，然后經(jīng)PNGase F或Endo H移除N-糖基，再通過免疫印跡試驗確認(rèn)推測的位點(diǎn)是否產(chǎn)生新增N-糖基[7,12,14,16-17]。而當(dāng)前商品化HBsAg定量檢測試劑均未區(qū)分糖基化與非糖基化HBsAg，對新增N-糖基的HBsAg仍缺少特異的檢測方法，因此，不同位點(diǎn)新增N-糖基的HBsAg在不同檢測平臺可存在較大檢測差異[14]，仍需要繼續(xù)研發(fā)新的檢測方法。

既往對HBsAg新增N-糖基化的報道主要見于HBsAg與抗HBs雙陽性的乙肝患者和部分隱匿性乙型肝炎(occult hepatitis B，OBI)患者。HBsAg上一些特定位點(diǎn)的替換突變或插入突變可形成N-X-S/T結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生新增N-糖基(主要位于主要親水區(qū))。目前報道的自然發(fā)生的替換突變位點(diǎn)有：sG112N、sT113N、sT116N、sT123N、sQ129N、sG130N、sT131N+sM133T[9,11-12,14-15,21-23](圖1)，不同HBV基因型的突變位點(diǎn)存在差異。例如，B型HBV僅發(fā)現(xiàn)sT131N+sM133T，而其他位點(diǎn)在C型HBV均可見，以sT131N+sM133T最常見。插入突變見于s112-113、s113-114、s114-115、s115-116、s125-126、s135-136的氨基酸之間插入2～8個不等的氨基酸[9,13-14,21-22]，均位于主要親水區(qū)(圖1)。

2 HBsAg新增N-糖基化對HBV的影響

HBsAg作為宿主主要的免疫原，新增N-糖基化的出現(xiàn)可能導(dǎo)致其蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，改變其抗原性，造成HBV免疫逃逸及HBsAg檢測失敗。同時，由于HBV S區(qū)與P區(qū)基因的重疊，逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,RT)蛋白的改變還可能發(fā)生NAs耐藥。

既往臨床研究均顯示，血清HBsAg與抗HBs雙陽性的乙肝患者相比于HBsAg單陽性者，血清HBV含有較高比例的HBsAg新增N-糖基化突變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[6，22-24]。在OBI與非OBI患者中也有相同的發(fā)現(xiàn)[14-15]。說明HBsAg的新增N-糖基化可能改變或降低了HBsAg的抗原性，造成HBsAg和抗HBs共存[25]，使得HBsAg檢測假陰性而形成OBI[15]。

基礎(chǔ)研究證實，不同位點(diǎn)的新增N-糖基化突變可不同程度降低HBsAg的抗原性[5,8,12,15,26]。劉妍等[14]通過構(gòu)建HBsAg-myc-His融合蛋白分析在OBI患者中發(fā)現(xiàn)的sQ129N、s115-116插入INGTST、s126-127插入RPCMNCTI和sT116N+sT131N/sM133T突變，發(fā)現(xiàn)4種突變均產(chǎn)生新增N-糖基化，且激光共聚焦分析顯示，4種突變株HBsAg/His標(biāo)簽的熒光強(qiáng)度比值相比野生型分別降低了76.3%、53.4%、67.1%和52.7%，用6種HBsAg臨床試劑進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示后3種突變株對試劑的反應(yīng)性均明顯降低，其中4種試劑檢測不出。而Yu等[6]通過PNGase F去除新增N-糖基化基團(tuán)后，HBsAg與試劑的反應(yīng)性提高2～4.88倍不等。因此，研究者認(rèn)為新增N-糖基化阻礙了HBsAg的檢測而不是抗原的產(chǎn)生[15]。值得注意的是，新增N-糖基化突變卻能提高HBV的復(fù)制和分泌，使突變型HBV成為優(yōu)勢株[27]，因此造成患者高病毒載量而低HBsAg的假象[6,22,26-27]，可導(dǎo)致臨床對患者病情的錯誤評估。然而，Kang等[12]和Li等[7]的研究認(rèn)為部分突變(例如sQ129N或sT123N)明顯損害HBV復(fù)制力和病毒分泌。研究結(jié)論的不同可能由于使用的復(fù)制性質(zhì)粒的差異而導(dǎo)致，有待更多的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行確認(rèn)。

3 HBsAg新增N-糖基化對宿主免疫的影響

HBsAg上非糖基化/糖基化sN146的共存提示其在HBV的感染和宿主免疫過程中可能存在雙重功能[5]。Julithe等[5]研究顯示，非糖基化的sN146對HBV感染肝細(xì)胞必不可少，而糖基化除了對HBV病毒分泌至關(guān)重要，還可保護(hù)“a”決定簇免受中和抗體的作用。在HBsAg高糖基化時(s115、s129和s136同時發(fā)生糖基化)，突變型病毒顆粒進(jìn)入肝細(xì)胞的量相比野生型顯著減弱，并獲得對中和抗體的抗性。新增N-糖基化可能通過遮蔽“a”決定簇，逃避抗HBs的識別[6,12]。劉浩等[3]研究表明，去除M-HBsAg N4糖基化位點(diǎn)可導(dǎo)致細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)下降，但若通過定點(diǎn)誘變在M-HBsAg第5或7位氨基酸新增N-糖基，能修補(bǔ)或替代N4糖基位點(diǎn)的功能。Kang等[12]構(gòu)建sT123N突變型HBV復(fù)制性質(zhì)粒，用電穿孔法進(jìn)行小鼠體內(nèi)DNA免疫，成功誘導(dǎo)了與野生型HBV相當(dāng)?shù)目笻Bs反應(yīng)。然而Li等[7]用小鼠尾靜脈高壓水注射sT123N突變型HBV復(fù)制性質(zhì)粒進(jìn)行動物實驗，卻發(fā)現(xiàn)sT123N減低了HBsAg的表達(dá)，可能因此損傷病毒顆粒的分泌，導(dǎo)致HBcAg在細(xì)胞內(nèi)滯留，但小鼠對HBsAg和HBcAg的抗體反應(yīng)明顯增強(qiáng)，加速了HBsAg的清除。2個研究采用的動物實驗方法的不同可能是導(dǎo)致結(jié)果差異的原因，仍需要進(jìn)一步實驗驗證。

高甘露糖型HBV可被樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)表面特異性細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)識別，促進(jìn)DCs的成熟和活化[28]。鄒小靜等[29]和Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，用基夫堿(α-甘露糖苷酶抑制劑)處理人肝癌細(xì)胞Hep G2.2.15細(xì)胞后收獲高甘露糖型HBV顆粒，發(fā)現(xiàn)相比野生型HBV顆粒，高甘露糖型HBV顆粒經(jīng)DC-SIGN識別后對DCs成熟和活化的促進(jìn)作用更強(qiáng)，而DC-SIGN基因沉默可消除2型HBV對DCs影響的差異。因此認(rèn)為，天然的HBV可能利用α-甘露糖苷酶參與的去甘露聚糖修飾來逃避DC-SIGN的識別，從而誘導(dǎo)DCs功能的缺陷，導(dǎo)致HBV的慢性感染。但目前未有研究者對新增N-糖基形成的高糖基化HBV對DC-SIGN的影響進(jìn)行研究，我們推測該類型突變對宿主的免疫反應(yīng)可能具有相似的影響。Hyakumura等[17]與Joe等[16]研究表明，通過糖工程生產(chǎn)的新增N-糖基的高糖基化HBsAg病毒樣顆粒，可能由于糖豐度的提高，刺激了抗原提呈細(xì)胞的糖蛋白受體，大大地增強(qiáng)了自身免疫原性，有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生更持久的免疫反應(yīng)。該研究成果為開發(fā)更安全有效的HBV疫苗提供了新思路。

4 HBsAg新增N-糖基化對肝臟相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的影響

多項針對HBsAg與抗HBs雙陽性或OBI患者的研究表明，HBsAg新增N-糖基化與肝臟疾病進(jìn)程相關(guān)。陳杰等[13]則發(fā)現(xiàn)慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者相比慢性乙肝患者，HBV包膜蛋白正常糖基化位點(diǎn)變異導(dǎo)致糖基化缺失的比例更高，認(rèn)為正常糖基化位點(diǎn)的N-糖基化水平降低可能與ACLF的發(fā)生相關(guān)。Chen等[26]在OBI患者中發(fā)現(xiàn)13個未被發(fā)現(xiàn)的突變模式，分析表明，隨著病程的延長，preS2起始密碼子M→I+sT131N/M133TT突變的比例增加。喬艷等[9-10]與盧姍姍等[22]研究顯示，HBsAg與抗HBs雙陽性的乙肝患者相比于HBsAg單陽性的乙肝患者有更高的新增N-糖基化發(fā)生率，且肝癌發(fā)生率更高，認(rèn)為HBsAg與抗HBs雙陽性疊加主要親水區(qū)新增N-糖基化可能是HBV感染者發(fā)生肝細(xì)胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)的風(fēng)險預(yù)測指標(biāo)，但仍需要更多的基礎(chǔ)研究來澄清這些病毒突變是驅(qū)動因素還是僅僅是一種指示標(biāo)志[10]。例如，Liu等[4]的研究則有力地證明了N-糖基化修飾L-HBsAg可以調(diào)節(jié)L-HBsAg的分泌，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞周期和增殖，其中N320K(即主蛋白sN146K)導(dǎo)致的糖基化缺失可阻斷L-HBsAg的分泌，導(dǎo)致G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞抑制，抑制有絲分裂的進(jìn)入，這可能是HBV誘發(fā)肝癌的機(jī)制之一。對于含該突變的乙肝患者更容易發(fā)生HCC的分子免疫學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)行探索。

5 總結(jié)

對于研究者來說，對HBsAg新增N-糖基化的研究需要規(guī)范、統(tǒng)一的研究方法進(jìn)行實驗，以獲得一致的研究結(jié)果。通過構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系，表達(dá)出HBsAg的融合蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)分析[6]，或者經(jīng)構(gòu)建HBV復(fù)制性質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞[22]的細(xì)胞模型建立，均無法模擬宿主體內(nèi)免疫網(wǎng)絡(luò)以及組織器官結(jié)構(gòu)的真實內(nèi)環(huán)境，不利于觀察HBV的體內(nèi)復(fù)制過程和免疫動態(tài)變化。并且，對于該突變導(dǎo)致的RT蛋白改變對NAs治療的影響尚缺乏關(guān)注，感染此類突變HBV更容易發(fā)生HCC的具體機(jī)制的研究仍不夠深入。因此，需要在分子、細(xì)胞和動物水平上進(jìn)一步系統(tǒng)性地分析該類型突變影響乙肝患者NAs治療及疾病進(jìn)程的機(jī)制。

對于臨床工作者來說，應(yīng)注意此類突變導(dǎo)致的HBsAg抗原性變化，防止由于此類患者 HBsAg定量結(jié)果偏低甚至假陰性[14]，導(dǎo)致低估患者病情甚至誤診。還應(yīng)關(guān)注此類突變的HBV導(dǎo)致的OBI對臨床用血安全的威脅，以及由此出現(xiàn)免疫逃逸而導(dǎo)致HBV傳播[15]。其有效的解決辦法是開發(fā)針對此類突變的HBsAg檢測試劑防止檢測結(jié)果的偏差，而糖工程產(chǎn)生的高糖基化HBV疫苗為未來的HBV防治提供了新道路，值得嘗試[16]。同時，由于該突變對HBV復(fù)制力的影響，可能需要根據(jù)患者治療情況作出相應(yīng)的NAs用藥調(diào)整。此外，對于感染此類突變HBV的患者，應(yīng)注意加強(qiáng)隨訪，以預(yù)防不良肝臟相關(guān)疾病的發(fā)生[10,13,22]。