呂春子，朱 俊，盧 宇，鄧碧華

1.揚(yáng)州市畜牧獸醫(yī)站，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所，江蘇南京210014；3.儀征市新城鎮(zhèn)獸醫(yī)站，江蘇揚(yáng)州 211400

人參皂苷是一種固醇類(lèi)化合物。三萜皂苷是人參中的重要活性成分，其中的人參皂苷具備良好的抗病毒作用。一部分化學(xué)研究專(zhuān)家將人參作為疫苗的配合添加劑，從而有效提升疫苗的穩(wěn)定性和安全性，在畜牧業(yè)中使用能夠幫助畜禽預(yù)防多種病毒，改善畜禽免疫力[1～3]。

人參皂苷乳劑是由人參皂苷和油佐劑制成的W/O/W 型乳劑，擬用作動(dòng)物緩釋型免疫增強(qiáng)劑。人參皂苷另外一個(gè)顯著特點(diǎn)是溶水性較好，W/O/W 復(fù)乳佐劑可以包裹、保護(hù)人參皂苷，進(jìn)而能夠與眾多藥品互相協(xié)同，更好地提升人們的身體免疫力。本試驗(yàn)進(jìn)行了人參皂苷乳劑的急性毒力試驗(yàn)，旨在為評(píng)價(jià)其安全性并指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人參皂苷購(gòu)自禹州凱旋藥業(yè)有限公司，人參皂苷乳劑由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院制備，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR 小白鼠，保證小白鼠體重在18～22g，小白鼠均購(gòu)買(mǎi)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0007。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 內(nèi)毒素檢測(cè)

人參皂苷樣品用去離子水溶解后，用022 um濾器過(guò)濾，按《中國(guó)藥典》2015 版附錄中的內(nèi)毒素檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)[4]。

1.3.2 急性毒力試驗(yàn)

1.3.2.1 預(yù)試驗(yàn)

選擇40 只小白鼠，雌雄數(shù)量比為20:20，將小白鼠隨機(jī)劃分成為3 組，每組8 只，在0.375～1.5g/kg 范圍內(nèi)擬訂3個(gè)劑量，分別一次腹腔注射人參皂苷乳劑，測(cè)定0%致死量（Dnin）及100%致死量（Dmax）。

1.3.2.2 正式試驗(yàn)

根據(jù)改良寇氏法的“分組及劑量比值表”設(shè)5個(gè)劑量組，從低到高的比例為1:1.3。取小鼠50 只，隨機(jī)分為5 組，每組10 只，雌雄各半，從小到大分別按0.26、0.34、0.44、0.58、0.75g/kg 的劑量一次腹腔注射人參皂苷乳劑。給藥后觀察動(dòng)物的反應(yīng)和死亡情況，死亡動(dòng)物剖檢，記錄病理變化。連續(xù)觀察7d 統(tǒng)計(jì)死亡率，計(jì)算LD50[5]。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

由表1 和圖1 顯示，按《中國(guó)藥典》2015 版附錄中的內(nèi)毒素檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣制備出相關(guān)曲線，對(duì)照人參皂苷溶液的A545 nm 的吸光值，換算出人參皂苷的內(nèi)毒素含量，結(jié)果人參皂苷不含內(nèi)毒素。

表1 內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

圖1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 急性毒力預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

表2 結(jié)果顯示，0.75g/kg 和1.5g/kg 劑量組死亡數(shù)為8/8；0.375g/kg 劑量組死亡數(shù)為3/8。以0.75g/kg 組劑量作為Dmax，0.375g/kg 組劑量除以1.414 為Dmin，即0.26g/kg。

表2 小鼠急性毒力預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 急性毒力正式試驗(yàn)結(jié)果

表3 結(jié)果顯示，高劑量組給藥后，小白鼠很快出現(xiàn)了活動(dòng)量減少、煩躁不安的現(xiàn)象，一部分小白鼠出現(xiàn)神情呆滯、肌肉震顫、運(yùn)動(dòng)失衡等現(xiàn)象，并且伴隨著不同程度的知覺(jué)敏感度降低、知覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象。小白鼠接受給藥之后，在8～48 h 之間逐漸死亡。針對(duì)死亡小白鼠進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)，能夠發(fā)現(xiàn)小白鼠的腹中有不同程度的積水，中低組小白鼠死亡解剖并不存在明顯變化，小白鼠死亡現(xiàn)象在5d 之后消失，存活下的小白鼠生存狀態(tài)逐漸趨于正常。不同組別的小白鼠死亡數(shù)量統(tǒng)計(jì)如下表。

根據(jù)文獻(xiàn)，死亡率不含0%和100%，用以下公式計(jì)算LD50：

LD50的95%可信限= lg-1（lg LD50±1.96×SX50）

式中：i，組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)劑量之差；Xm，最大劑量對(duì)數(shù)；p，死亡率；Pm，最大死亡率；Pn，最小死亡率；q，存活率，q=1－p。

計(jì)算結(jié)果：人參皂苷乳劑LD50為0.419g/kg（以多糖計(jì)），LD50的95%可信限范圍為0.414～0.425g/kg。

表3 各組小鼠死亡情況及統(tǒng)計(jì)

3 討論

內(nèi)毒素檢測(cè)為陰性的人參皂苷制備成人參皂苷乳劑，小鼠腹腔注射人參皂苷乳劑的LD50為0.41g/kg，LD50的95% 可信限范圍為0.414～0.425g/kg。人參皂苷乳劑注射較為安全，可供臨床研究使用。