杜 娟，鄭云鵬，董洪濤，張鳳霞*

(1.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司集團(tuán)實(shí)驗(yàn)室，北京 100015；2.飛鶴(龍江)乳品有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161100)

α-乳白蛋白(α-La)是乳清蛋白中主要的優(yōu)質(zhì)蛋白，主要存在于哺乳動(dòng)物的乳汁中，能作為載物與鈣、鎂、錳、鈉、鉀以及鋅結(jié)合[1-2]，約占乳清蛋白的10%～20%[3-5]，在牛乳中占總蛋白質(zhì)的2%～3%，在母乳中占總蛋白質(zhì)的20%～25%[2]。α-La能提供最接近母乳的氨基酸組合，促進(jìn)嬰兒的大腦發(fā)育，同時(shí)還提高蛋白質(zhì)的生物利用率，降低蛋白質(zhì)總量，從而有效減輕腎臟負(fù)擔(dān)。β-乳球蛋白(β-Lg)是牛乳中的主要乳清蛋白，約占牛乳總蛋白的10%，占乳清蛋白的40%～50%[6-9]。據(jù)報(bào)道，近兩年全國(guó)嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)量約90萬(wàn)噸，其原料絕大多數(shù)為牛乳，并且添加了脫鹽乳清粉、乳清蛋白粉、濃縮乳清蛋白粉等蛋白類原料來(lái)調(diào)整蛋白質(zhì)比例，使其接近母乳水平[10]。據(jù)估算乳清粉類原料用量約為嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)量的8%～25%，因此乳清蛋白粉的品質(zhì)優(yōu)良至關(guān)重要。而乳清蛋白粉中α-La和β-Lg的含量是衡量其品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。

目前，α-La和β-Lg含量檢測(cè)的報(bào)道較少，已有方法有凝膠色譜法[11]、高效液相色譜法[12-13]、毛細(xì)管電泳法[14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[18]等。然而，目前的檢測(cè)方法主要是針對(duì)嬰幼兒配方奶粉、牛乳等樣品基質(zhì)。而針對(duì)乳清蛋白類原料等的分析研究主要停留在總蛋白含量測(cè)定水平上，尚無(wú)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)α-La和β-Lg含量，已有的反相高效液相色譜法特異性較差[10]，不可避免地產(chǎn)生了乳清蛋白粉的監(jiān)管盲區(qū)。針對(duì)上述情況，本研究基于三重四極桿質(zhì)譜MRM/SRM定量思路的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，利用蛋白專屬的肽段序列完成定量分析。方法通過采用堿性胰蛋白酶為酶切工具，烷基化與酶解乳清蛋白類原料，特異肽段內(nèi)標(biāo)法超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)分析，降低了復(fù)雜樣品中共流出的背景干擾，從而實(shí)現(xiàn)了UPLC-MS/MS對(duì)乳清蛋白粉類樣品中α-La和β-Lg含量的準(zhǔn)確測(cè)定。本方法前處理簡(jiǎn)單快速，試劑用量少，定量準(zhǔn)確，對(duì)實(shí)際乳清蛋白粉類樣品的檢測(cè)結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(Xevo-TQD，沃特世科技(上海)有限公司)；電子分析天平(ME204，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)；渦旋混合器(VORTEX-2，美國(guó)Scientific Industries公司)；超聲波水浴(KQ-700DE，昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水器(Milli-Q Advantage A10，默克化工技術(shù)有限公司)。

牛α-La特異肽段(序列 VGINYWLAHK，分子量 1 199.7 Da，純度≥99%)；牛β-Lg特異肽段(序列：IDALNENK，分子量 915.5 Da，純度≥99%)；牛α-La同位素特異肽段(序列：VGI*NYWL*AHK，分子量1 214.4 Da，純度≥95%)；牛β-Lg同位素特異肽段(序列：I*DAL*NENK，分子量 929.5 Da，純度≥95%)；碳酸氫銨(生化試劑級(jí))、二硫蘇糖醇(DTT,生化試劑級(jí))、碘代乙酰胺(IAA，生化試劑級(jí))、堿性胰蛋白酶(生化試劑級(jí))。以上特異肽段、同位素特異肽段及試劑均由杭州璞湃科技有限公司提供。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純,美國(guó)默克公司)。共計(jì)5個(gè)國(guó)外品牌的脫鹽乳清粉D70、7個(gè)國(guó)外品牌的脫鹽乳清粉D90、3個(gè)國(guó)外品牌濃縮乳清蛋白粉和1個(gè)國(guó)外品牌α-乳白蛋白粉，共計(jì)16個(gè)。樣品均由黑龍江飛鶴乳品有限公司提供。實(shí)驗(yàn)用水均為二級(jí)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制α-La和β-Lg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 μmol/L)：標(biāo)準(zhǔn)品20 nmol，準(zhǔn)確加入10 mL水定容，即得α-La和β-Lg(2 μmol/L)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并于-20 ℃冰箱中保存。

α-La-IS和β-Lg-IS的混合同位素內(nèi)標(biāo)使用液(2 μmol/L)：標(biāo)準(zhǔn)品20 nmol，準(zhǔn)確加入10 mL水定容，即得α-La-IS和β-Lg-IS(2 μmol/L)混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品前處理烷基化與酶解：稱取適量試樣1.0 g，置于25 mL具塞玻璃比色管中，先用5 mL水溶解，再定容至刻度。移取25 μL至2 mL離心管中，加入200 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液和10 μL的二硫蘇糖醇(DTT)還原，50 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后加入30 μL的碘代乙酰胺(IAA)烷基化后，靜置30 min，加入200 μL緩沖溶液(500 mmol/L碳酸氫銨)、10 μL增活劑CaCl2和50 μL堿性胰蛋白酶溶液，37 ℃恒溫酶解過夜，10 μL甲酸終止酶解。采用水定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

1.2.3 測(cè)定條件色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300?(100 mm×2.1 mm i.d.,1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，5%B;1～4.5 min，5%～40%B；4.5～4.6 min，40%～100%B；4.6～6.0 min，100%B；6.0～6.1 min，100%～5%B；6.1～8 min，5%B。質(zhì)譜條件：電噴霧模式：ESI+；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子噴霧電壓：3.0 kV；脫溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：800 L/h；干燥氣：氮?dú)?；碰撞氣：氬氣；MRM參數(shù)見表1。

表1 α-La和β-Lg及其內(nèi)標(biāo)在MRM模式下的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of α-La，β-Lg and their internal standards(IS) under multiple reaction monitoring(MRM) mode

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性多肽的選擇

本文選擇堿性胰蛋白酶作為酶切工具，將蛋白粉中的α-La和β-Lg酶切形成肽段。利用其高度專一性，水解精氨酸與賴氨酸羧基端的肽鍵。通過Uniprots數(shù)據(jù)庫(kù)的PeptideMass工具分析，α-La和β-Lg理論上可以通過酶解獲得9條和13條長(zhǎng)短不一的多肽產(chǎn)物，從MS系統(tǒng)的檢測(cè)性和穩(wěn)定性上考慮，應(yīng)選擇特定氨基酸上修飾少，長(zhǎng)度6～12個(gè)氨基酸的多肽作為目標(biāo)肽段[19]。其中氨基酸數(shù)量少于6個(gè)的肽段不具有足夠的特異性，氨基酸數(shù)量大于12個(gè)的肽段色譜分辨率低，故不進(jìn)行進(jìn)一步分析。經(jīng)篩選其中α-La有2條肽段VGINYWLAHK和LDQWLCEK，β-Lg有6條肽段TPEVDDEALEK、VLVLDTDYK、WENGECAQK、LIVTQTMK、IDALNENK和ALPMHIR符合要求。本文通過單離子掃描模式(SIM)與MRM方式對(duì)各個(gè)多肽的響應(yīng)值進(jìn)行評(píng)估，最終選擇色譜分離過程中無(wú)干擾、響應(yīng)值高的VGINYWLAHK和IDALNENK分別作為α-La和β-Lg的特異性多肽。通過Uniprots數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST分析工具對(duì)牛乳中的其他已知蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，未在其他蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)本肽段的存在。表明本文選擇的多肽具有高度的特異性。

在應(yīng)用UPLC-MS/MS法檢測(cè)多肽時(shí)，多肽的響應(yīng)值受到基質(zhì)以及參與反應(yīng)的化學(xué)試劑的影響，導(dǎo)致響應(yīng)信號(hào)增益或抑制?；谏鲜鰡栴}，本文選擇同位素特異肽VGI*NYWL*AHK和I*DAL*NENK作為內(nèi)標(biāo)，在預(yù)處理之前加至被測(cè)樣品中。同位素特異肽的理化性質(zhì)與目標(biāo)多肽完全一致，色譜-質(zhì)譜行為也一致(見圖1)，能校正由基質(zhì)效應(yīng)所帶來(lái)的檢測(cè)響應(yīng)值波動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段不但能降低基質(zhì)效應(yīng)還能校正樣品前處理過程的誤差。

圖1 乳清蛋白粉樣品中α-La和β-Lg特異肽及其同位素特異肽的色譜圖Fig.1 Chromatograms of α-La and β-Lg signature peptides and their isotope-labeled analogs in the whey powder samples

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇C4和C18的固定相均由疏水烷基鏈構(gòu)成，蛋白質(zhì)組分與反向固定相的疏水作用大小除與反相固定相的烷基鏈長(zhǎng)有關(guān)外，還與蛋白質(zhì)的疏水性相關(guān)。C4的烷基鏈較短，更適合分離質(zhì)量大的蛋白，而小分子的多肽需用烷基鏈更長(zhǎng)、疏水性較強(qiáng)的C18分離。本實(shí)驗(yàn)選用C18色譜柱，分別考察了Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300 ?(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC-BEH HILIC(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)2款色譜柱對(duì)分離效果的影響。結(jié)果顯示，前者能將標(biāo)準(zhǔn)特異肽段、同位素特異肽段分離，且目標(biāo)物的出峰時(shí)間短，峰形好，可以滿足質(zhì)譜定量的峰形要求；而后者得到的峰形較寬，峰形拖尾不對(duì)稱(圖2)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300 ?色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 采用BEH HILIC色譜柱分離的標(biāo)準(zhǔn)特征肽段的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of α-La and β-Lg separated with a BEH HILIC column

2.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化乳清粉中蛋白的極性較大，常用乙腈和水作為流動(dòng)相[20]。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈和水的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)色譜峰毛刺較多且拖尾?？紤]到待測(cè)物的化學(xué)性質(zhì)，分別嘗試乙腈-0.1%甲酸水溶液的流動(dòng)相體系和0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液的流動(dòng)相體系。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)在乙腈和水中均加入甲酸可改善目標(biāo)化合物的峰形。推測(cè)一方面是由于待測(cè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有酸性或堿性基團(tuán)，另一方面是甲酸可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用來(lái)改善峰形，克服毛刺和拖尾問題。在綜合峰形和分離度前提下，最終選擇的流動(dòng)相及梯度洗脫條件如“1.2.3”所述。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

用0.1%甲酸水溶液分別配制系列濃度為40、100、200、500、1 000 nmol/L的α-La標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)濃度為400 nmol/L；濃度為80、200、400、1 000、2 000 nmol/L的β-Lg標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)濃度為400 nmol/L。以α-La和β-Lg的特異肽段定量離子濃度(X)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的目標(biāo)分析物與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，α-La和β-Lg分別在40～1 000 nmol/L和80～2 000 nmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.998 7和0.998 9。以信噪比S/N≥10計(jì)算方法的定量下限(LOQ)，得到α-La和β-Lg的定量下限均為0.020 g/100 g。方法的靈敏度可滿足乳清蛋白粉中目標(biāo)物的檢測(cè)要求。

2.4 加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

稱取1 g脫鹽乳清粉D70作為本底，α-La和β-Lg加標(biāo)量分別為本底含量的0.5、1.0、1.5倍，即α-La的3個(gè)加標(biāo)水平分別為0.75、1.50、2.25 g/100 g，β-Lg的3個(gè)加標(biāo)水平分別為2.50、5.00、7.50 g/100 g。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，其平均回收率為84.7%～95.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.6%～5.8%(見表2)。方法的準(zhǔn)確度及精密度能夠滿足定量分析的基本要求。

表2 脫鹽乳清粉D70中α-La和β-Lg的3水平加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of α-La and β-Lg in demineralised whey powder 70% at three spiked levels(n=6)

2.5 乳清蛋白粉中α-La和β-Lg的含量分析

脫鹽乳清粉是將原料乳清中的礦物鹽脫去，改變?nèi)榍逯械碾x子平衡后即可得到。若將乳清直接烘干得到乳清粉末，再經(jīng)過澄清、超濾、干燥等過程即可得到濃縮乳清蛋白。濃縮乳清蛋白根據(jù)過濾程度不同，可以得到蛋白濃度從34%～80%不等的產(chǎn)品[12,21]。而脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉和α-乳白蛋白粉常作為蛋白類原料應(yīng)用于嬰幼兒配方食品中，用于調(diào)整牛奶中α-La的比例。本實(shí)驗(yàn)選取了5個(gè)國(guó)家的4類乳清蛋白粉共計(jì)16個(gè)樣品為代表性基質(zhì)，其中脫鹽乳清粉D70 樣品5個(gè)，脫鹽乳清粉D90樣品7個(gè)，濃縮乳清蛋白粉樣品3個(gè)，α-乳白蛋白粉樣品1個(gè)。對(duì)其中α-La和β-Lg含量按“1.2”方法進(jìn)行前處理及測(cè)定，檢測(cè)值均以10 d連續(xù)雙平行測(cè)量的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表3～4。

表3 脫鹽乳清粉D70、D90中α-La和β-Lg的含量Table 3 Content of α-La and β-Lg in demineralised whey powder 70% and 90%

表4 濃縮乳清蛋白粉和α-乳白蛋白粉中α-La和β-Lg含量Table 4 Content of α-La and β-Lg in whey protein concentrate and α-lactalbumin powder

由表3～4可知，脫鹽乳清粉D70中,α-La和β-Lg的含量分別為 1.38～1.95 g/100 g和4.20～4.81 g/100 g；脫鹽乳清粉D90中，α-La和β-Lg的含量分別為 1.24～2.03 g/100 g和3.65～6.21 g/100 g；濃縮乳清蛋白粉中,α-La和β-Lg的含量分別為 8.98～11.36 g/100 g和37.12～42.03 g/100 g；α-乳白蛋白粉中,α-La和β-Lg的含量分別為31.35 g/100 g和15.32 g/100 g。通過對(duì)這3類蛋白粉中α-La和β-Lg含量進(jìn)行對(duì)比分析，可以看出全部樣品均檢出α-La和β-Lg。其中，脫鹽乳清粉D70和D90由于制作工藝相近，只是脫去礦物質(zhì)程度不同，因此其測(cè)得α-La和β-Lg的含量基本一致。濃縮乳清蛋白粉中α-La和β-Lg含量約為脫鹽乳清粉的6～10倍，而且3種乳清蛋白粉中β-Lg的含量約為α-La的2.15～4.67倍，與文獻(xiàn)一致[22]。本實(shí)驗(yàn)在α-乳白蛋白粉中檢出β-Lg，可能是由于α-乳白蛋白粉的生產(chǎn)工藝所決定。α-乳白蛋白粉由乳清粉進(jìn)行超濾、濃縮、噴霧干燥得到，其中的α-La含量較其他種類乳清粉高，但是β-Lg并未完全去除。所以α-乳白蛋白粉中還會(huì)殘留少量的β-Lg，但經(jīng)過濃縮后其α-La和β-Lg的含量較脫鹽乳清粉D70和D90中的高。

同一樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)的日間平行性很好(RSD≤9.1%)，表明同類樣品不同品牌間波動(dòng)性不大，所以做整體平均數(shù)時(shí)，采取平均值計(jì)算，可保障樣品中含量的普遍性。檢測(cè)結(jié)果還顯示，不同類產(chǎn)品中α-La含量最高為α-乳白蛋白粉，β-Lg含量最高為濃縮乳清蛋白粉，脫鹽乳清粉D70和D90中的α-La和β-Lg含量均低于另外兩種蛋白類產(chǎn)品。生產(chǎn)中可以根據(jù)實(shí)際需要，選擇添加不同種類的乳清蛋白粉。

3 結(jié) 論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)乳清蛋白粉中α-La和β-Lg的方法。該方法簡(jiǎn)便易行、定量準(zhǔn)確、精密度好，能滿足乳清蛋白粉類樣品中α-La和β-Lg的檢測(cè)要求，可為乳清蛋白粉等原料中關(guān)鍵指標(biāo)提供方法和數(shù)據(jù)參考，以及為評(píng)價(jià)原料和終產(chǎn)品優(yōu)劣提供有力和有效的技術(shù)手段。

致謝：感謝黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司為本實(shí)驗(yàn)提供脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉、α-乳白蛋白粉等樣品。