袁曉倩，韓 晶，簡(jiǎn)龍海，陳 靜，毛北萍，鄭 榮

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

雙酚類和烷基酚類化合物是生產(chǎn)聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的重要原料，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品包裝材料、醫(yī)療器械、工業(yè)及家用洗滌劑等領(lǐng)域[1-4]。作為典型的雌激素類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，這兩類化合物具有不易降解和易蓄積的特性，從空氣到土壤均有被污染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。內(nèi)分泌干擾物可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入機(jī)體，并在體內(nèi)富集，對(duì)生物體具有基因毒性、生殖發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，并且對(duì)嬰幼兒的危害尤為嚴(yán)重[6-8]。我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)和歐盟化妝品法規(guī)(EC No 1223/2009)明確規(guī)定雙酚A、壬基苯酚與支鏈4-壬基苯酚為化妝品中的禁用物質(zhì)，但目前尚未收載相關(guān)檢驗(yàn)方法[9-10]。因此，迫切需要開發(fā)同時(shí)測(cè)定多種雙酚類及烷基酚類內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)方法，并應(yīng)用建立的分析方法對(duì)化妝品樣品進(jìn)行全面調(diào)研。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于雙酚A、4-壬基苯酚和4-辛基苯酚的檢測(cè)方法主要有電化學(xué)法[11-12]、高效液相色譜法[13-15]、分光光度法[16]、毛細(xì)管電泳法[17]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[18]、氣相色譜-質(zhì)譜法[19-20]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-26]等。但光譜法、色譜法存在選擇性差、靈敏度低等不足，無(wú)法解決化妝品基質(zhì)復(fù)雜的問(wèn)題，陽(yáng)性樣品需經(jīng)質(zhì)譜進(jìn)一步確證。而現(xiàn)有的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法響應(yīng)低，需進(jìn)一步優(yōu)化色譜與質(zhì)譜條件。此外，目前已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的檢測(cè)方法覆蓋化合物較少，僅限于1～2種化妝品基質(zhì)。

本研究采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法對(duì)化妝品中的雙酚類化合物(雙酚A、雙酚S、雙酚F)和烷基酚類化合物(對(duì)特辛基苯酚、2,4-二叔丁基酚、支鏈4-壬基苯酚、4-辛基苯酚、4-壬基苯酚)進(jìn)行檢測(cè)。建立的方法快速靈敏、分離度好，能滿足化妝品中相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)要求，從而為化妝品的日常監(jiān)督和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；API 6500型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Absciex公司)；分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；MS 3 digital渦旋混合器(德國(guó)IKA公司)；5810 R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Milli-Q Advantage A-10型超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

雙酚S(純度99.30%)、雙酚F(純度99.81%)、雙酚A(純度99.60%)、對(duì)特辛基苯酚(純度98.65%)、4-辛基苯酚(純度99.28%)、4-壬基苯酚(純度99.72%)，均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；2,4-二叔丁基酚(純度99.80%，德國(guó)CNW公司);支鏈4-壬基苯酚(純度99.80%，美國(guó)o2si標(biāo)準(zhǔn)品公司);雙酚A內(nèi)標(biāo)(純度99.00%，美國(guó)CDN標(biāo)準(zhǔn)品公司)；甲醇、乙腈(色譜級(jí)，Merck公司)；氨水(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水機(jī)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件色譜柱：Waters X-Bridge BEH Phenyl液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.5 μm)；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：0.1% 氨水(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序：0～3 min，70%～40% A；3～10 min，40%～10% A；10～15 min，10% A；15～15.1 min，10%～70%A；15.1～18 min，70%A。

1.2.2 質(zhì)譜條件離子化模式：負(fù)離子電噴霧離子化(ESI-)；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣壓力(CUR)：1.72×105Pa，氮?dú)猓浑x子源噴霧電壓(IS)：5 500 V；霧化溫度(TEM)：450 ℃；霧化氣壓力(GAS1)：55 psi(3.79×105Pa)，氮?dú)?；加熱輔助氣(GAS2)：50 psi(3.45×105Pa)，氮?dú)猓浑x子駐留時(shí)間均為50 ms；各化合物的檢測(cè)離子對(duì)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

表1 9種目標(biāo)分析物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)電壓參數(shù)Table 1 Monitor ion pairs and voltage parameters of 9 target analytes

(續(xù)表1)

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取雙酚A內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取0.1 mL置于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液。

分別精密稱取8種待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱保存。

分別精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液適量，用甲醇稀釋成8種標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0.005、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的系列待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度均為10 ng/mL。

1.4 樣品前處理

粉類、水劑、膏霜乳液類、凝膠類化妝品：準(zhǔn)確稱取化妝品樣品約1.0 g，精確至0.001 g，置于25 mL玻璃比色管中，加入250 μL雙酚A內(nèi)標(biāo)工作溶液(1 μg/mL)，再加入乙腈-1%氨水(4∶1，體積比)混合溶液定容至刻度，渦旋混勻，超聲提取30 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，濾液作為待測(cè)液備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇由于待測(cè)的烷基酚類化合物中包含同分異構(gòu)體，其具有相同的母離子和子離子，因此需選擇合適的液相色譜柱將其完全分離。本實(shí)驗(yàn)嘗試了3種柱效較高的快速分離色譜柱：A柱為Agilent Poroshell 120 EC C18(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)，B柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，C柱為Waters X-Bridge BEH Phenyl(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A柱可有效分離雙酚類化合物，但對(duì)烷基酚類化合物無(wú)保留。B柱可分離部分烷基酚類化合物，但對(duì)雙酚類化合物的保留較差。C柱可以同時(shí)有效分離雙酚類及烷基酚類化合物，且峰形最優(yōu)(如圖1所示)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Waters X-Bridge BEH Phenyl(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)為最佳色譜柱。

圖1 9種目標(biāo)分析物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 9 target analytes the number denoted was the same as that in Table 1

2.1.2 流動(dòng)相的選擇由于酚類化合物多在ESI-模式下離子化，而甲醇相比于乙腈具有更低的表面張力，有利于電噴霧液滴源內(nèi)溶劑揮發(fā)，提高靈敏度。本實(shí)驗(yàn)以甲醇為有機(jī)相，考察了0.1%氨水、1%氨水、5 mmol/L乙酸銨、純水作為水相的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)前三者均能夠提高離子對(duì)響應(yīng)。但隨著氨水濃度的增加，雙酚F出現(xiàn)色譜峰拖尾的情況。綜合考慮峰形與離子對(duì)響應(yīng)，選用0.1%氨水和甲醇作為最佳流動(dòng)相體系。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

根據(jù)目標(biāo)化合物的極性，本實(shí)驗(yàn)考察了1%氨水甲醇、1%氨水乙腈、乙腈-1%氨水(4∶1，體積比)、乙腈-1%氨水(1∶1，體積比)4種溶劑對(duì)化妝品基質(zhì)的提取效果。結(jié)果表明，粉類、水劑、膏霜乳液類、凝膠類4種基質(zhì)的化妝品均能均勻分散在4種溶劑中，但使用乙腈-1%氨水(1∶1)提取時(shí)，待測(cè)物的回收率僅為67.5%～79.2%。使用1%氨水甲醇提取時(shí)，長(zhǎng)鏈烷基酚(4-NP B，4-n-NP,4-N-OP)的回收率為63.4%～75.1%。使用1%氨水乙腈提取時(shí)，回收率雖能達(dá)到91.5%～98.4%，但由于1%氨水乙腈的溶劑效應(yīng)，易造成峰形拖尾。而選擇乙腈-1%氨水(4∶1)為提取溶劑時(shí)，可在確保回收率(82.2%～99.1%)的同時(shí)(見圖2)，保證峰形尖銳對(duì)稱、分離度好。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-1%氨水(4∶1)對(duì)8種待測(cè)物進(jìn)行提取。

圖2 4種提取溶劑對(duì)膏霜類樣品中8種待測(cè)物的提取效果Fig.2 Extraction efficiencies of 8 analytes in cream samples by four solvents

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限在優(yōu)化條件下，雙酚A采用內(nèi)標(biāo)法，其他7種雙酚類及烷基酚類化合物采用外標(biāo)法對(duì)“1.3”配制的系列濃度(0.005～50 ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以各組分的質(zhì)量濃度(X，ng/mL)為橫坐標(biāo)，雙酚A的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(其他7種待測(cè)物的峰面積)(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，8種內(nèi)分泌干擾物均在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.997。

表2 8種目標(biāo)分析物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r)，limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ)of 8 target analytes

選取粉類、水劑、膏霜乳液類、凝膠類陰性樣品，各稱取1.0 g，添加混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，按本方法進(jìn)行前處理并測(cè)定。分別以信噪比(S/N)為3和10時(shí)進(jìn)行計(jì)算，得到方法的檢出限(LOD)為0.001 25～0.025 mg/kg，定量下限(LOQ)為0.005～0.05 mg/kg(見表2)。其中，本方法對(duì)雙酚A的檢出限(0.005 mg/kg)低于現(xiàn)有國(guó)標(biāo)方法GB/T 30939-2014的檢出限(0.025 mg/kg)[27]。

2.3.2 加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差取粉類、水劑、膏霜乳液類、凝膠類陰性樣品各1.0 g，平行6份，分別加入不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，按照本方法進(jìn)行前處理并測(cè)定，方法的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表3。由表3可知，8種內(nèi)分泌干擾物的回收率為75.1%～107%，RSD(n=6)為0.1%～1.6%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度較高。

表3 回收率與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of spiked recovery and repeatability test

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法分別對(duì)從市場(chǎng)收集的不同場(chǎng)地、不同品牌的61批染發(fā)類樣品進(jìn)行測(cè)定，其中雙酚A檢出5批次，含量為0.017～0.475 mg/kg；支鏈4-壬基苯酚檢出14批次，含量為0.020～1.190 mg/kg；2,4-二叔丁基酚檢出2批次，含量為0.236～0.250 mg/kg。實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)染發(fā)類樣品的監(jiān)管力度。

針對(duì)陽(yáng)性樣品，采用國(guó)標(biāo)方法GB/T 30939-2014與本方法進(jìn)行對(duì)比。由于僅雙酚A有國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法(檢出限0.025 mg/kg)，故僅對(duì)雙酚A作方法比較。結(jié)果顯示，以某染發(fā)霜為典型樣品，采用本方法測(cè)得雙酚A的含量為0.475 mg/kg，樣品的MRM提取色譜圖如圖3所示，國(guó)標(biāo)方法測(cè)得該染發(fā)霜中雙酚A含量為0.465 mg/kg。本方法與國(guó)標(biāo)方法的結(jié)果基本一致。

圖3 陽(yáng)性樣品的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram of a positive sample

3 結(jié) 論

本文建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定化妝品中8種雙酚類及烷基酚類化合物的分析方法。該方法使用內(nèi)標(biāo)法定量，樣品前處理簡(jiǎn)單、回收率穩(wěn)定、靈敏度高，適用于多種化妝品基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的定性定量分析。該方法的建立進(jìn)一步拓展了雙酚A等內(nèi)分泌干擾物的分析技術(shù)，可為化妝品監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。