蘇 爽，張二鵬，韓月哲，張榕杰*，韓華云，賀 靜

1.鄭州大學 化學學院，河南 鄭州 450001

2.河南省疾病預防控制中心，河南 鄭州 450016

交鏈孢霉毒素是由交鏈孢霉產(chǎn)生的一類真菌毒素，主要包括細交鏈孢菌酮酸(TeA)、交鏈孢酚(AOH)、交鏈孢酚單甲醚(AME)和騰毒素(TEN)。近年來對交鏈孢霉毒素的研究表明其對人畜的健康均有影響：TeA可引起急性毒性，微克劑量可引發(fā)雞胚胎死亡，且與非洲血液病有關；TEN可使多種植物產(chǎn)生萎黃?。籄OH和AME具有遺傳毒性，可能導致細胞誘變及轉化[1-3]。韓小敏等[4]通過對人食管上皮細胞Het-1 A的體外毒性研究發(fā)現(xiàn)，這4種毒素可通過抑制細胞增殖引起細胞凋亡。

目前，國內(nèi)外還沒有食品中交鏈孢霉毒素的限量標準和相應的標準檢驗方法[5]，但是在小麥、蔬菜、水果及其制品中均檢出了該類毒素[6-8]。安徽省新收割的小麥籽粒中交鏈孢霉毒素TeA檢出率為100%，最大檢出的含量為3 330.7 μg/kg[9]；在番茄醬和番茄汁中TeA檢出率為100%，在柑橘汁中也檢出TeA和AME[10]；在市售的新鮮櫻桃和櫻桃醬中4種毒素均有檢出，新鮮櫻桃中TeA最高含量為236.58 μg/kg[11]。隨著全球氣候的加速轉變以及環(huán)境污染的加重，糧食作物等受到真菌污染的概率越來越大，霉菌污染糧食已經(jīng)成為全球性的問題[12]。玉米是三大主糧之一，我國已經(jīng)成為全球玉米第二生產(chǎn)大國[13]。玉米作為畜禽飼料的主要原料，其生產(chǎn)安全在動物性食品供應中起到關鍵作用。目前對玉米毒素的研究主要集中于黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮，對交鏈孢霉毒素的研究較少，因此建立相應的檢測方法并對玉米及其相關食品的安全進行調查非常重要。

交鏈孢霉毒素的測定方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-17]。超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)具有更高的分離能力、選擇性和靈敏度，近年來受到廣泛關注。作者通過超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法結合固相萃取前處理技術，建立了玉米中4種交鏈孢霉毒素(TeA、AOH、TEN和AME)的測定方法，研究了不同淋洗液與洗脫液的組合對目標化合物加標回收率的影響，并用于實際樣品測定。

1 材料和方法

1.1 材料

TeA、AOH、TEN、AME標準品溶液購自ROMER Labs，規(guī)格分別為100.9、100.3、100.5、100.3 mg/L乙腈溶液；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑為分析純，試驗用水均為超純水。

玉米粒(10份)、玉米面(10份)、玉米糝(17份)、玉米碴(10份)購自鄭州市超市及農(nóng)貿(mào)市場，采集時間為2018年10月。采樣后用研磨機粉碎、過篩，置于-20 ℃下避光保存，待測。

1.2 儀器與設備

LC-30 A超高效液相色譜儀：日本Shimadzu公司；QTRAP 6500三重四極桿串聯(lián)質譜儀：美國AB SCIEX公司；Multi Reax振蕩器：德國Heidolph公司；SORVALL LYNX 6000高速落地離心機：美國Thermo Fisher公司；N-Evap 112氮吹儀：美國Organomation公司；Milli-Q A10 超純水器：美國Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg，6cc)、XBridge BEH C18色譜柱：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5 g(精確至0.01 g)待測樣于50 mL離心管中，加入25 mL提取液(V0.05 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH3.0)∶V甲醇∶V乙腈=45∶10∶45)，渦旋30 s后振蕩提取60 min。4 ℃低溫離心(10 000 r/min)，取上清液5 mL加入15 mL磷酸二氫鈉緩沖液稀釋，混合均勻，離心，待凈化。HLB固相萃取柱預先用5 mL甲醇和5 mL水活化，將樣品稀釋液全部過柱，用5 mL 20%甲醇水溶液淋洗，抽干后用6 mL含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,體積比)混合液洗脫小柱。洗脫液在40 ℃的氮氣流下吹至近干，殘渣用1 mL 10%甲醇水溶液復溶，渦旋30 s后，離心，上清液供UPLC-MS/MS分析。

1.3.2 標準工作溶液的配制

標準工作曲線：準確移取適量標準品儲備溶液，用乙腈配制成TeA、AOH、TEN為500 μg/L，AME為50 μg/L的混合標準溶液，最后用10%甲醇稀釋配制系列標準溶液，TeA、AOH、TEN質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，AME質量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L。

基質匹配工作曲線：取陰性玉米樣品，用1.3.1方法處理得到空白基質溶液，取適量混合標準溶液，用空白基質溶液稀釋配制基質匹配工作曲線，其中TeA、AOH、TEN質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，AME質量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L。

1.3.3 液相條件

色譜柱：XBridge BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.5 mL/min；流動相(A)1.0 mmol/L碳酸氫銨水溶液和(B)甲醇；梯度洗脫：0～1.0 min，5%B；1.0～1.5 min，5%-75%B；1.5～2.0 min 75%-90% B；2.0～4.0 min，90%B；4.0～4.2 min，95%-5%B；4.2～9.0 min，5%B。

1.3.4 質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源，負離子模式(ESI-)；質譜掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；離子化電壓：-4 500 V；氣簾氣(Curtain Gas)：241.3 kPa；溫度：550 ℃；噴霧氣(Gas1)：344.7 kPa；輔助加熱氣(Gas 2)：413.7 kPa；碰撞氣：Medium。4種交鏈孢霉毒素的質譜參數(shù)見表1。

表1 交鏈孢霉毒素的質譜采集參數(shù)

2 結果與討論

2.1 色譜和質譜條件的優(yōu)化

TeA是一元酸類化合物(pKa=3.5)，與AOH和AME極性相差較大，需要選擇合適的分離條件[18]。研究了CORTECS C18、BEH C18、HSS T3和XBridge BEH C184種色譜柱，以及甲醇-1.0 mmol/L氨水和甲醇-1.0 mmol/L碳酸氫銨水溶液分別作為流動相對4種毒素分離和檢測的影響。結果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-1.0 mmol/L氨水作為流動相，使用CORTECS C18和HSS T3色譜柱，TeA峰形拖尾；使用BEH C18色譜柱，TeA保留能力差，出峰太快，目標化合物的電離易受影響。甲醇-1.0 mmol/L碳酸氫銨做流動相，使用BEH C18色譜柱，4種化合物峰形均出現(xiàn)拖尾的情況；分別使用HSS T3和XBridge BEH C18色譜柱時4種交鏈孢霉毒素的峰形較好?？紤]到HSS T3柱pH值(2～8)耐受范圍較窄，而XBridge BEH C18柱pH值(2～12)適用范圍廣，最終選用XBridge BEH C18做分離柱，甲醇-1.0 mmol/L碳酸氫銨做流動相。

通過流動注射泵直接進樣的方式，在ESI-模式下進行一級質譜分析，對去簇電壓和錐孔電壓進行優(yōu)化，確定準分子離子峰。接著進行目標離子二級質譜掃描，優(yōu)化碰撞電壓和碰撞室出口電壓，得到碎片離子。選擇穩(wěn)定性好、豐度高的兩個碎片離子分別作為定性離子和定量離子，并以豐度最強，響應最高的離子作為定量離子，見表1。

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化

固相萃取過程中淋洗液及洗脫液的溶劑種類和比例對試驗結果影響很大[10-11]，分別優(yōu)化了3種淋洗方式和兩種洗脫方式。淋洗：(1)依次用5 mL 20%甲醇、5 mL含1%甲酸的20%甲醇水溶液和5 mL水淋洗；(2)用5 mL含1%甲酸的20%甲醇水溶液淋洗；(3)用5 mL 20%甲醇水溶液淋洗。洗脫：(1)用5 mL甲醇和5 mL乙腈依次洗脫；(2)用6 mL含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,體積比)混合溶液洗脫。

試驗結果見表2。采用淋洗方式3與洗脫方式1組合，發(fā)現(xiàn)TeA和TEN的回收率滿足要求，AOH和AME回收率較差；采用淋洗方式3與洗脫方式2組合，AOH和AME回收率均達到70%以上。當采用淋洗方式1與洗脫方式2組合時，發(fā)現(xiàn)AOH和AME也能滿足要求，但是結果穩(wěn)定性較差。故而確定20%甲醇水溶液為淋洗液，含1%氨水的甲醇/乙腈(50∶50,體積比)混合溶液為洗脫液。

表2 不同固相萃取處理方法對4種交鏈孢霉毒素回收率的影響

進一步研究了洗脫液體積對試驗結果的影響。取5 mL空白基質溶液，向其中加入適量標準溶液(TeA、AOH、TEN為100 μg/kg，AME為10 μg/kg)，稀釋后上樣、凈化，用10 mL洗脫液分5次對小柱進行洗脫，每次2 mL，分別收集洗脫液，氮吹，定容到2.0 mL，上機檢測。結果顯示，第4次和第5次的洗脫液中不含任何待測物，說明6 mL洗脫液可以把樣品完全洗脫出來。

2.3 方法評價

對分析方法的特性進行了評估，結果見表3。TeA、AOH、TEN在1.0～100.0 μg/L、AME在0.1～10.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系(r>0.999)。檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以信噪比為3∶1和10∶1進行計算。

表3 分析方法的特性

為確定方法的準確性，對4種化合物進行了低、中、高三水平加標回收率測定，每個加標水平下平行測定6次，計算相對標準偏差(RSD)，結果見表4。4種化合物的平均回收率為78.4%～100.3%，RSD≤8.9%，表明該方法對玉米中4種交鏈孢霉毒素的測定具有較高的回收率和精密度，準確可靠。

表4 玉米樣品中4種交鏈孢霉毒素的回收率和精密度(n=6)

2.4 基質效應

基質效應由基質匹配工作曲線與溶劑標準曲線的斜率之比進行計算[19]。由表3可知，4種毒素都有基質抑制效應，當基質效應導致信號變化大于20%時，基質效應不可忽略，而AOH和AME信號降低50%以上(圖1)，為了得到準確的結果，采用基質匹配工作曲線進行校正。

注：A為10%甲醇，B為空白；TeA、AOH、TEN為50 μg/L，AME為5 μg/L；色譜峰1—4分別為TeA、AOH、TEN、AME。

2.5 樣品測定結果及污染情況分析

對47份玉米樣品進行檢測，4種交鏈孢霉毒素均有檢出，測定結果見表5。有66.0%(31/47)的樣品至少受一種毒素污染，TeA、AOH、TEN和AME檢出率分別為23.4%、10.6%、4.3%和63.8%。TeA檢出的含量最高，為32.51 μg/kg。4種毒素平均含量為TeA>AOH>AME>TEN，Zhao等[20]報道小麥粉中4種毒素平均含量為TeA>AOH>TEN>AME，其中TEN的含量為16.0～98.7 μg/kg，而本次研究共采集47份玉米樣品，TEN的檢出率較低，平均含量為1.04μg/kg，可見該毒素在玉米中的污染情況和小麥有所不同。由表6可知，不同顆粒大小的玉米樣品AME毒素檢出率分別為玉米面100%、玉米糝88.2%、玉米碴30%、玉米粒20%，可見玉米面、玉米糝與玉米粒、玉米碴相比，毒素檢出率較高。此外，受4種毒素污染最為嚴重的是玉米面，其中TeA檢出率為90%，平均值為8.85 μg/kg；AME檢出率為100%，平均值為2.65 μg/kg。谷物粉碎后，沒有了表皮的保護，在適宜的環(huán)境下，霉菌很容易生長繁衍。因此糧食在收割及儲藏時盡量保持顆粒完整，且入庫前降到安全水分(≤14%)，降低儲藏濕度、溫度，以降低霉變風險[21]。

表5 玉米樣品中4種交鏈孢霉毒素的檢出情況(n=47)

表6 不同種類玉米中4種交鏈孢霉毒素陽性率

3 結論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定玉米中4種交鏈孢霉毒素的分析方法，4種毒素低中高加標回收率為78.4%～100.3%，相對標準偏差≤8.9%，該方法具有較好的精密度和準確度，滿足玉米中4種交鏈孢霉毒素的檢測要求。對采集的47份玉米樣品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，有66.0%(31/47)的樣品至少受一種毒素污染。玉米中4種毒素檢出的含量為TeA>AOH>AME>TEN，TeA毒素是玉米中檢出的主要毒素，TEN污染程度最低，與小麥粉中4種毒素污染情況有所不同。與玉米粒和玉米碴這種大顆粒樣品相比，玉米面污染最為嚴重，由此推測，樣品顆粒度越小，越易受霉菌污染。