朱冬梅,胡文靜,別同德,陸成彬,趙仁慧,高德榮，2

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇揚州 225007；2.揚州大學/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚州 225009)

小麥蠟熟末期，籽粒的營養(yǎng)物質積累量最高，達到生理成熟，此后的脫水特性至關重要，關系到收獲時間、烘干晾曬成本和安全儲存。近年來，長江中下游麥區(qū)水稻直播面積擴大，導致小麥晚播現(xiàn)象嚴重[1]，收獲期經(jīng)常遇連續(xù)陰雨，籽粒水分過高易發(fā)生霉變，影響及時入庫。朱冬梅等[2]研究認為,不同小麥品種生理成熟期后的脫水速率存在差異；何賢芳等[3]認為，品種對蠟熟至收獲期小麥籽粒脫水速率有極顯著影響。因此，開展小麥籽粒生理成熟后脫水速率的遺傳機制研究，挖掘快速脫水的基因資源及相應的QTL，對培育籽粒脫水快的品種尤為迫切和重要。已報道的關于谷物籽粒脫水速率遺傳特性的研究多集中在玉米上，研究結果表明，玉米籽粒自然脫水速率是可穩(wěn)定遺傳的數(shù)量性狀，受多基因控制，廣義遺傳力較高，以加性效應遺傳為主[4-6]。學者們相繼利用各種遺傳群體定位到一些與玉米籽粒脫水速率相關的QTL[7-9]。迄今未見關于小麥籽粒脫水速率相關QTL定位的報道。

與傳統(tǒng)的雙親本定位群體RIL相比，多親本RIL群體定位 QTL具有以下優(yōu)勢:(1)多親本RIL群體中包含來源于不同親本的多個等位基因，可以發(fā)現(xiàn)不同來源的等位基因對某個性狀的影響[10-11]；(2)可選用育種中性狀優(yōu)異的材料作為親本，經(jīng)過多次重組創(chuàng)造大量的遺傳變異，群體中出現(xiàn)的優(yōu)良株系可用做育種中間材料或品系[12]。Huang等[13]構建了小麥中第一套4親本RIL群體；隨后8親本和16親本的小麥MAGIC群體也相繼構建完成[14]。水稻中，Bandillo等[15]選用育種中產(chǎn)量、抗性、米質等性狀優(yōu)異的材料作為親本構建了4套MAGIC群體。大麥、玉米等其他重要農(nóng)作物中也都完成MAGIC群體的構建[16-17]，學者們相繼利用這些多親本RIL群體進行了多個農(nóng)藝性狀的QTL定位，獲得了許多性狀優(yōu)異的育種群體，為分子標記輔助育種提供了材料和技術支撐。

揚麥16、揚麥20和揚麥22系江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所培育的小麥品種，揚麥16是近年來長江中下游推廣面積最大的小麥品種，生理成熟后籽粒脫水快[2]。鎮(zhèn)麥168是鎮(zhèn)江丘陵地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所培育的品種，籽粒脫水亦較快。本研究以鎮(zhèn)麥168、揚麥20、揚麥16和揚麥22為親本創(chuàng)建的四親本RIL群體為材料，利用小麥15K SNP芯片構建連鎖圖譜，定位小麥籽粒脫水速率的QTL，為小麥籽粒脫水性狀的研究和選育脫水快的品種提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗群體

將4 個小麥親本鎮(zhèn)麥168(Zhengmai 168,ZM168)和揚麥20(Yangmai 20,YM20)、揚麥16(Yangmai 16,YM16)和揚麥22(Yangmai 22,YM22)(表1)兩兩成對雜交(ZM168×YM20、YM16×YM22)，產(chǎn)生 2對雙親本雜交種，將 2對雙親本雜交種 F1再成對雜交產(chǎn)生四親本雜交種(ZM168/YM20//YM16/YM22)，四親本雜交種通過單粒傳法加代，自交 6 代,建成四交RIL群體,獲得 158個穩(wěn)定株系的ZM168/YM20//YM16/YM22群體。

表1 用于構建四交RIL群體的品種來源及其主要特征Table 1 Origin and agronomic characteristics of the four varieties for developing the four-way wheat population

1.2 田間設計和脫水速率測定

試驗群體及親本于2018年在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所灣頭試驗基地種植，適期播種，采用4重復隨機區(qū)組設計，每系種植3行，行長1.3 m，行距23 cm。肥料運籌為基施復合肥(N、P和K含量均為15%)800 kg·hm-1，壯蘗肥(尿素)50 kg·hm-1，拔節(jié)肥(尿素)200 kg·hm-1。開花期用多酮和吡蟲啉防治赤霉病、白粉病、蚜蟲等。其他管理與大田生產(chǎn)一致。在小麥開花期，每系選擇開花時期、穗型大小一致且無病蟲害的單穗50個掛牌標記，生理成熟期及其7 d后分別取樣，每系取10個標記的穗子，快速剝取籽粒，稱鮮重計數(shù)，在105℃下烘30 min殺青，80℃烘至恒重，計算籽粒含水率，籽粒含水率=(籽粒鮮重-籽粒干重)/籽粒鮮重×100%。前期試驗結果表明，所有系的籽粒水分含量從生理成熟期降至13%時的最短時間間隔是7 d。

脫水速率(%)=(生理成熟期籽粒含水率- 7 d后籽粒含水率)/7。

1.3 SNP基因型和群體結構分析

采用中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所與中玉金公司合作開發(fā)的小麥15K SNP芯片對試驗群體及親本進行基因型分析，按以下 3 個步驟過濾 SNP 基因型數(shù)據(jù),一是將所有雜合基因型作為缺失數(shù)據(jù),刪除缺失率10%以上標記數(shù)據(jù)的株系; 二是剔除所有稀有等位基因頻率低于3%的標記; 三是刪除標記間相關性很高(在0.95 以上)的關聯(lián)標記。使用 TASSEL V5.2.3 軟件評估群體結構,由主成分分析(principal components analysis,PCA)中的 PC1 和 PC2 來揭示。

1.4 數(shù)據(jù)分析和 QTL 定位

使用 SAS V9.2(SAS Institute Inc. Cary NC,USA) PROCGLM對試驗群體和親本的表型進行統(tǒng)計分析。利用GAPL軟件(http://www.isbreeding.net)[18-19]對群體進行連鎖作圖和QTL定位；以LOD=2.5為閾值確定與小麥脫水速率顯著相關的QTL。QTL的命名方法為“Q”加性狀縮寫，加單位名稱縮寫，加QTL所在的染色體，同一染色體上多個QTL用.1、.2、.3……來表示。為了與前人結果比較，將連鎖標記或者基因的序列與中國春在Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/)中的參考基因組序列進行比對，獲得標記或者基因的物理位置。

2 結果與分析

2.1 親本及群體的脫水速率表現(xiàn)

由表2可以看出，揚16和鎮(zhèn)麥168的平均脫水速率顯著高于揚麥20和揚麥22，群體脫水速率的最小值和最大值之間差異明顯，與親本的表型值相比存在超親分離。統(tǒng)計分析表明，脫水速率的遺傳力是0.85，群體的偏度和峰度絕對值均小于1，分布呈連續(xù)的正態(tài)分布。

表2 親本和群體的脫水速率表型值統(tǒng)計分析Table 2 Statistic analysis of dehydration rate for the parents and population

2.2 SNP分析和群體結構

過濾15K SNP基因型數(shù)據(jù)，最終在群體中得到2 761個高質量 SNP 位點用于群體結構分析，主成分分析結果表明，群體的 PC1 和 PC2分別是5.9%和5.8%,沒有表現(xiàn)出明顯的群體結構(圖1)。

圖1 群體的主成分分析結果

2.3 連鎖作圖

利用過濾后得到的2 761個高質量SNP位點，經(jīng)過GAPL(http://www.isbreeding.net)的SNP功能剔除無效標記和BIN功能去冗余分析后，得到672個SNP標記構建連鎖圖譜。圖譜覆蓋小麥21條染色體，長度為13 167.1 cM，標記間平均距離是19.6 cM。分布于小麥A、B和D染色體組的標記數(shù)分別為273、241和158個，連鎖長度分別為5 361.8、4 744.0和3 061.3cM。

2.4 脫水速率 QTL 定位

共檢測到12個與脫水速率顯著相關的QTL(圖2，表3)，將連鎖標記序列與中國春的EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/)參考基因組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)12個QTL分布在1AL(2)、2AL、3BS、3BL、4AS、5BL、6DL、7AL、7BS、7BL和7DS上，其中，脫水速率增效基因QDR-yaas-6DL、QDR-yaas-1AL.1和QDR-yaas-3BL僅來自揚麥16(加性效應為正)，分別位于6D染色體的445.8～450.7 Mb、1A染色體的519.3～521.3 Mb和3B染色體的493.1～493.6 Mb 處，LOD值分別是2.9、3.9和3.1，可解釋表型變異率的8.1%、7.6%和2.8%。脫水速率增效基因QDR-yaas-1AL.2、QDR-yaas-2AL、QDR-yaas-4AS和QDR-yaas-7DS僅來自鎮(zhèn)麥168(加性效應為正)，分別位于1A 染色體的 563.3～ 589.7 Mb、2A染色體的697.4～698.2 Mb、4A染色體的 23.2～26.0 Mb和7D染色體的 72.5～ 75.2 Mb，LOD值分別是2.5、3.0、2.6和2.7，可解釋表型變異率的3.6%～4.2%。脫水速率增效基因QDR-yaas-5BL僅來自揚麥20(加性效應為正)，位于5B染色體的682.7～ 685.3 Mb，LOD值是2.7，可解釋表型變異率 5.4%。脫水速率增效基因QDR-yaas-3BS和QDR-yaas-7BS同時來自揚麥20和揚麥16(加性效應為正)，分別位于3B染色體的15.2～15.7 Mb、7B染色體的124.1～135.0 Mb，LOD值分別是3.4和3.8，可解釋表型變異的3.2%和 3.8%。QDR-yaas-7AL和QDR-yaas-7BL脫水速率增效基因同時來自鎮(zhèn)麥168和揚麥16(加性效應為正)，分別位于7A染色體的593.5～611.5 Mb、7B染色體的692.9～693.2 Mb，LOD值分別是4.3和3.3，可解釋的表型變異的4.8%和5.9%。

虛線表示LOD閾值=2.5。

表3 群體中檢測到的脫水速率相關QTLTable 3 Quantitative trait loci(QTLs) for dehydration rate in population

3 討 論

3.1 同類QTL的研究比較

前人研究玉米籽粒脫水遺傳特性，發(fā)現(xiàn)籽粒脫水速率與一些其他性狀相關。如Capelle 等[20]測定了玉米29個性狀共找到了 78個QTL，其中與玉米籽粒脫水相關的QTL位點43個，控制ABA含量有關的QTL位點20個，有10個位點在控制ABA含量與控制水分的QTL間具有共線性。向 葵[21]整理了已發(fā)表的玉米籽粒含水量 QTL和抗穗粒腐病性QTL的文獻，利用元分析方法找到了 14 個“一致性”QTL 位點。國內外關于小麥籽粒脫水速率相關QTL的定位研究未見報道，本研究首次利用小麥四交RIL群體定位出12個與小麥籽粒脫水速率相關的QTL，我們后續(xù)將對該群體與脫水速率顯著相關農(nóng)藝性狀(如灌漿速率、千粒重)和抗病QTL進行深一步研究，以期明確小麥籽粒生理成熟后與脫水相關的一些性狀的分子遺傳機理。

3.2 QTL的遺傳分析

揚麥16和鎮(zhèn)麥168均表現(xiàn)脫水速率快。本研究定位結果顯示，揚麥16中對脫水速率增效的QTL有7個，鎮(zhèn)麥168中對脫水速率增效的QTL有6個，其中來自揚麥16的QDR-yass-6DL對脫水速率的貢獻率最大，為8.1%。揚麥16的組合是揚麥158優(yōu)系(91F138)/揚90-30，鎮(zhèn)麥168的組合是蘇麥6號/揚97G59(揚97G59是揚麥158的抗白粉病回交系)，已有研究表明，揚麥158成熟后期籽粒脫水較快[2]，因此推測揚麥158對鎮(zhèn)麥168與揚麥16的脫水性狀有一定貢獻。揚麥20脫水速率慢，QTL定位結果表明其對脫水速率增效的QTL有3個，揚麥20的組合是揚麥10號/揚麥9號，揚麥10號是以揚麥158為輪回親本育成的抗白粉品種，推測揚麥158為揚麥20貢獻了較少的對脫水速率增效的基因。說明小麥籽粒脫水速率屬于多基因控制的復雜數(shù)量性狀，在遺傳背景的影響下，脫水速率慢的材料中也會存在增效基因。

3.3 QTL的有效性分析

由于本研究所用芯片通量不高，造成在群體中呈現(xiàn)多態(tài)的標記數(shù)量有限，所定位的置信區(qū)間較大，因而無法有效實現(xiàn)脫水速率相關QTL的剖析,使得多親本群體在基因定位上的優(yōu)越性受到一定程度的制約。已有研究表明，玉米籽粒脫水速率是數(shù)量性狀，不僅受遺傳因素影響和后期環(huán)境因素影響，還受2者互作效應的影響，因此在不同產(chǎn)區(qū)測出的結果不盡相同[22]。本研究選擇在揚州點進行1年小麥四交RIL群體籽粒生理成熟后脫水速率測定及相關QTL定位，可以作為一個初級定位結果，其有效性和穩(wěn)定性還有待進一步試驗。為此本研究小組在2019年已經(jīng)對該四交RIL群體增加了相對環(huán)境較穩(wěn)定易控制的溫室評價，以驗證初定位的結果，并且正在利用小麥參考基因組序列，針對目標區(qū)域開發(fā)分子標記，增加圖譜密度，對目標QTL區(qū)域進一步精密定位和驗證。

4 結 論

本研究在四親本RIL群體中共檢測到與小麥籽粒脫水速率相關的QTL 12個，多數(shù)脫水速率快的QTL來源于揚麥16和鎮(zhèn)麥168，其中來源于揚麥16的QDR-yaas-6DL、QDR-yaas-1AL.1效應較大；發(fā)現(xiàn)小麥籽粒脫水速率性狀存在超親分離現(xiàn)象。本研究為小麥生理成熟后籽粒脫水性狀的深入研究奠定基礎。

致謝:感謝中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所數(shù)量遺傳課題組張魯燕研究員提供GAPL軟件并在進行四親本RIL群體定位QTL中給予指導。