田小萍，王光浩，張 宏,2，吉萬全,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制陜西科學(xué)觀測實驗站，陜西楊凌 712100)

小麥灌漿速率以及產(chǎn)量相關(guān)性狀是由多個基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段，對籽粒灌漿相關(guān)基因進(jìn)行研究具有重要意義[1-2]，但是對于小麥灌漿方面的研究進(jìn)展較為緩慢。

蔗糖不僅是植物體內(nèi)碳水化合物運(yùn)輸?shù)闹饕问?，而且越來越多的證據(jù)表明，蔗糖可以在基因表達(dá)水平上對細(xì)胞內(nèi)的代謝進(jìn)行調(diào)控[3-4]。蔗糖只有被轉(zhuǎn)化為己糖才能夠被利用，這一過程主要受蔗糖合成酶(sucrose synthase,SS)和蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase,INV)的催化。INV根據(jù)其酸堿度及亞細(xì)胞定位可分成3類，即中性/堿性的細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶(cytoplasmic invertase,CIN)，酸性的細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶(cell wall intertase,CWIN)和液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶(vacuole intertase,VIN)[5]。CWIN屬于INV的一種，以離子鍵形式結(jié)合于細(xì)胞壁上，不可逆地催化蔗糖轉(zhuǎn)化成果糖和葡萄糖，是蔗糖卸載的關(guān)鍵酶之一[6-7]，同時，CWIN還決定了種子中碳水化合物的組成及其發(fā)育的命運(yùn)[8]。因此，研究小麥中的INV基因?qū)沂拘←溕L發(fā)育過程中的基因調(diào)控和小麥籽粒灌漿相關(guān)機(jī)制具有重要意義。

GIF1是首次從水稻中通過圖位克隆獲得的，參與水稻灌漿的關(guān)鍵基因[9]。該基因編碼一個CWIN，在發(fā)育籽粒背部的維管束中特異表達(dá)，轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明該基因?qū)λ井a(chǎn)量起正向調(diào)控作用[10]。GIF1基因在植物中通過調(diào)控胚和胚乳中糖的組分，決定種子發(fā)育最終的命運(yùn)[8,11]。玉米CWIN活性調(diào)節(jié)因子ZMMRP-1特異表達(dá)于玉米胚乳轉(zhuǎn)移層細(xì)胞，該過程主要通過糖來調(diào)控，從而調(diào)控下游轉(zhuǎn)運(yùn)基因[12]，同時也是參與細(xì)胞壁組裝和生長的關(guān)鍵酶[13]；超表達(dá)該基因可使穗增大，籽粒直徑增大，穗粒數(shù)增多，從而使玉米產(chǎn)量上升[14]。GIF1基因在水稻、玉米等作物中對調(diào)控籽粒灌漿有重要作用，而在小麥中未見報道。對小麥中TaGIF1基因的研究有利于進(jìn)一步加深對小麥灌漿調(diào)控機(jī)制的了解。本研究首次在小麥中克隆得到TaGIF1-2A基因，通過比較不同大小粒小麥品種中TaGIF1-2A基因組序列，分析該基因單倍型，并對不同單倍型編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，以期為研究該基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)；同時在大、小粒材料中分別克隆該基因啟動子序列，進(jìn)行啟動子元件的分析；利用qRT-PCR技術(shù)檢測了該基因在幼穗、籽粒及穎殼中的表達(dá)模式；通過構(gòu)建PE-TaGIF1-GFP融合表達(dá)載體，觀察基因亞細(xì)胞定位。對小麥大小粒材料中該基因可能發(fā)揮的功能進(jìn)行了探討，為深入研究TaGIF1基因在籽粒灌漿期的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全國不同地區(qū)大粒材料10份(品冬34、小偃54、西昌19、長麥5973、濟(jì)麥22、中麥875、山農(nóng)8355、西科麥6號、內(nèi)鄉(xiāng)5號、周8425B)，平均千粒重大于50 g；小粒材料5份(陜麥159、合作4號、西農(nóng)509、克豐3號、新冬26號)，平均千粒重25 g左右，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。在2018年小麥生育期內(nèi)，取大田種植的品冬34(千粒重74 g)和陜麥159(千粒重32 g)幼穗、籽粒和穎殼樣品，所取幼穗的生育時期和大小包含拔節(jié)期1～2 cm、孕穗期4～7 cm、抽穗期；籽粒采自花后3、6、9、12和15 d(days after anthesis,DAA)；穎殼樣品包含3、6、12、15 DAA的組織。在冰上迅速剝離樣品幼穗、籽粒和穎殼，在液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?，每個樣品設(shè)置3次重復(fù)。本氏煙草，以及亞細(xì)胞定位載體PE-GFP由(西北農(nóng)林科技大學(xué))陳新宏老師實驗室饋贈。

1.2 基因組DNA、總RNA的提取與cDNA的 合成

采用CTAB法[15]提取所有15份大小粒材料的基因組DNA。此外，利用TRIzol試劑盒提取品冬34和陜麥159的總RNA，經(jīng)DNase I純化后用滅菌的DEPC H2O溶解，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用Takara公司產(chǎn)品PrimeScript II進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3 小麥 TaGIF1-2A基因的克隆

以大粒品種品冬34和小粒品種陜麥159的cDNA為模板，TaGIF1-F/R(表1)為引物，利用TaKaRa公司的PrimeSTAR HS高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序為98 ℃ 10 s，58 ℃ 5 s，72 ℃ 3 min，循環(huán)34次，72 ℃延伸5 min。結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA end，RACE)，設(shè)計TaGIF1-3′GSP和TaGIF1-5′GSP特異引物，進(jìn)行TaGIF1-2A基因cDNA全長擴(kuò)增。以15份大、小粒小麥品種的基因組DNA為模板，利用TaGIF1-F/R(表1)引物和前反應(yīng)程序一樣，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于TaGIF1-2A基因的單倍型分析。PCR產(chǎn)物的回收純化、轉(zhuǎn)化鑒定和測序等參照程 嬌等[2]的方法 進(jìn)行。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in experiment

1.4 TaGIF1基因啟動子的克隆

利用測序獲得的TaGIF1-2A序列，比對到URGI(Unité de Recherches en Génomique Info)數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)的物理位置，選取起始密碼子上游約2 500 bp的啟動子序列，設(shè)計TaGIF1-promoter F/R引物分別以品冬34和陜麥159基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為 98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 3 min，循環(huán)34次，72 ℃延伸5 min。

1.5 生物信息學(xué)分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)在線軟件ORF Finder分析基因序列獲得完整開放閱讀框，使用Primer Premier 5.0軟件翻譯為氨基酸序列，登陸網(wǎng)站ExPASy Compute pI/Mw(https://www.expasy.org/resources)對編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測和分析；蛋白的保守結(jié)構(gòu)域通過NCBI Conserved Domain Search分析獲得；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析；信號肽預(yù)測分析通過TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 3.0)進(jìn)行；采用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)分析蛋白疏水性/親水性；利用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；用NCBI的BLAST程序進(jìn)行TaGIF1蛋白同源序列的比對搜索。使用MEGA 7.0軟件中Cluster進(jìn)行序列比對，然后用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(BootStrap=1000)。通過PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)進(jìn)行啟動子順式作用元件的預(yù)測。

1.6 實時熒光定量PCR

基于克隆得到的TaGIF1-2A以及URGI數(shù)據(jù)庫中TaGIF1-2B、TaGIF1-2D同源基因序列，分別設(shè)計?；远恳镞M(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析，內(nèi)參基因使用持家基因TaActin(表1)。參照FastKing RT Kit(With gDNase)(TIANGEN公司)試劑盒說明書，采用兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時熒光定量PCR采用TIANGEN試劑公司的SuperReal熒光定量預(yù)混試劑盒(SYBR Green)，于Q7實時定量PCR儀上進(jìn)行操作。同時將TaGIF1-2A核酸序列提交至多倍體小麥表達(dá)分析數(shù)據(jù)庫WheatExp中，以Zadoks[16]和Choulet等[17]方法計量小麥生育時期。最終分析TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D在小麥幼穗、籽粒及穎殼發(fā)育階段的表達(dá)模式。基因的相對表達(dá)量使用2-△△Ct方法計算，將第一個取樣時間點(diǎn)的相對表達(dá)量作為參照。

1.7 煙草轉(zhuǎn)化法

用含有同源臂的GFP引物擴(kuò)增TaGIF1-2A基因的全長CDS序列，并與用Spe I單酶切的線性化載體PE::GFP進(jìn)行重組反應(yīng)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行小量培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101(本實驗室保存)。將含有重組質(zhì)粒PE-TaGIF1-GFP的農(nóng)桿菌28 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，1 788.8 r·min-1離心5 min收集菌體，重懸于滲透緩沖液(10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-12-(N-嗎啉代)乙磺酸，pH 5.6和200 μmol·L-1乙酰丁香酮)[18]中，調(diào)整菌液濃度使其達(dá)到OD600= 0.6左右，室溫靜置3 h。利用本氏煙草開展瞬時轉(zhuǎn)化，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察、照像，檢測波長為488 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及命名

以品冬34、陜麥159的cDNA為模板，利用特異引物序列TaGIF1-F/R(表1)對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在2 000 bp處得到與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖1-A)。經(jīng)切膠回收測序，將所得序列與URGI中對應(yīng)的TraesCS2A02G295400、TraesCS2B02G311900、TraesCS2D02G293200序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示與TraesCS2A02G295400最為接近，只存在4個SNP差異位點(diǎn)，相似度高達(dá)99.8%，將其命名為TaGIF1-2A。TaGIF1-2A與TraesCS2B02G311900、TraesCS2D02G293200通過比對分析，相似度分別為96.5%、97%，將其分別命名為TaGIF1-2B、TaGIF1-2D?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，TaGIF1-2A編碼區(qū)為1 986 bp，編碼661個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為73.87 kD，等電點(diǎn)為9.14；TaGIF1-2B編碼623個氨基酸，相對分子質(zhì)量69.73 kD，等電點(diǎn)9.28；TaGIF1-2D編碼620個氨基酸，相對分子質(zhì)量 69.31 kD，等電點(diǎn)9.21。因A、B、D基因組中該基因都含有7個外顯子和6個內(nèi)含子(圖1-B)，且結(jié)構(gòu)域高度保守，選取含有最長ORF的TaGIF1-2A基因，進(jìn)一步利用其CDS序列設(shè)計TaGIF1-3′GSP、TaGIFI-5′GSP特異引物，利用RACE技術(shù)得到237 bp的 5′ UTR和262 bp的3′ UTR區(qū)，最終獲得小麥TaGIF1-2A基因的全長cDNA序列。

M:Marker DL2000; 1: TaGIF1-2A

2.2 TaGIF1蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域分析

利用TargetP 1.1 Server和SignalP 3.0分析發(fā)現(xiàn)TaGIF1蛋白質(zhì)無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。蛋白疏水性/親水性分析結(jié)果表明，位于多肽鏈的第87位的纈氨酸(Val)具有最高的分值2.444，疏水性最強(qiáng)；第368位的賴氨酸(Lys)具有最低的分值-2.656；其次是第367位的精氨酸(Arg)，為-2.556，均屬于親水性氨基酸，多肽鏈整體上顯示親水性。進(jìn)一步比較水稻(XP_015633534.1)、擬南芥(AT3G52600)中相應(yīng)多肽鏈的親水性和疏水性，結(jié)果均顯示親水特性。由此得出TaGIF1蛋白屬于親水性蛋白。

TaGIF1蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白含有1個典型的Glyco_32保守結(jié)構(gòu)域(圖2A)，分布在129～612位氨基酸之間，TaGIF1-2B、TaGIF1-2D蛋白也含有該保守結(jié)構(gòu)域，其與水稻、擬南芥[19]等植物中相應(yīng)編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域一致，均屬于INV Glyco_32家族。SOPMA 預(yù)測結(jié)果表明(圖2B)，該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由3種形式組成，其中，無規(guī)則卷曲所占比例達(dá)到 50.98%，延伸鏈占24.51%，α-螺旋占18.31%，β-折疊僅占6.20%。

A:TaGIF1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域; B:TaGIF1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。圖中α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)分別用藍(lán)、紅、綠、紫色線表示。

為進(jìn)一步分析TaGIF1基因的蛋白結(jié)構(gòu)域，選取幾種禾本科C3植物的CWIN蛋白序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對并分析。結(jié)果(圖3)顯示，TaGIF1蛋白含有典型的β-fructosidase結(jié)構(gòu)域、Cys催化域和保守的糖基化位點(diǎn)。

XP_020182900.1:Aegilops tauschii; AWT08285.1:Secale cereale; CAD58960.1:Hordeum vulgare; XP_003579704.1:Brachypodium distachyon; OsGIF1:Oryza sativa; Mn1:Zea mays; ATCWINV2:Arabidopsis; LIN5:Solanum lycopersicum;Inv*Dc1:Daucus L.

2.3 TaGIF1蛋白序列一致性分析

利用NCBI-BlastP進(jìn)行序列一致性比對后發(fā)現(xiàn)，小麥TaGIF1-2A蛋白與其他物種的Glyco_32家族結(jié)構(gòu)域高度同源，與粗山羊草(Aegilopstauschii)、黑麥(Secalecereale)、大麥(Hordeumvulgare)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的氨基酸序列一致性在86%～97%之間，其中，與黑麥(AWT08285.1)和粗山羊草(XP_020182900.1)的序列一致性最高，為97%(圖3)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明(圖4)，普通小麥的TaGIF1-2A蛋白與黑麥、粗山羊草處于同一分支，其中與黑麥的親緣關(guān)系最近；擬南芥(AT3G52600)、煙草(XP_019225095.1)等植物處于另一分支，普通小麥與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；與木本植物棉花(XP_012441627.1)、可可(XP_017976223.1)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖4 基于NJ法構(gòu)建TaGIF1蛋白與其同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 TaGIF1基因單倍型分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一個3 000 bp以上的DNA片段，將PCR產(chǎn)物回收純化后連接至pMD_19T Vector載體上，各挑取3個陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定。測序結(jié)果用軟件BioEdit分析，最終得到3 708 bp的TaGIF1-2A基因完整gDNA序列。

通過比較15份小麥品種TaGIF1-2A基因組序列，共發(fā)現(xiàn)21個SNP差異位點(diǎn)，9個位于編碼區(qū)，12個位于非編碼區(qū)(表2)。SNP分組發(fā)現(xiàn)，15份小麥品種中TaGIF1-2A基因共存在8種單倍型。8種單倍型編碼的氨基酸存在2個變異位點(diǎn)，氨基酸變異位點(diǎn)對應(yīng)于第6和第7個SNP位點(diǎn)，其余SNP位點(diǎn)未引起氨基酸的改變。

表2 單倍型多態(tài)性分析Table 2 Analysis of haplotype polymorphism

2.5 啟動子序列的克隆與功能分析

以大小粒材料的基因組DNA為模板進(jìn)行TaGIF1-2A基因啟動子序列的克隆，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序獲得2 141 bp的序列。利用PlantCARE對品冬34和陜麥159啟動子分析得出，序列中不僅含有啟動子基本元件，如與真核生物RNA聚合酶Ⅱ識別和轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)的TATA-box和CAAT-box，還包含多個順式作用元件(圖5)。品冬34和陜麥159都含有與激素相關(guān)的順式作用元件ABRE、TATC-boxes、as-1、MYb，與生長發(fā)育有關(guān)的作用元件CGTCA-motif、TGACG-motif，對低氧特異誘導(dǎo)的GC-motif元件，與逆境響應(yīng)相關(guān)的MYB、Myb-biding site、MYC、DRE、MBS元件，以及光響應(yīng)元件chs-CMA2a、G-box(表3)。

表3 啟動子序列中的順式作用元件及功能Table 3 Cis-acting elements and their functions in the promoter sequence

通過比對品冬34和陜麥159啟動子區(qū)序列發(fā)現(xiàn)，兩者共有19個SNP差異。品冬34順式作用元件數(shù)量和種類較陜麥159多，如參與ABA響應(yīng)的元件ABRE、ABRE3a，參與光響應(yīng)的作用元件G-box，以及品冬34特有的參與ABA響應(yīng)的作用元件AT～ABRE。該結(jié)果說明，參與小麥早期灌漿的TaGIF1-2A基因在大粒小麥品種中的活性可能強(qiáng)于小粒品種，即在早期灌漿階段大粒品種中該基因的響應(yīng)可能強(qiáng)于小粒。

2.6 TaGIF1灌漿期表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步研究TaGIF1在小麥灌漿期發(fā)揮的作用，分別對品冬34與陜麥159中的TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析。結(jié)果顯示，在品冬34與陜麥159的不同時期，A組基因表達(dá)量均最高，其次是D組，B組表達(dá)量最低(圖6)。從拔節(jié)期到抽穗期的幼穗中，品冬34(圖6A)與陜麥159中(圖6B)的TaGIF1-2A、TaGIF1-2D都呈現(xiàn)出逐漸上調(diào)的表達(dá)模式，而TaGIF1-2B的表達(dá)變化都不明顯；另外，在陜麥159中，TaGIF1-2A、TaGIF1-2D表達(dá)量相近，而在品冬34中，TaGIF1-2A表達(dá)量明顯高于TaGIF1-2D。

在3～15 DAA的籽粒中，品冬34與陜麥159 的TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D，都呈現(xiàn)逐漸下調(diào)的表達(dá)模式，其中，在3 DAA表達(dá)量最高，6 DAA其次，到9 DAA時，表達(dá)量劇烈下調(diào)，之后趨于平穩(wěn)。品冬34中TaGIF1-2A的下調(diào)幅度高于陜麥159。無論大小粒品種，雖在不同時期表達(dá)量有差異，但TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D基因的整體表達(dá)模式都 相近。

A:品冬34；B:陜麥159。

在穎殼中，品冬34(圖6C)的TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D在6 DAA有最高的表達(dá)量，然后下調(diào)表達(dá)；在陜麥159(圖6D)中，TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D在3 DAA有最高表達(dá)，然后逐漸下調(diào)。雖然TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D在籽粒、穎殼中均表達(dá)，但其轉(zhuǎn)錄水平在各個時期并不相同，推測在不同生育期的物質(zhì)合成過程中，TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D參與調(diào)控的作用可能不同。

將克隆得到的TaGIF1-2A核酸序列提交至多倍體小麥表達(dá)分析WheatExp轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，采用Zadoks[16]方法計量小麥生育時期。選取中國春小麥基因Traes_2AL_6DEEE3C3E.2、Traes_2BL_3EDC425A7.2、Traes_2DL_1B3AD9F4E.1在不同生育時期的幼穗和籽粒中的相對表達(dá)量數(shù)據(jù)，進(jìn)行該基因表達(dá)模式分析。結(jié)果顯示在拔節(jié)期、孕穗期直至開花期，該基因呈逐漸上調(diào)的表達(dá)趨勢；籽粒在2 DAA的表達(dá)量最高，在14～30 DAA表現(xiàn)為急劇下調(diào)的表達(dá)趨勢。雖然Traes_2AL_6DEEE3C3E.2、Traes_2BL_3EDC425A7.2、Traes_2DL_1B3AD9F4E.1這3個基因的表達(dá)量有差異，但是表達(dá)趨勢一致。該表達(dá)模式與大粒品種品冬34和小粒品種陜麥159的表達(dá)模式相同。

圖A、B：品冬34與陜麥159開花前與開花后 TaGIF1-2A、 TaGIF1-2B、 TaGIF1-2D基因的相對表達(dá)量，其中JS、BS、HS分別表示小麥拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期的幼穗，3～15 DAA表示開花后3～15 d的籽粒；圖C、D： TaGIF1-2A、 TaGIF1-2B、 TaGIF1-2D基因在品冬34和陜麥159穎殼中的相對表達(dá)量。

z32、z39和z65對應(yīng)的小麥生育時期分別為拔節(jié)期2節(jié)、孕穗期幼穗4～7 cm和開花期；z71、z75和z85對應(yīng)的小麥生育時期分別為開花后2、14和30 d。

2.7 TaGIF1基因的亞細(xì)胞定位

采用在線軟件Cell-PLoc 2.0預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TaGIF1-2A作用于細(xì)胞壁上。進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在本式煙草葉片細(xì)胞中表達(dá)PE-TaGIF1-GFP融合蛋白，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光，對照為無定位功能的PE-GFP蛋白。結(jié)果如圖8所示，與PE-GFP空載體對照相比，PE-TaGIF1-GFP融合蛋白主要在細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上呈現(xiàn)明顯的綠色熒光。綜合前人在水稻[9]、擬南芥[19]植物中的定位以及網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果，筆者認(rèn)為TaGIF1蛋白定位在細(xì)胞壁上。

圖8 TaGIF1在煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

3 討 論

本研究根據(jù)水稻灌漿關(guān)鍵基因OsGIF1序列，利用同源克隆技術(shù)，首次在大粒與小粒的小麥品種中克隆出TaGIF1-2A基因的CDS全長序列。通過與其它物種的直系同源基因進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)這些蛋白都含有保守β-fructosidase結(jié)構(gòu)域、Cys催化域和保守的糖基化位點(diǎn)，說明在不同類型的植物中，該蛋白功能十分保守，這與前人在水稻中的研究結(jié)果[9]相一致。OsGIF1基因編碼CWIN，在蔗糖卸載中起關(guān)鍵作用。所以根據(jù)其相似的結(jié)構(gòu)，以及亞細(xì)胞定位結(jié)果，得出TaGIF1也是一種CWIN，可能參與調(diào)控籽粒灌漿的過程。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，小麥TaGIF1-2A蛋白與黑麥的序列一致性最高，其次是粗山羊草；根據(jù)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可知，該基因編碼的蛋白與單子葉禾本科植物關(guān)系最近，其次是雙子葉草本植物，最遠(yuǎn)是雙子葉木本植物。這說明該基因可能在單雙子葉分化之前就已經(jīng)產(chǎn)生，印證了該基因可能是一個不斷通過人工選擇馴化的基因[10]。

15份大小粒小麥品種TaGIF1-2A存在2個氨基酸變異位點(diǎn)，該變異是否影響TaGIF1-2A蛋白功能還有待進(jìn)一步研究；未發(fā)現(xiàn)大小粒材料特有的SNP位點(diǎn)和氨基酸變化，說明在大小粒品種中該基因編碼蛋白均存在高度保守性，也進(jìn)一步表明了對TaGIF1-2A基因啟動子調(diào)控功能研究的重要性。啟動子元件分析表明：(1)TaGIF1-2A啟動子中存在脫落酸應(yīng)答元件、赤霉素應(yīng)答元件，可能是誘導(dǎo)型啟動子，多種激素可能參與TaGIF1表達(dá)調(diào)控。相關(guān)研究也表明，激素調(diào)控植物生長發(fā)育的整體進(jìn)程，是重要的生理活性物質(zhì)，小麥籽粒的形態(tài)建成、灌漿充實及最終產(chǎn)量都受到內(nèi)源激素的調(diào)控[20]。(2)TaGIF1-2A啟動子中存在低氧特異誘導(dǎo)應(yīng)答元件和多個參與干旱誘導(dǎo)的順式作用元件，可能與逆境脅迫信號途徑有關(guān)。(3)TaGIF1-2A啟動子可能通過與生長發(fā)育有關(guān)的茉莉酸甲酯作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif，參與調(diào)控小麥籽粒灌漿或發(fā)育階段。此外，雖然在元件種類和數(shù)量上有差異，但是在大、小粒以及WheatExp轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中該基因在小麥生育時期的表達(dá)模式卻相似。由此推測，該基因不是導(dǎo)致大、小粒粒重差異的根本原因，可能通過調(diào)控啟動子區(qū)元件影響早期籽粒灌漿。預(yù)測結(jié)果中還含有多種功能未知的順式作用元件，也有待今后進(jìn)一步的研究驗證。

在不同籽粒大小的品種以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得出，TaGIF1-2A、TaGIF1-2B、TaGIF1-2D在灌漿期都有相似的表達(dá)模式，這說明該基因在大小粒品種中發(fā)揮相同的作用，同時A、B與D組之間基因功能可能存在一些冗余。在A、B、D三個基因組中，A組基因的表達(dá)量明顯高于D組，可能三個染色體組的基因功能有部分分化。在陜麥159中，該基因在籽粒與穎殼中共表達(dá)，而在品冬34中，該基因在6 DAA的穎殼中表達(dá)更高，說明在這一時期內(nèi)，該基因在不同材料中可能通過轉(zhuǎn)錄水平的變化發(fā)揮了不同的作用。TaGIF1基因在開花前幼穗中的表達(dá)量相對較低，呈逐步遞增趨勢，而在3～6 DAA表達(dá)量較高，說明該基因在籽粒灌漿早期發(fā)揮作用，這一結(jié)果與前人對棉花(Gossypiumhirsutum)GhCWIN1[21]基因以及WheatExp轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[17]中TaGIF1基因在種子發(fā)育早期的時空表達(dá)模式相吻合。潘慶民等[22]研究表明，在7 DAA小麥籽粒中蔗糖含量最高，而后呈逐漸下降的趨勢，這與TaGIF1基因在籽粒中的表達(dá)模式相同，說明在籽粒灌漿前期，小麥由于該基因主導(dǎo)蔗糖降解而維持著蔗糖較高的供應(yīng)水平。