蘇 晴,趙夢雨,劉頡堯,宋思宇,吳 瀟,蔣 政,董浩然,李玉閣,李鎖平

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南開封 475004)

利用雜種優(yōu)勢提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)、適應(yīng)性和抗逆性，是作物遺傳改良的重要途徑。雜交小麥?zhǔn)墙窈蟠蠓忍岣咝←湲a(chǎn)量的首選途徑[1]。小麥的遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，限制了其雜種優(yōu)勢利用和遺傳改良[2-3]。從野生近緣物種中發(fā)掘有益基因資源并將其導(dǎo)入普通小麥，是當(dāng)前通過雜交育種改良普通小麥的主要途徑[4-5]。節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCoss.2n=2x=14，DD)是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)山羊草屬(Aegilops)的一年生草本植物，是公認的普通六倍體小麥(TriticuvumaestivumL. 2n=6x=42，AABBDD)D基因組的二倍體供體[6]。根據(jù)穗型等形態(tài)學(xué)特征，Hammer[7]將節(jié)節(jié)麥劃分為 ssp.tauschii和ssp.strangulala兩個亞種。根據(jù)其生態(tài)習(xí)性，節(jié)節(jié)麥可分為雜草型和野生型；前者通常以田間雜草的形式分布于小麥主產(chǎn)區(qū)的田間地頭，后者則通常以自然群落形式存在于伊朗、阿富汗南部、巴基斯坦和我國新疆伊犁地區(qū)[8]。Mizuno等[9]、Sohail等[10]、Wang等[11]和Singh等[12]分別采用AFLP、DArT、SNPs分子標(biāo)記技術(shù)，根據(jù)節(jié)節(jié)麥的種群遺傳結(jié)構(gòu)特征，將世界分布的節(jié)節(jié)麥清晰地劃分為L1(lineage 1)和L2(lineage 2)兩大譜系。L1譜系主要是土耳其、薩爾維亞、阿富汗和中國黃淮麥區(qū)(河南、陜西)等東部分布區(qū)的雜草型節(jié)節(jié)麥，L2譜系則主要是伊朗、阿富汗南部、巴基斯坦、中國新疆伊犁地區(qū)等西部分布區(qū)的野生型節(jié)節(jié)麥。研究表明，僅有少數(shù)隸屬于L2譜系、2-3亞系、ssp.strangulala亞種的節(jié)節(jié)麥參與了普通小麥的形成[9-10]。而具有比普通小麥D基因組更廣泛遺傳變異而沒有參與普通小麥起源的L1譜系節(jié)節(jié)麥，可能是對小麥遺傳改良有重要應(yīng)用價值的寶貴野生種質(zhì)資源[13]。目前，已從節(jié)節(jié)麥中發(fā)掘出大量優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等對普通小麥遺傳改良有應(yīng)用價值的有益基因，部分基因已通過直接或間接途徑導(dǎo)入普通小麥[14-23]。

在地理分布上存在隔離的兩大譜系節(jié)節(jié)麥，在遺傳組成上也存在明顯的遺傳分化，很少存在中間過度類型的節(jié)節(jié)麥[9]。說明兩個譜系的節(jié)節(jié)麥在自然條件下是隔離生殖的[11]，對L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥?zhǔn)欠褚研纬蛇z傳學(xué)意義上的生殖隔離、是否存在顯著的雜種優(yōu)勢，目前尚不明確。

本研究擬對L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥進行人工雜交，結(jié)合SSR分子標(biāo)記、花粉活力測定、染色體減數(shù)分裂的配對情況及其16個主要農(nóng)藝性狀的調(diào)查，比較L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥的遺傳差異和雜種優(yōu)勢，為其在普通小麥育種中的雜種優(yōu)勢利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的國外節(jié)節(jié)麥由美國國家植物種質(zhì)中心提供，中國河南、新疆的節(jié)節(jié)麥則由河南大學(xué)植物種質(zhì)資源與遺傳實驗室采集并保存。通過預(yù)試驗，配置成功并種植的14個節(jié)節(jié)麥雜交組合的材料來源信息見表1。

表1 配置雜交組合、親本節(jié)節(jié)麥編號及來源信息表

1.2 試驗方法

1.2.1 材料種植

采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，每個雜交組合3次重復(fù)，每個重復(fù)包含父本、雜交種和母本各兩行，每行5株(取材及調(diào)查性狀選取中間3株)，行距為40 cm，株距為25 cm。人工播種，田間管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)生產(chǎn)方式進行。

1.2.2 雜種F1真實性鑒定

取5～8葉齡的節(jié)節(jié)麥葉片(父本和母本各取一株葉片，所有雜交F1均要取材)用于CTAB法提取親本和子代F1的基因組DNA，選用8對分別位于節(jié)節(jié)麥不同染色體上的SSR引物(表2)，通過PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳[24]、親本和子代F1電泳條帶的組成分析，鑒定雜種F1的真實性。

PCR擴增采用10 μL的反應(yīng)體系，包含 1 μL 10×PCR緩沖液(Mg2+)，1 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，0.1 μLTaqE(5 U· μL-1)，2 μL DNA模板(30 ng· μL-1)，4.9 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃變性3 min；95 ℃變性30 s，退火45 s(Tm見表2)，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃保持 15 min。

表2 鑒定雜種的SSR引物序列

根據(jù)鑒定結(jié)果，拔除假雜種。

1.2.3 花粉育性的觀察和統(tǒng)計

取親本和雜種F1當(dāng)天開花的3個小穗，分別取上、中、下部花藥，擠出花粉，采用K2-KI溶液染色法進行染色制片和顯微鏡觀察。根據(jù)花粉粒染色后的著色深淺、花粉粒的飽滿度等特征辨別花粉的育性[25]，取顯微鏡下的3～5視野的花粉進行觀察和計數(shù)，求平均值獲得花粉活力的百分比，挑取典型的視野拍照留存。

1.2.4 染色體配對情況的觀察和統(tǒng)計

從14個雜交組合中隨機挑選8個用于同源染色體配對觀察。選取3～5個雜種F1減數(shù)分裂時期的小穗，將花藥剝離并用FAA(醋酸∶酒精=1∶3)固定24 h；通過醋酸洋紅染色后制片，顯微鏡觀察，統(tǒng)計并記錄F1減數(shù)分裂時同源染色體的配對情況，對典型圖片進行拍照。

1.2.5 主要農(nóng)藝性狀的調(diào)查

通過定性觀察，篩選8個F1生長勢較優(yōu)的雜交組合進行主要農(nóng)藝性狀調(diào)查。每個重復(fù)挑選長勢一致的3株，分別對兩親本(P1，P2)和F1的16個農(nóng)藝性狀進行田間調(diào)查。用中親優(yōu)勢指數(shù) (index of heterosis，IH) 和超親(高值親本，HP)優(yōu)勢指數(shù)(over-parent heterosis，OPH)衡量L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥的雜種優(yōu)勢。

IH=[F1-(P1+P2)/2]/[(P1+P2)/2]×100%

OPH=(F1-HP)/HP×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析對F1與親本的差異進行顯著性檢驗，并通過LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜種F1真實性的SSR分子標(biāo)記分析

通過對14個雜交組合父母親本及其F1進行SSR分子標(biāo)記檢測，發(fā)現(xiàn)所有F1條帶都兼具兩親本的共有帶型，說明F1是真實雜交種。圖1展示了部分雜交組合的親本及其雜交F1的SSR檢測結(jié)果。

a、b、c、d和e分別代表編號為13、5、1、3和4雜交組合材料。1：父本；2：母本；3：F1。a和b 的引物分別為Xgpw4024和Xcfd132，c～e的引物均為Xgdm61。

2.2 雜種F1代的花粉育性分析

對14個雜交組合的花粉活力進行統(tǒng)計分析，結(jié)果(表3)表明，不同節(jié)節(jié)麥的花粉活力存在較大差異，AS60的花粉活力最高，有活力花粉比例高達99.231%，而AY22的花粉活力較低，有活力花粉占比78.892%。親本花粉活力較高的雜交組合，如AY12×AY77，其F1花粉活力也較高(圖2)，說明雜種F1的花粉活力與父母本的花粉活力有關(guān)。14個雜交組合F1的花粉活力均與中親值相差不大，育性正常。

A:AY12；B：AY77； C：雜種F1。箭頭指示的是無活力的花粉。

表3 14個雜交組合的花粉活力

2.3 雜種F1代同源染色體的配對統(tǒng)計結(jié)果

從14個雜交組合中隨機選取8個雜交組合，對其F1減數(shù)分裂時期的同源染色體配對情況進行觀察和統(tǒng)計分析，結(jié)果(表4、圖3)表明，雜交組合AY12×AY77、XJ098×AY46的F1減數(shù)分裂中期染色體均為7對環(huán)狀二價體，其他雜交組合的雜交F1代，減數(shù)分離期大多數(shù)同源染色體配對形成環(huán)狀二價體，個別配對時形成1～2個棒狀二價體。說明L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥在染色體水平上雖有一定的遺傳分化，但同源染色體同源率較高，能正常配對，產(chǎn)生可育的后代。

圖3 雜交組合AY26×AY46的F1同源染色體配對結(jié)果圖

表4 不同雜交組合中雜種F1的染色體配對情況統(tǒng)計結(jié)果

2.4 主要農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢分析

在定性觀察的基礎(chǔ)上，對8個F1生長勢較優(yōu)的雜交組合的產(chǎn)量(分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、粒重、籽粒結(jié)實率)、花期(抽穗期、開花期)、株型(株高、旗葉長、旗葉寬)、籽粒(穎殼長、穎殼寬、外稃長、外稃寬、內(nèi)稃長、內(nèi)稃寬)等相關(guān)農(nóng)藝性狀進行調(diào)查統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，L1和L2譜系的節(jié)節(jié)麥在分蘗數(shù)(表5)和粒重(表6)上表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢，而其 他性狀在父母本和F1間差異不顯著(數(shù)據(jù)未 列出)。

8個雜交組合的分蘗數(shù)均有良好的雜種優(yōu)勢，中親優(yōu)勢指數(shù)(IH)為120.31%～ 223.73%，超親優(yōu)勢指數(shù)(OPH)3.97%～ 86.76%。有4個組合的百粒重(表6)具有明顯雜種優(yōu)勢，中親優(yōu)勢指數(shù)(IH)在143.62%～ 147.71%，超高值親本優(yōu)勢(OPH)在21.71%～28.80%。3個雜交組合(AY56×AY77、AY26×AY46和XJ47×AY46)的百粒重(IH>143%，OPH>21%)和分蘗數(shù)(IH>187%，OPH>57%)均存在明顯的雜種優(yōu)勢。特別是AY26×AY46(圖4)和XJ47×AY46(圖5)在整株生長勢上，雜種F1均明顯優(yōu)于其父母本。對上述8個雜交組合的百粒重和分蘗數(shù)進行多重比較發(fā)現(xiàn)(表5，表6)，雜種F1的分蘗數(shù)均顯著高于親本。

圖5 雜交組合XJ47×AY46的整株表型比較圖

表5 節(jié)節(jié)麥雜交組合的分蘗數(shù)雜種優(yōu)勢比較

表6 8個節(jié)節(jié)麥雜交組合的粒重雜種優(yōu)勢比較

圖4 雜交組合AY26×AY46的整株表型比較圖

3 討 論

作為普通小麥D染色體的供體，節(jié)節(jié)麥?zhǔn)切←溣N中重要的基因資源庫，節(jié)節(jié)麥與普通小麥的D基因組的染色體可發(fā)生自由交換和重組，染色體重組后幾乎無負遺傳作用，這些為節(jié)節(jié)麥優(yōu)勢基因?qū)肫胀ㄐ←溙峁┝吮憷涂尚行訹26]。目前已在節(jié)節(jié)麥中篩選并分離出大量抗白粉病[14-15]、小麥癭蚊[16]、葉銹病[17]、稈繡病[18]、條銹病[19]、麥二叉蚜[20]、穗發(fā)芽[21]和耐鹽、優(yōu)質(zhì)高分子量谷蛋白亞基[22]、耐旱[23]等有益基因，并通過普通小麥與節(jié)節(jié)麥雜交的直接轉(zhuǎn)育途徑，或節(jié)節(jié)麥與四倍體小麥雜交構(gòu)建橋梁人工親本六倍體小麥，再與普通小麥雜交的間接轉(zhuǎn)育途徑，已成功對小麥進行了遺傳改良。

節(jié)節(jié)麥?zhǔn)切←溣N可利用的重要基因資源，世界地理分布清晰的形成了分別代表東、西節(jié)節(jié)麥分布區(qū)的L1和L2兩大譜系[9-11]，中間沒有過度類型，說明兩個譜系節(jié)節(jié)麥在自然狀態(tài)下是生殖隔離的。為揭示L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥?zhǔn)欠褚研纬蛇z傳學(xué)意義上的生殖隔離、是否存在顯著的雜交優(yōu)勢，本研究通過對14個L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥及其雜交組合的花粉活力鑒定、染色體配對情況觀察和16個農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，雜交F1的花粉育性正常，花粉母細胞在減數(shù)分裂時大多數(shù)同源染色體能正常配對形成7對環(huán)狀的二價體，少數(shù)出現(xiàn)棒狀染色體，說明L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥間雖有明顯的遺傳分化，但并未產(chǎn)生遺傳學(xué)意義上的生殖隔離。該結(jié)果與孔令讓等[26]對粗山羊草與普通小麥的屬間雜交研究結(jié)果類似。

對八個雜交組合的16個農(nóng)藝性狀調(diào)查分析表明，L1和L2譜系節(jié)節(jié)麥間在粒重和分蘗數(shù)上存在顯著雜交優(yōu)勢，推測節(jié)節(jié)麥對提高小麥產(chǎn)量有重要的應(yīng)用潛力。劉 磊等[27]通過對大穗、大粒節(jié)節(jié)麥AT462和強分蘗節(jié)節(jié)麥AT18雜交后代性狀的相關(guān)性分析結(jié)果表明，控制節(jié)節(jié)麥穗長、小穗數(shù)、粒重等產(chǎn)量性狀的基因間加性效應(yīng)顯著，可應(yīng)用于小麥的產(chǎn)量育種。

綜上可見，參與小麥進化起源的主要是L2譜系的少部分節(jié)節(jié)麥[9-10]，但存在更廣泛的遺傳變異、沒有參與普通小麥起源的L1譜系節(jié)節(jié)麥，尤其是與L2譜系有明顯雜種優(yōu)勢的L1譜系節(jié)節(jié)麥，是普通小麥遺傳改良可利用的重要種質(zhì)資源，有望通過直接或間接轉(zhuǎn)育途徑，用于小麥產(chǎn)量的遺傳改良。