雷炎，周亞澳，單春會，蔡文超，宋凱，郭壯

（1.湖北文理學院食品科學技術學院，湖北襄陽441053；2.石河子大學食品學院，新疆石河子832003）

0 引 言

奶豆腐作為新疆地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，因其口味和營養(yǎng)價值而廣受歡迎[1]。越來越多的研究人員也針對奶豆腐展開了各種研究工作[2]。結果表明地域[3]、氣候[4]和制作工藝[5]等均會影響奶豆腐的品質(zhì)，而奶豆腐中的微生物在其發(fā)酵過程中起著至關重要的作用，并直接決定了奶豆腐的質(zhì)量[6]，因而開展奶豆腐中微生物菌落結構的解析具有重要的意義。而以Illumina MiSeq 為代表的第二代測序技術的迅速發(fā)展也為解析環(huán)境中的微生物結構[7-8]，特別是為解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物群落結構提供了有效的手段[9]。

本研究采用Illumina MiSeq 高通量測序技術對采集自新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)的15 份奶豆腐樣品中微生物構成和物種多樣性進行了解析，以期于為奶豆腐的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展、優(yōu)良菌株的篩選以及傳統(tǒng)奶豆腐的安全提供一定的參考依據(jù)。

1 實 驗

1.1 試劑及儀器設備

1.1.1 材料

奶豆腐，采集自新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)的烏蘇市、額敏縣和裕民縣牧民家中。

5× TransStartTMFastPfu Buffer，F(xiàn)astPfu Fly DNA Polymerase，dNTPs Mix，DNA 1000 試劑盒，QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒。

1.1.2 設備

R930 機架式服務器，美國DELL 公司；TGL-16M冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；UVPCDS8000 凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Protein Simple 公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國TherimoFisher 公司；Illumina MiSeq 高通量測序平臺，美國Illumina 公司；vetiri 梯度基因擴增儀，美國AB 公司。

1.2 樣品的采集

使用在酒精燈上灼燒過的手術刀從牧民家自制的奶豆腐上切下一塊樣品，將奶豆腐的表面部分去除，修正成長×寬×高約為10 cm×10 cm×5 cm 的立方體，裝入無菌袋中置于含有冰袋的采樣箱中運回實驗室，在超凈臺中使用滅菌的手術剪將其剪碎后裝入滅菌的50 mL樣品管中備用。

1.3 樣品微生物宏基因組DNA 提取

準確稱取2.0 g 奶豆腐樣品，按DNA 基因組提取試劑盒說明書所約束的步驟進行宏基因組DNA 的提取，通過分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法對提取DNA 的質(zhì)量和濃度進行檢測。

1.4 細菌16S rRNA V3-V4區(qū)PCR 擴增及測序

本研究對奶豆腐中細菌微生物的16S rRNA V3-V4區(qū)進行擴增，其正反向引物分別為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。同時將成對的核苷酸標簽（barcode）加入引物中用以區(qū)分歸并每個樣品的序列。參照王玉榮的方法進行PCR 擴增[10]，并將檢驗合格的PCR 產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina MiSeq 高通量測序平臺進行測序。

1.5 生物信息學分析

本研究首先對下機后的雙端序列依據(jù)其重疊關系進行拼接，并依據(jù)barcode 信息將所有序列歸并到不同的樣品中，同時參照Illumina MiSeq 標準數(shù)據(jù)質(zhì)控流程進行質(zhì)控[11]。將所有樣品的序列合并后，參照Hou 的方法[12]，使用QIIME（v1.70）平臺對所有有效序列進行微生物物種注釋和多樣性分析。其大致流程為100%和97%相似性序列的劃分、構建分類操作單元矩陣（operational taxonomic units，OTU）、序列的同源性比對和多樣性分析和基因功能預測。

1.6 核酸登錄號

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST 數(shù)據(jù)庫，登錄號為mgp90776。

1.7 多元統(tǒng)計學分析

采用Pearson 相關性分析法對奶豆腐樣品中優(yōu)勢細菌屬（樣品的平均相對含量大于1.00%）的相關系數(shù)和P 值進行計算，并用熱圖（Heatmap）對其進行可視化。使用Origin 8.5 軟件（OriginLab Corp，MA，USA）進行繪圖；使用R 軟件（v3.3.2）進行相關性和顯著性檢驗，加載waterfall包繪制瀑布圖。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

采用MiSeq 高通量測序技術對奶豆腐中細菌微生物的構成和多樣性進行了解析，并對奶豆腐的測序結果和分類學地位數(shù)量信息進行了統(tǒng)計，其結果如表1所示。

全部奶豆腐樣品經(jīng)高通量測序共產(chǎn)生了470210條高質(zhì)量的16S rRNA 序列，每個樣品平均可得到31347 條序列。按97%的相似性對序列進行劃分后去除嵌合體OTU 共得到8 525 個OTU，進一步刪除單序列OTU 得到4 209 個OTU 用于后續(xù)分析。由表1可知，A8 奶豆腐樣品的OTU 數(shù)和超1 指數(shù)最大，A13奶豆腐樣品的辛普森指數(shù)最高，且不同奶豆腐樣品之間的OTU 數(shù)、超1 指數(shù)和辛普森指數(shù)均存在較大差異。超1 和辛普森指數(shù)常用來評估樣品中的微生物豐度和多樣性，因而A8 樣品中微生物的豐度最高，而A13樣品中微生物的多樣性最高。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量

2.2 門屬水平奶豆腐中細菌組成分析

本研究對OTU 的代表性序列進行了同源性比對，15 個奶豆腐樣品中共鑒定出了32 個細菌門，540個細菌屬。優(yōu)勢細菌門（平均相對含量大于1.00%的門）和優(yōu)勢細菌屬（平均相對含量大于1.00%的屬）在各個樣品中的相對含量如圖1所示。

由圖1 可知，32 個細菌門中有4 個優(yōu)勢菌門，分別為Proteobacteria（變形菌門）、Frimicutes（硬壁菌門）、Actinobacteria（放線菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門），其平均相對含量分別為47.98%，43.84%，3.24%和1.90%。共鑒定出10 個優(yōu)勢屬，分別是Lactobacillus（乳桿菌屬，19.66%）、Acetobacter（醋酸桿菌屬，16.69%）、Lactococcus（乳球菌屬，13.90%）、Enterobacter（腸桿菌屬，11.42%）、Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌屬，3.37%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬，3.33%）、Acinetobacter（不動桿菌屬，2.79%）、Moraxella（莫拉菌屬，1.78%）、Paenibacillus（類芽孢桿菌屬，1.66%）和Streptococcus（鏈球菌屬，1.14%）。進一步對奶豆腐中優(yōu)勢菌屬之間的相互關系進行了探究，其相關性熱圖如圖2所示。

圖1 奶豆腐中優(yōu)勢細菌門和屬相對含量的比較分析

圖2 奶豆腐樣品中優(yōu)勢細菌屬之間的秩相關熱圖

由圖2 可知，盡管大多數(shù)優(yōu)勢菌屬之間存在一定的相關性，但其相關性并不強，經(jīng)差異性檢驗可知，僅不動桿菌屬與葡萄球菌屬和鏈球菌屬之間存在顯著正相關性（P＜0.05,r＞0.5），其他優(yōu)勢菌屬之間均不存在顯著相關性，由此也可說明優(yōu)勢菌屬之間的相互作用強度較弱。本研究進一步將在每個樣品中均存在，且平均相對含量大于1.0%的屬定義為優(yōu)勢核心屬，其在每個樣品中的相對含量如圖3所示。

圖3 奶豆腐中優(yōu)勢核心屬相對含量的比較分析

由圖3 可知，奶豆腐樣品中共有7 個優(yōu)勢核心屬，分別為乳桿菌屬、醋酸桿菌屬、乳球菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬和鏈球菌屬，其累計平均相對含量為68.94%。由圖3 亦可知，A12 樣品中核心優(yōu)勢菌屬占比最多為98.13%，而A9 樣品中核心優(yōu)勢菌屬占比最少僅為12.49%。由此可知，盡管優(yōu)勢核心屬存在于所有樣品中，但其在不同樣品中的分布卻存在著較大的差異。

2.3 OTU 水平奶豆腐中細菌組成分析

本研究進一步對奶豆腐樣品中OTU 出現(xiàn)的頻率進行了分析，結果如圖4所示。

圖4 奶豆腐樣品中OTU出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計分析

表1 結果顯示不同樣品中OTU 的數(shù)量存在較大差異。由圖4 可知，僅出現(xiàn)1 次的OTU（只在一個樣品中出現(xiàn)），即樣品中的特有OTU 占總數(shù)的67.23%，其所包含的序列數(shù)為12 353 條，占總序列數(shù)的2.64%。出現(xiàn)15 次的OTU（在所有樣品中均出現(xiàn)），即奶豆腐的共有OTU僅為總數(shù)的0.09%，但卻包含250 078條序列，占全部序列數(shù)的53.50%。由此說明，雖然15個奶豆腐樣品共有大量的核心菌群，但部分樣品具有較為獨特的細菌類群。在所用樣品中均存在且平均相對含量大于0.10%的核心OTU 如圖5所示。

由圖5 可知，在所有樣品中均存在且平均相對含量大于0.10%的OTU 有8 個，所包含序列數(shù)占總序列數(shù)的53.50%，其中OTU8262、OTU1070 和OTU2416均隸屬于乳酸桿菌屬，而OTU549，OTU1164，OTU1698，OTU7521 和OTU6656 分別隸屬于Macrococcus（巨球菌屬）、乳球菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬和醋酸桿菌屬。由此可見，奶豆腐中的核心細菌類群主要以乳酸桿菌、醋酸桿菌屬和不動桿菌屬為主。

乳酸菌作為發(fā)酵乳制品中最常見的細菌之一，能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量的乳酸，對乳制品的發(fā)酵進程有著重要的影響，已有研究表明乳酸菌能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，且這些活性物質(zhì)在發(fā)酵完成后仍然保留于乳制品中[13]。DUGAT-BONY E 研究了12 種法國奶酪發(fā)現(xiàn)其均以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）為主[9]，DOMINGOS-LOPES M F P 也發(fā)現(xiàn)乳酸菌為手工奶酪細菌菌群的重要組成部分[14]，上述研究結果均與本文中的結論相一致。

乳桿菌屬和乳球菌屬是奶豆腐中最常見的益生菌，與人體具有共生關系保護宿主免受病原體的潛在入侵[15]，它在維持人類健康方面的應用廣泛，可以幫助治療腹瀉、陰道感染和濕疹等疾病[16]。醋酸桿菌屬的特點是能夠將乳酸鹽和乙酸鹽氧化成二氧化碳和水，從而賦予奶豆腐樣品特殊的口感[17]，這也賦予了新疆奶豆腐樣品特有的功能與風味。值得注意的是，奶豆腐樣品中存在著一定量的腸桿菌屬，可能導致有機體的多種疾病，如敗血癥和腹瀉等[18]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，牧民制作奶豆腐的環(huán)境較為開放和復雜，制作過程中奶豆腐與空氣和模具等接觸頻繁，這也可能是導致奶豆腐中存在條件致病菌的原因之一。

圖5 奶豆腐樣品中平均相對含量大于0.1%的OTU

2.4 PICRUSt基因預測

牛奶中富含蛋白質(zhì)和碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，其中的微生物具有代謝和利用這些營養(yǎng)物質(zhì)的基因。細菌作為奶豆腐發(fā)酵進程的主要參與者，通過利用乳源中的營養(yǎng)物質(zhì)進行新陳代謝，從而賦予奶豆腐特有的風味。本研究使用PICRUSt 對奶豆腐樣品中細菌微生物的基因功能進行了預測，并參考蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫（COG）進行功能注釋[19]。研究共注釋到4 792 個COGs，所有COGs 分別隸屬于20 個功能大類。奶豆腐樣品中細菌功能類別如圖6所示。

由圖6 可知，奶豆腐中細菌的功能基因主要與氨基酸、碳水化合物和無機鹽離子運輸和代謝相關，與能量的產(chǎn)生和轉化相關的基因進行了高表達，而與細胞運動和RNA 加工修飾相關的基因表達量卻相對較低。乳糖是牛奶中的主要碳水化合物，也是細菌能量的重要來源。奶豆腐中存在的大量乳酸菌通過其相關基因的高表達將乳源中的乳糖轉化為乳酸，并產(chǎn)生一些風味物質(zhì)。相關報道顯示，盡管不同的乳酸菌都能代謝乳糖轉化為乳酸，但此過程中生成的一些風味物質(zhì)卻并不相同，這也使得奶豆腐的品質(zhì)存在較大的差異。通過對奶豆腐中微生物多樣性進行解析，探討了乳酸菌在奶豆腐發(fā)酵過程中的重要作用，對奶豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)和菌株篩選具有一定的參考意義。

圖6 奶豆腐中細菌功能類別

3 結 論

結果表明，塔城地區(qū)奶豆腐中優(yōu)勢細菌門分別為變形菌門、硬壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，優(yōu)勢細菌屬主要為乳桿菌屬、醋酸桿菌屬、乳球菌屬、克雷伯氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬、莫拉菌屬、類芽孢桿菌屬和鏈球菌屬。塔城地區(qū)奶豆腐中主要以乳酸菌為主，通過生成乳酸和其他代謝產(chǎn)物，從而賦予奶豆腐特殊的風味。