盧奕霏，顧迎港，陳 威，王 娜，康 珍，侯澤豪，張迎新，方正武，馬東方，劉易科，朱展望，張改生，王書平,4

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434025； 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，湖北武漢 4300643； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 4.湖北荃銀高科種業(yè)有限公司，湖北荊州 434025)

隨著大氣中CO2和其他溫室氣體排放量的逐年升高，地球表面平均溫度也在日益增高，溫室效應(yīng)給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來極大危害[1-2]。研究表明，氣溫升高1 ℃以上時，小麥產(chǎn)量開始快速下降，升高3 ℃時，產(chǎn)量降低20%左右[3-4]。在小麥對逆境響應(yīng)機制的研究中，有關(guān)干旱、鹽脅迫和低溫脅迫的研究較多，而關(guān)于高溫脅迫對小麥影響的研究仍不全面系統(tǒng)。因此，探索小麥高溫脅迫響應(yīng)機制，了解小麥耐熱性的分子遺傳基礎(chǔ)及機理進(jìn)而提高其的抗熱性尤為重要。

Driedonks等[5]研究表明，高溫脅迫會造成植物細(xì)胞內(nèi)的氧代謝失調(diào)，增加細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的風(fēng)險。鄭 飛等[6]研究表明，高溫脅迫能顯著提高冬小麥旗葉中丙二醛(MDA)的含量，加速葉片衰老。劉洪展等[7]研究了不同高溫脅迫對小麥葉片中活性氧(ROS)代謝的影響，結(jié)果表明，在輕度高溫脅迫下，超氧化物歧化酶(SOD)活性增強，過氧化氫酶(CAT)活性稍微下降；在嚴(yán)重高溫脅迫條件下，SOD活性最終表現(xiàn)出減弱的趨勢，CAT活性則有所上升。郭洪雪等[8]對二葉期小麥葉片分別進(jìn)行1 h、12 h、24 h和36 h 高溫處理，發(fā)現(xiàn)SOD活性及MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。目前為止，還未見有關(guān)高溫脅迫影響小麥花藥不同生育期ROS代謝的研究。

高溫脅迫會導(dǎo)致植物細(xì)胞的ROS代謝平衡失調(diào)，而ROS代謝平衡失調(diào)是引起作物雄性不育的重要生理原因之一[9]。前人研究結(jié)果表明，短時高溫脅迫(42±1)℃使小麥花藥徹底敗育(敗育率100%)[10]。處于生殖生長階段的小麥對溫度最為敏感，當(dāng)外界環(huán)境溫度達(dá)到一定的閾值時，可引起小麥花藥氧化還原體系的紊亂，造成花藥的氧化脅迫。因此，本研究以小麥不同發(fā)育時期的花藥為材料，通過對高溫脅迫下小麥花藥細(xì)胞內(nèi)ROS積累進(jìn)行觀察，以及比較分析ROS的生成速率和抗氧化酶的活性，揭示高溫脅迫下ROS代謝的動態(tài)變化與小麥花藥敗育的關(guān)系，探索小麥花藥高溫脅迫響應(yīng)機制，為進(jìn)一步解析小麥耐熱性的分子遺傳基礎(chǔ)及機理，提高小麥的耐熱性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

供試小麥品種為西農(nóng)1376。待花藥發(fā)育至單核早期，于人工氣候室中進(jìn)行高溫脅迫處理，設(shè)置溫度分別為(42±1)℃(高溫脅迫處理)和(25±1)℃(對照)，濕度為(70±5)%，每天處理3 h，共3 d，此時花藥已發(fā)育至單核后期。在4 ℃條件下分別收集單核后期、二核期和三核期的花藥，取樣時期的確定按Wang等[11-12]的方法進(jìn)行。

1.2 ROS染色

采用二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine-HCl, DAB)染色檢測法[13]，將不同發(fā)育時期的小麥花藥置于DAB溶液(0.1 μg·mL-1DAB, 50 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷(Tris)-醋酸緩沖液，pH 5.0)中，真空滲透 15 min，25 °C黑暗條件下 150 r·min-1振蕩24 h。染色后的花藥經(jīng)蒸餾水漂洗后置于85%乙醇溶液中70 °C水浴15 min，待葉綠素完全褪去后置于乳酸∶苯酚∶水(體積比1∶1∶1)溶液中保存，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 酶液制備

稱取花藥1 g，在液氮中迅速研磨成粉末狀，加入 10 mL 預(yù)冷的提取液(0.1 mol·L-1Tris-HCl、pH 7.8，0.5 mmol·L-1EDTA 和1% PVP)，然后于4 ℃下 3 000 g離心 10 min，取上清液，再以13 000 g離心 15 min，上清液即為酶提取液，低溫保存供酶活性測定。ROS指標(biāo)和酶活性指標(biāo)均重復(fù)測定3次。

1.4 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率及過氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)含量的測定

H2O2含量按Patter-son等[15]的方法測定，并略有改動，取5%硫酸鈦0.1 mL和17 mmol·L-1氨溶液0.2 mL 加入酶液中，用丙酮沖洗5次，靜置沉淀后用5 mL 2 mmol·L-1硫酸銨溶解，在410 nm處測其吸光值，含量以 nmol·g-1FW表示。

MDA含量按Wang等[16]修改的方法測定，以nmol·mg-1protein 表示。即1 mL 0.6%TBA(硫代巴比妥酸)與1 mL酶液混合后100 ℃水浴加熱30 min，迅速冰浴降溫，二次離心后記錄 532 nm、600 nm、450 nm 處的吸光值。

1.5 酶活性的測定

SOD 活性的測定按王愛國等[17]的方法進(jìn)行，并略有改動，利用抑制氮藍(lán)四唑在熒光下的還原作用，將每3 mL反應(yīng)液(1.3 μmol·L-1核黃素、13 mmol·L-1甲硫氨酸、63 μmol·L-1NBT、0.05 mol·L-1pH 7.0磷酸緩沖液)中加入適量酶液后于4 000 lx熒光燈下光照15 min，以緩沖液作空白，在560 nm下測其吸光值。以抑制NBT 光化還原作用50 %的酶量為1個酶活性單位。

POD 活性按Wang等[11]的方法進(jìn)行測定。CAT 活性參照Ba等[18]的方法測定。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)進(jìn)行三次測量。采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對小麥花藥細(xì)胞ROS的影響

正常發(fā)育的小麥花藥經(jīng)高溫脅迫后用DAB染色檢測ROS的積累情況，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，正常發(fā)育的小麥花藥從單核后期至三核期DAB染色程度均較弱，染色斑點較少(圖1A～圖1C)。而高溫脅迫后的花藥從單核后期即可檢測到明顯的DAB染色斑點(圖1D)，在花藥二核期時DAB染色強度最強，并與對照的差異最明顯(圖1E)，且在各發(fā)育時期花藥的DAB染色程度(圖1D～圖1F)均高于對照組。這表明高溫脅迫造成了花藥內(nèi)ROS代謝的紊亂，使花藥始終處于氧化脅迫的狀態(tài)，進(jìn)而影響花藥的正常發(fā)育。

A～C：對照組; D～F：高溫脅迫組；A、D：單核后期；B、E：二核期；C、F：三核期。比例尺：0.5 mm。

2.2 高溫脅迫對小麥花藥中產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量的影響

表1 花藥經(jīng)高溫脅迫后不同發(fā)育期的產(chǎn)生速率、和MDA含量

植物組織中積累的ROS會導(dǎo)致脂膜過氧化，產(chǎn)生MDA，其濃度是判斷脂質(zhì)過氧化程度和膜系統(tǒng)傷害大小的主要指標(biāo)[11-12]。MDA含量在對照組花藥的整個發(fā)育過程中均比較穩(wěn)定，而高溫脅迫后的花藥MDA含量則呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且在二核期時達(dá)到最大值，為2.95 nmol·g-1，是對照組的1.59倍，差異顯著。此外，在單核后期和三核期時，MDA 的含量與對照相比差異顯著，分別為對照的1.09倍和1.34倍。這說明高溫脅迫對花藥細(xì)胞膜造成了持續(xù)的 損傷。

2.3 高溫脅迫對小麥花藥中SOD、POD 和CAT 活性的影響

由表2可知，在正常發(fā)育的小麥花藥中，POD活性從單核后期到二核期比較穩(wěn)定，分別為46.14和46.50 U·g-1FW·min-1，發(fā)育至三核期則急劇上升，達(dá)到86.66 U·g-1FW ·min-1。而高溫脅迫后花藥的POD活性呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，且始終顯著低于相同發(fā)育時期的對照組，在單核后期、二核期和三核期分別比對照組降低了61.38%、50.62%和88.37%。這說明在高溫脅迫的初期POD活性的增強清除了花藥內(nèi)過量積累的部分ROS，但隨著后期ROS的不斷積累，進(jìn)而抑制了POD的活性。

表2 花藥經(jīng)高溫脅迫后不同發(fā)育期的SOD、POD和CAT酶活性

此外，隨著小麥花藥的不斷發(fā)育，CAT活性在高溫脅迫和對照中均呈持續(xù)下降趨勢，在不同發(fā)育時期間，高溫脅迫的花藥下降速率顯著高于對照，其中對照的下降幅度為27.04%(單核后期至二核期)和10.90%(二核期期至三核期)；而高溫脅迫后的花藥下降幅度為44.07%(單核后期至二核期)和66.52%(二核期期至三核期)(表2)。在相同發(fā)育時期，高溫脅迫后的花藥的CAT活性始終顯著低于相同發(fā)育時期的對照組，在單核后期、二核期和三核期分別比對照下降了 51.06%、62.48%和85.90%。

3 討 論