伍 玲，董亞超，戴常軍，李式昭，朱華忠

(1.四川省農業(yè)科學院作物研究所，四川成都 610066；2.中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081；3.農業(yè)農村部谷物及制品質量監(jiān)督檢驗測試中心(哈爾濱)，黑龍江哈爾濱 150086)

長江上游冬麥區(qū)屬于我國的中筋和弱筋小麥生產區(qū)域，小麥品質改良經歷了不重視質量—重視蛋白質含量—重視強筋—重視中筋和弱筋小麥品質全面提升的過程。20世紀50-80年代，四川省的小麥育種以提高產量為第一目標，幾乎沒有對加工品質進行選擇；20世紀90年代后，該區(qū)域的小麥品質改良注重了蛋白質含量、濕面筋含量和高分子量麥谷蛋白亞基的改良和選擇[1]；而同時期云南、貴州等省與四川的情況類似。到2010年前后，四川省小麥新品系的平均蛋白質含量和濕面筋含量已與北方麥區(qū)基本相當，含優(yōu)質高分子量麥谷蛋白亞基的品種大大增加，5+10、7+8、17+18等亞基在新品種中并不鮮見。但是該區(qū)域收獲期降雨較多，穗發(fā)芽嚴重，降落值較低，嚴重影響小麥品質。且該區(qū)域小麥品種的面團穩(wěn)定時間一直較短[2]。晏本菊等[3]分析了四川省“九五”和“十五”期間育成的小麥品種的蛋白質組分，認為對該區(qū)域的小麥品質改良，在提高總蛋白質含量的同時，需要提高谷蛋白含量。2012年以后，卻鮮見有關該區(qū)小麥品質的報道。

隨著小麥基因組學的發(fā)展，很多重要性狀的基因已被克隆，但育種家對這些已克隆基因在育成品種中的基因型了解并不多。目前這些基因的SNP差異，可用KASP(競爭性等位基因特異性PCR，Kompetitive allele-specific PCR)標記進行檢測。KASP標記是對等位基因的差異位點(SNP和InDel)進行競爭性特異擴增，需要三條引物；其中兩條正向競爭性引物的5′端有與熒光基團HEX和FAM互補配對的堿基序列，而這兩條正向引物的其余堿基序列僅在3′端的SNP和InDel處有差異；一條反向共同保守區(qū)引物。PCR反應體系中含有熒光基團和猝滅基團修飾的通用序列(Master Mix由LGC公司提供)；因此，正向引物可以特異性地結合基因型與其匹配的DNA模板，兩條正向引物可以發(fā)出兩種顏色不同的光，若模板鏈中該位點為純合，則發(fā)出單一的、與其匹配的熒光，若為雜合，則可同時發(fā)出兩種熒光。PCR產物可用酶標儀FAM VIC ROM光束掃描，并使用Kluster Caller軟件進行數據分析；或直接使用實時熒光定量PCR儀檢測。目前KASP技術已被廣泛應用于小麥、水稻和玉米等作物的分子標記檢測[4-6]，Rasheed等[7]開發(fā)了小麥已克隆基因的KASP標記，并用于小麥育種材料的基因型檢測，但未見對長江上游品種KASP標記檢測的報道。

2012-2018長江上游區(qū)域試驗包括109個小麥品種(系)，川麥42為長江上游麥區(qū)國家級品種試驗的對照。本研究擬分析這7年區(qū)試的品質數據，以明確長江上游小麥品種的品質現狀，同時用KASP標記分析這些品種相關位點的基因型，為明確下一步品質育種目標提供思路。

1 材料方法

1.1 供試材料及品質數據來源與品質分類方法

供試材料為國家小麥區(qū)域試驗長江上游組在2012-2018參試的品種(系)109個，其中，參試一年的品種(系)94個，參試二年的品種(系)15個；以川麥42為對照。

本文所用品質數據均來源于2012-2018國家小麥區(qū)域試驗長江上游組的試驗總結。2017年僅一組試驗，其余年份均設置A、B兩組試驗，共有13組試驗。109個品種(系)及其系譜等見附表1。成都、綿陽、內江、永川、昆明、貴陽、勉縣和十堰(2012和2013年為襄陽)8試點為區(qū)試品質分析取樣點；2016年品質分析取樣點為7個(十堰試點未送樣)，其余年份取樣點均為8個。

區(qū)試分別采用NY/T1094.2-2006《小麥實驗室制粉》、GB5498-1985《糧食、油料檢驗容重測定法》、GB10361-2008《小麥及其面粉降落數值的測定》、NY/T3-1982《粗蛋白質測定法(半微量凱氏法)》、GB/T5506.2-2008《小麥粉面筋含量儀器法測定濕面筋》、GB/14614-2006《小麥粉面團的物理特性吸水量和流變學特性的測定粉質儀法》等方法進行制粉和容重、粗蛋白質含量、濕面筋含量、面團穩(wěn)定時間和吸水量等測定。

8個品質取樣點的樣品首先測定降落值，降落值低于200 s的樣品被視為芽麥而被剔除；相同品種(系)的樣品混合后用于測定粗蛋白質含量、濕面筋含量、面團穩(wěn)定時間和吸水量?；旌宵c率=樣品混合點數/全部取樣點數。

根據小麥分級標準[8]將參試材料分為一到五級及等外六個級別；根據品種審定標準[9]將參試材料分為糯麥和非糯麥，非糯麥又分為強筋、中強筋、中筋和弱筋四類。

1.2 KASP標記分析

采用2個高分子量麥谷蛋白亞基(high-molecular-weight glutenin subunit,HMW-GS)基因、3個低分子量麥谷蛋白亞基(low-molecular-weight glutenin subunit,LMW-GS)基因、2個穗發(fā)芽抗性基因、9個粒重及籽粒大小基因、3個籽粒硬度基因和1個小麥-黑麥1BL·1RS易位的KASP標記對109個品種(系)進行基因型檢測。所用標記見表1，各標記的引物序列等見表2。

表2 KASP標記的引物詳情

表1 用于分析的KASP標記

每個材料取3～4粒種子，發(fā)芽后取2～3 cm的新鮮葉片，采用PVP-40法提取樣品DNA，得到DNA濃度為100 ng·μL-1的模板溶液。KASP標記PCR擴增體系和擴增程序同Rasheed等[7]方法，Master Mix和MgCl2購買自LGC公司，Primer Mix含12%HEX引物、12%FAM引物、30%的共同反向引物、46%的ddH2O，由華大基因公司合成。用酶標儀(BiOTek,SYNERGY/H1 microplate reader)的FAM VIC ROM光束掃描PCR擴增產物，用Kluster Caller分型軟件對掃描數據進行分型檢測。

2 結果與分析

2.1 試驗品種(系)的混合點率及兩個穗發(fā)芽抗性位點的基因型分析

在供試材料中，試驗一年的品種(系)94個，得到混合樣94個，試驗兩年的品種(系)15個，得到混合樣30個，對照品種1個，得到混合樣13個，合計137個樣品。137個樣品的混合點率不盡相同(表3)，其平均混合點率為0.662，多數樣品來自4～7個取樣點，說明長江上游麥區(qū)品種(系)較易發(fā)生穗發(fā)芽。137個樣品中，混合點率為1的僅有9個，分別是2016年的川麥82、川育27、科成麥4號，2015年的R802、川14品16、渝1318、川13015、滇麥2號，2014年的13A8，說明高抗穗發(fā)芽的品種(系)較少。

表3 2012-2018長江上游小麥區(qū)試品種(系)品質混合樣品數統(tǒng)計

用KASP標記檢測兩個穗發(fā)芽抗性位點的結果表明，在TaPHS1位點646SNP位置上，96個品種(系)和對照為抗穗發(fā)芽基因型；3個品種(系)為感穗發(fā)芽基因型；其余10個品種(系)在該位點的基因型不能判定。含有該抗性等位基因的品種(系)的平均混合點率為0.672，而含感穗發(fā)芽基因型的川麥605、綿陽1302和德102的混合點率分別為0.625、0.43、0.625。在TaSdr-A1位點，對照和106個品種(系)是感穗發(fā)芽基因型，2個品種(系)為抗穗發(fā)芽基因型，1個品種為雜合類型，含抗穗發(fā)芽基因型的品種(系)綿麥1302和W18的混合點率是0.430和0.75。兩個位點均含抗穗發(fā)芽基因的品系是W18，兩個位點均含感穗發(fā)芽基因的品種(系)是川麥605和德102，它們之間樣品的混合點率差異不大。綜合混合點率和兩個位點的基因型分析結果，這兩個位點不能很好區(qū)分長江上游區(qū)試品種(系)的穗發(fā)芽抗性。

2.2 試驗品種(系)的籽粒容重分級及粒重、籽粒大小和硬度位點的基因型分析

根據容重將109個品種(系)分成六個等級(兩年試驗的取高等級)，一等和二等共有77個，四等以下的僅18個。13次對照樣品中，9次達到了二等以上，3次四等以下，對照等級變差可能與2016和2017發(fā)生嚴重凍害和條銹病有關，推測部分品種(系)的籽粒容重也受到類似影響。

用KASP標記檢測7個粒重位點、2個籽粒大小位點和3個籽粒硬度位點發(fā)現，109個品種(系)中，多數品種(系)在TaGW2-6B、TaGS-D1、Tabas、TaSus2-2A和TaSus1-7B位點分別為Hap-1,2,3、D1a、B1a、Hap-A和Hap-T，是高粒重基因型；在TaGs2-B1和TaSus1-7A位點分別為B1a和Hap-1,3,5，是低粒重基因型；川麥42在TaGW2-6B位點是Hap-4，其余6個位點與多數品種(系)的基因型相同。在TaGS5-A1和TaGASR-A1兩個籽粒大小位點，多數品種(系)是A1b大籽?；蛐秃虷1g小籽?；蛐?。在Pina-D1和Pinb-D1位點，多數品種(系)分別是D1a和D1a，為軟質基因型；在Pinb2-v2位點有75個是B2b，為相對硬質類型。不同基因型在相同容重等級的品種(系)數間的分布頻率差異不明顯，說明容重與這些基因的相關性不大(表4)。

表4 2012-2018長江上游小麥品種試驗中占多數的基因型在不同容重級別品種(系)中的分布

2.3 試驗品種(系)的品質情況及HMW、LMW位點和1BL·1RS基因型分布

由表5可知，對比品種審定標準[9]，供試材料各被測指標的平均值基本符合中筋品種標準。各指標表現為：粗蛋白質含量10.06%～ 14.7%，濕面筋含量15.5%～30.7%，面團穩(wěn)定時間在 0.6～15.5 min之間，吸水率48.4%～ 70.7%。說明這4個指標在品種(系)間的差別較大。參試兩年品種(系)各指標的平均值均低于參試一年的品種(系)，對照的粗蛋白質含量和濕面筋含量平均最低。說明年份對各指標的測定值有一定影響，多年的數據更能客觀反映材料的品質。

表5 2012-2018長江上游小麥品種試驗品種(系)品質指標統(tǒng)計

109個品種(系)中，含糯小麥2個，弱筋小麥6個，中筋小麥101個。在101個中筋品種(系)中，4指標全部符合中筋標準的僅20個，其余81個不完全符合中筋標準。在81個不完全符合中筋標準的品種(系)中，59個粗蛋白質含量達中筋及以上標準(表6)，47個濕面筋含量達中筋及以上標準，43個吸水率達中筋及以上標準，36個穩(wěn)定時間達中筋及以上標準。有38個粗蛋白質含量符合中筋及以上標準而穩(wěn)定時間為弱筋，14個粗蛋白質含量為弱筋而穩(wěn)定時間為中筋，這兩個類型在81個品種(系)中占多數。

表6 2012-2018長江上游國家品種試驗品種(系)品質指標分類及部分高低分子量麥谷蛋白亞基的基因型

高、低谷蛋白亞基位點和1BL·1RS易位的KASP標記分析表明：在109個品種(系)中，Glu-A1位點的1/2*基因型、Glu-D1位點的2+12基因型、非Glu-A3g基因型、非Glu-B3g基因型、非Glu-A3d和非1BL·1RS易位是主要基因型(表6)。云麥49的KASP為Glu-B3g基因型，是 1BL·1RS易位，用功能標記驗證得到相同的結果。已知Glu-B3g在1BS上，而云麥49為1BL·1RS易位但含有Glu-B3g，值得進一步的研究。

6個弱筋小麥在Glu-A1位點、Glu-A3g和Glu-A3d的基因型是一致的，為2+12、非Glu-A3g和Glu-A3d基因型。有9個完全達到中筋標準的品種在這3個位點的基因型與6個弱筋小麥完全相同。中筋品系川14品16與弱筋品系11P2-4、中筋品系09J76與弱筋品系BL227、中筋品系R801與弱筋品系11P2-4在5個被測位點的基因型完全相同；還有較多品種(系)在5個被測位點基因型相同但品質不同，說明僅這5個位點的基因型不能完全解釋小麥品種間品質的差異。

Glu-D1位點的5+10基因型，在109個品種(系)中占39.4%；而在79個粗蛋白質含量達到中筋及以上標準的品種(系)中有34個，占43%；在67個濕面筋含量達到中筋及以上標準的品種(系)中有28個，占41.8%；在56個穩(wěn)定時間達到中筋及以上標準的品種(系)中有26個，占 46.4%；在63個吸水率符合中筋及以上標準的品種(系)中有28個，占44.4%。綜上，5+10亞基在4個指標分別達到中筋標準中的比例均高于在109個品種(系)中的比例，推測在長江上游區(qū)小麥品種中，5+10亞基對品質提升有一定的貢獻。

2.4 區(qū)試對照川麥42和試驗二年品種(系)年度間的品質變化

2012-2018川麥42有13個樣品，其中僅2018 B組、2017組、2016 A組和2012 B組共4個樣品達弱筋品種標準；2013 B組樣品達中筋品種標準；其余8個樣品不完全符合品質分類指標，劃為中筋類型(表7)。由表7可看出，在7年里，川麥42在弱筋和中筋之間徘徊，更多的是偏弱筋小麥；以穩(wěn)定時間的變化最大。

表7 川麥42和試驗二年品種(系)在2012-2018長江上游小麥品種試驗中品質表現

15個參試二年的品種(系)中，僅川14品16在兩年完全達到中筋標準。各品質指標在年度間均有變化，容重、濕面筋含量和穩(wěn)定時間年度間變化較大，粗蛋白質含量和吸水量年度間的變化較小。綜合兩年的品質數據，川麥604、川農32和N08-51在其中一年的指標完全達到中筋品種標準，可望在合適的條件下生產出符合中筋品種標準的中筋小麥，而綿麥312和N08-51在其中一年的指標達到弱筋品種標準，可望在合適的條件下生產出符合弱筋品種標準的弱筋小麥。

3 討 論

與專門研究區(qū)域品種品質變化的試驗不同[1,2,3,29]，區(qū)試的品質數據是跨年度多品種數據，很難得到規(guī)律性的結果；但因長江上游區(qū)域參加國家級區(qū)試的品種是長江上游七省市通過省級審定或完成省級區(qū)試2年的品種(系)，及時分析區(qū)試品質數據，可為育種者提供該區(qū)小麥品種品質的基本狀況，以發(fā)現影響因素，找到改良途徑。

3.1 影響長江上游小麥品質的因素及改良策略

3.1.1 穗發(fā)芽嚴重影響長江上游小麥品質

發(fā)生穗發(fā)芽的小麥，其降落值會大幅降低。張 艷等[27]研究認為，小麥籽粒發(fā)芽會嚴重影響降落值等，對蛋白質質量的影響大于對蛋白質含量的影響，對面粉品質的影響在品種間存在差異。晏本菊等[2]也認為，降落值是影響四川省小麥加工品質的主要因素之一，是受年份天氣情況影響最大的品質性狀。國家級品種試驗的品質分析僅采用降落值高于200 s的樣品，把降落值低于200 s的樣品視為芽麥，本研究根據測試樣品的混合點數推測在長江上游麥區(qū)小麥穗發(fā)芽普遍存在，且品種間穗發(fā)芽抗性有較大差異，具高穗發(fā)芽抗性的品種較少。如果將參試品種的全部樣品混合用于品質分析，那么符合中筋標準的品種數量會更少。對長江上游麥區(qū)的品質育種，提高穗發(fā)芽抗性是改良的關鍵。

本研究檢測的TaPHS1是位于3AS上的主效抗穗發(fā)芽基因[13]，該基因啟動子區(qū)的序列突變是穗發(fā)芽抗性的主要原因[14]，但我們試了多次，其分型結果不理想，本研究結果僅為該基因第646堿基G/A SNP的KASP標記結果。TaSdr-A1位于2A染色體上，一個SNP的差異與發(fā)芽指數高度相關，具有抗性的TaSdr-A1a在中國地方品種中頻率很高[15]。在本研究中，這兩個位點不能很好區(qū)分長江上游區(qū)試品種(系)的穗發(fā)芽抗性，對TaPHS1位點基因型還需要進一步檢測其啟動子區(qū)及其他位置的SNP才能得到判斷，也需要進一步開發(fā)其他控制穗發(fā)芽的位點。

3.1.2 長江上游小麥品種蛋白質數量和質量指標的不均衡嚴重影響該區(qū)小麥品質

粗蛋白質含量是蛋白質數量指標，穩(wěn)定時間是蛋白質質量指標，而濕面筋含量與蛋白質的數量和質量均相關。胡學旭等[28-29]認為，我國小麥從加工品質指標來看，品質類型間互相交錯，強筋不強，弱筋不弱；弱筋小麥蛋白質和濕面筋含量逐年上升，使弱筋特性逐漸下降。強筋小麥的沉降值逐年下降，而弱筋小麥呈上升趨勢，導致強、弱筋小麥品質下降。從本研究結果看，長江上游麥區(qū)小麥品質現狀是弱筋品種少，大部分中筋品種的蛋白質數量和質量不均衡，導致適合優(yōu)質面條、饅頭加工的品種較少，而傳統(tǒng)的適合釀酒用的小麥品種因蛋白質含量的提高等，也逐漸不能滿足釀酒企業(yè)的需求。

適宜的栽培措施可影響蛋白質數量。本研究中，對照品種川麥42和15個試驗二年品種的品質結果表明，部分品種在適宜的地點和栽培條件下，可望生產完全達標的中筋小麥或弱筋小麥。本研究中的81個不完全達標的中筋品種(系)中，有38個粗蛋白質含量達到中筋及以上，而穩(wěn)定時間為弱筋的品種(系)，為高數量低質量型品種；有14個粗蛋白質含量為弱筋，而穩(wěn)定時間為中筋的品種，為低數量高質量型(表6)。針對蛋白質數量和質量不均衡的品種，可調整栽培方式，將38個高數量、低質量型品種的粗蛋白質含量降到12%以下，14個低數量、高質量型品種的粗蛋白質含量提高到12%以上，從而提高長江上游麥區(qū)中筋小麥品質。而在遺傳改良上，將提高穗發(fā)芽和提高穩(wěn)定時間(前38個品種)或降低穩(wěn)定時間(后14個品種)設為品質改良目標，也能提高該區(qū)小麥品質。

3.2 KASP標記檢測基因型在育種中的意義

明確育種群體和育成品種中關鍵性狀的基因型，是育種家進行品種改良和分子育種的基礎，KASP標記提供了一種高通量檢測基因型的方法。Rasheed等[6]開發(fā)了70個小麥已克隆基因的KASP標記用于小麥育種材料的基因型檢測，涉及光周期等多個性狀；中國農科院作科所夏先春老師實驗室在繼續(xù)開發(fā)更多已克隆基因的KASP標記(董亞超私人通信)。

目前，有些KASP標記的有效性還需要在育種群體中進一步驗證，主要有以下兩個原因。首先，一個基因的SNP較多，對基因單倍型的清楚認識是KASP標記應用于育種的基礎。KASP標記是根據基因內某個SNP設計的，單個SNP不能完全代表基因型，育種家需要尋找適合自己育種群體的單倍型用于基因型選擇。如本研究中檢測的TaPHS1位點，在其啟動子區(qū)-222，編碼區(qū)646和666位置的SNP對穗發(fā)芽抗性都很重要[14]；本研究使用的Glu-A1位點的KASP標記是依據該位點第1883堿基處的InDel開發(fā)的標記，而沒有依據該位點1594堿基處G/A單堿基的差異，故不能區(qū)分1和2*亞基[10]。其次，某些位點等位基因的復雜性使分子標記的準確率有待進一步驗證。如本研究檢測的小麥低分子量麥谷蛋白亞基等位基因Glu-A3g、Glu-B3g和Glu-A3d三個分子標記的結果還需驗證。

小麥品質是復雜性狀，不僅受遺傳控制，也受環(huán)境影響。本研究的5個品質指標中，面團穩(wěn)定時間與遺傳關系較為緊密，也受環(huán)境影響；而容重和粗蛋白質含量、濕面筋含量和吸水率4個性狀受環(huán)境影響更大。控制品質性狀(如穗發(fā)芽抗性)的基因很多，本研究用的20個標記是目前與小麥籽粒性狀和品質性狀較緊密的KASP標記，還有很多基因的KASP標記有待開發(fā)(如已克隆的高低分子量麥谷蛋白亞基的多個等位基因)。本研究僅僅針對部分位點進行了檢測，因而不能解釋品質的差異。期待加強基礎研究，克隆更多基因，更好地認識基因與性狀和環(huán)境的關系；更期望進一步將已有的功能標記轉化為KASP或STARP(semi-thermal asymmetric reverse PCR)[30]標記，開發(fā)更多好用的分子標記，使基礎研究的成果更好地應用于育種實踐。

4 結 論

對2012-2018共7年109個試驗品種和對照品種在長江上游麥區(qū)國家級品種試驗里的品質數據表明，(1)所有品種的測試樣的平均混合點率為0.66；(2)多數品種籽粒的商品分級在四級以上；(3)按照品種審定標準，在109個品種中，101個是中筋品種，其中有81個品種沒完全達到中筋分類指標；(4)穗發(fā)芽和蛋白質數量和質量指標不均衡是長江上游麥區(qū)的突出問題，品質改良應以增強穗發(fā)芽抗性和改良穩(wěn)定時間為主要目標。

對109個品種20個位點的KASP標記檢測，發(fā)現以下基因型是占多數的基因型：TaPHS1位點的RioBlanco type基因型，TaSdr-A1位點的A1b基因型，TaGW2-6B位點的Hap-1,2,3基因型，TaGS-D1位點的D1a基因型，TaGs2-B1位點的B1a基因型，Tabas位點的B1a基因型，TaSus2-2A位點的Hap-A基因型，TaSus1-7A位點的Hap-1,3,5基因型，TaSus1-7B位點的Hap-T基因型，TaGS5-A1位點的A1b基因型，TaGASR-A1位點的H1g基因型，Pina-D1位點的D1a基因型，Pinb-D1位點的D1a基因型，Pinb2-v2位點的B2a基因型，Glu-A1位點的1/2*基因型，Glu-D1位點2+12基因型，非Glu-A3g基因型，非Glu-B3g基因型，非Glu-A3d基因型，非1BL·1RS易位。