張 晴，姜明慧，田元勇，徐美祿，冷寒冰，劉俊榮

( 大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023 )

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)活品形式經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高，在離水至消費(fèi)終端會(huì)受到諸多因素影響導(dǎo)致活品品質(zhì)下降[1-4]。對(duì)于活品蝦夷扇貝品質(zhì)的評(píng)價(jià)目前主要集中于核苷酸系化合物、代謝酶、蛋白性質(zhì)及感官等方面。核苷酸系化合物包括K值、三磷酸腺苷、核苷酸能荷值、糖原及pH變化等[5-8]。根據(jù)不同的代謝途徑，已經(jīng)探索出多種可以作為指示鮮品品質(zhì)的酶，包括章魚堿脫氫酶[9]、精氨酸激酶[10]、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等。也可通過活品肌肉蛋白性質(zhì)來監(jiān)測(cè)其品質(zhì)，如肌球蛋白的三磷酸腺苷酶酶活性質(zhì)，肌球蛋白頭部具有分解三磷酸腺苷的能力，狀態(tài)良好時(shí)酶活性高，而在活品機(jī)體受到脅迫時(shí)酶活性就會(huì)降低，從而反映出水產(chǎn)品的品質(zhì)[11]。楊婷婷等[2,12-13]建立了蝦夷扇貝感官評(píng)價(jià)體系，從風(fēng)味角度出發(fā)，系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了活品蝦夷扇貝的品質(zhì)，并通過模擬流通鏈的形式研究了在活品流通過程中蝦夷扇貝風(fēng)味品質(zhì)的變化。目前，對(duì)于食品肌肉質(zhì)地的評(píng)價(jià)主要為感官評(píng)價(jià)，主觀性較強(qiáng)，對(duì)于活品蝦夷扇貝的閉殼肌肌肉而言，影響其口感質(zhì)地的主要因素為肌肉蛋白的收縮作用，因此，可以從肌肉蛋白的角度出發(fā)研究肌肉品質(zhì)。

肌肉蛋白溶解性通常是用來評(píng)價(jià)魚肉或畜肉在保藏期間肌肉品質(zhì)變化的重要指標(biāo)，溶解性與蛋白持水性及肌肉彈性等息息相關(guān)。在貯藏過程中，由于肌肉蛋白變性帶來的降解及聚集等會(huì)使蛋白溶解性下降，而蛋白溶解性下降也說明肌肉品質(zhì)受到影響[14-15]。對(duì)于活品來說，肌肉收縮程度也會(huì)對(duì)溶解性造成影響。肌球蛋白為肌原纖維蛋白的主要組成部分，參與調(diào)控肌肉收縮，肌球蛋白頭部具有三磷酸腺苷酶活性，尾部為纖維絲狀，尾部凝集會(huì)影響溶解性。有研究按照肌肉全蛋白溶解性的差異對(duì)豬肉進(jìn)行了分類，并通過R值(肌苷酸/三磷酸腺苷)的變化比較了不同溶解性肌肉品質(zhì)差異[16]。筆者主要以軟體動(dòng)物蝦夷扇貝為研究對(duì)象，對(duì)不同活力狀態(tài)下扇貝閉殼肌蛋白溶解性進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)照分析其三磷酸腺苷分布，比較三磷酸腺苷參與下的溶解性變化機(jī)制，探究以蛋白質(zhì)溶解性為切入點(diǎn)的活品貝類評(píng)價(jià)新思路。

1 材料與方法

1.1 原料貯藏與采樣

干藏：剛采捕上岸的活品蝦夷扇貝運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行冷卻干藏，貯藏溫度為4 ℃，分別于0、48、72、96、120 h進(jìn)行采樣，每次采樣數(shù)量為5只，分別對(duì)每只扇貝進(jìn)行三磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)化合物含量測(cè)定，同時(shí)對(duì)貯藏0、48、120 h的扇貝肌肉蛋白溶解性進(jìn)行測(cè)定?；钬惒蓸雍笱杆偈止ら_殼并分離出橫紋肌與平滑肌，操作均在冰浴下完成。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)R-250(中國(guó)北京索萊寶科技有限公司)；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、無(wú)水甲醇、乙酸(中國(guó)天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；SDS-聚丙烯酰胺電泳試劑、β-巰基乙醇(美國(guó)Sigma公司)；尿素、Tris、高氯酸、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；碘化鉀(上海麥克林生化科技有限公司)；以上化學(xué)試劑均為分析純。

GL-21M高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)HERMLE Labortechnik GmbH公司)；AE-6500垂直電泳槽(日本ATTO公司)；UV-1800PC紫外—可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Milli-Q超純水凈化儀(美國(guó)Millipore公司)；HG-200高速分散均質(zhì)機(jī)(日本HSIANGTAI)； BS224S型精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；IMS-40全自動(dòng)雪花制冰機(jī)(常熟市雪科公司)。

1.3 肌肉分離及蛋白提取

漂洗碎肉：分離得到橫紋肌與平滑肌碎肉(未漂洗碎肉)。首先用緩沖液(0.05 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)對(duì)碎肉進(jìn)行漂洗，碎肉與緩沖液的比例為1∶10，攪勻后離心(2032 r/min，10 min)得沉淀物，再次加入等量緩沖液攪勻后離心，重復(fù)3次對(duì)三磷酸腺苷進(jìn)行洗脫，得到漂洗碎肉及漂洗液。

肌原纖維蛋白提取方法參照文獻(xiàn)[17]并加以改善。取漂洗或未漂洗碎肉，以碎肉與緩沖液(0.05 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)1∶10的比例混合后均質(zhì)3次(10 000 r/min，30 s)，進(jìn)行離心處理，并重復(fù)3次，取最終沉淀加入適量緩沖液混合均勻，過雙層紗布，即得到肌原纖維蛋白。用雙縮脲比色法對(duì)肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，并將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整到10 mg/mL備用。為探究肌肉中三磷酸腺苷存在的影響，分別設(shè)置漂洗碎肉組和未漂洗碎肉組。

肌肉蛋白勻漿：分離得到橫紋肌與平滑肌碎肉。碎肉與緩沖液(0.05 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)以1∶10的比例混合，進(jìn)行3次均質(zhì)(10 000 r/min，30 s)，即得到肌肉蛋白勻漿。基于雙縮脲比色法分析后將肌肉勻漿的蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整到10 mg/mL備用。

EGTA處理：將分離出的橫紋肌與平滑肌碎肉用含有EGTA的緩沖液(5 mmol/L EGTA，0.05 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)進(jìn)行肌肉蛋白勻漿的制備?；陔p縮脲比色法分析后將肌肉勻漿的蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整到10 mg/mL備用。

1.4 蛋白溶解性測(cè)定

雙縮脲比色法：設(shè)置9個(gè)鹽濃度梯度，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mol/L，用3 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5緩沖液和去離子水調(diào)節(jié)鹽濃度，體系中蛋白終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，將反應(yīng)體系混勻后在冰浴環(huán)境下靜置反應(yīng)20 min，在12 850 r/min條件下離心20 min，用雙縮脲比色法測(cè)上清液中的蛋白質(zhì)量濃度。溶出率為溶出蛋白占總蛋白的百分比。

1.5 三磷酸腺苷測(cè)定

固形樣品三磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)物含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[18]的方法，準(zhǔn)確稱取1 g肌肉樣品，加入10 mL 5%的高氯酸立即進(jìn)行組織搗碎10 min，加入2 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH至2.0～3.5，加水補(bǔ)體積至20 mL，離心(2032 r/min，5min)，取4 mL上清液過膜后加入1 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)，用反相高效色譜法測(cè)定三磷酸腺苷含量。

液體樣品測(cè)量時(shí)取5 mL樣品，加入10 mL 5%高氯酸，攪拌后用2 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH至2.0～3.5，其余操作與上述固體樣品測(cè)定方法一致。

1.6 核苷酸能荷的計(jì)算

核苷酸能荷(AEC)按下式計(jì)算[19]：

式中，ATP為腺苷三磷酸，ADP為二磷酸腺苷，AMP為磷酸腺苷。

1.7 蛋白質(zhì)組分分析

根據(jù)蛋白分子量的不同，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白的分布進(jìn)行分析。其中，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，染色液為考馬斯亮藍(lán)R-250，采用甲醇—乙酸混合液進(jìn)行脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 干藏期間活品蝦夷扇貝肌肉蛋白溶解性變化

2.1.1 干藏期間活品活力的變化趨勢(shì)

為探究干藏對(duì)蝦夷扇貝活力狀態(tài)的影響，對(duì)活貝閉殼肌的三磷酸腺苷及其關(guān)聯(lián)物進(jìn)行跟蹤測(cè)定，以三磷酸腺苷含量和核苷酸能荷值為生命活力狀態(tài)指標(biāo)進(jìn)行分析。在120 h的冷卻干藏期間，活品閉殼肌中三磷酸腺苷含量呈下降趨勢(shì)(圖1)。初始原料中三磷酸腺苷含量高達(dá)5 μmol/g，隨著干藏時(shí)間延長(zhǎng)三磷酸腺苷逐漸降解，干藏48 h后三磷酸腺苷含量為3.25 μmol/g，當(dāng)貯藏時(shí)間到達(dá)120 h時(shí)，三磷酸腺苷幾乎消耗殆盡；核苷酸能荷值由最初的90.64%降至16.02%，分析結(jié)果同樣顯示出扇貝活力下降的趨勢(shì)。三磷酸腺苷含量和核苷酸能荷值的結(jié)果均可以看出蝦夷扇貝經(jīng)過干藏后生命狀態(tài)的減弱。

2.1.2 干藏期間閉殼肌蛋白溶解性變化

干藏期間扇貝肌肉蛋白溶解性變化結(jié)果見圖2。經(jīng)貯藏的扇貝肌肉蛋白溶解性均高于原料，干藏時(shí)間越長(zhǎng)肌肉蛋白溶解性越高，干藏120 h的蛋白溶解性明顯高于48 h扇貝，與干藏期間肌肉三磷酸腺苷及核苷酸能荷的變化趨勢(shì)恰好相反。可見，活品扇貝肌肉溶解性與其三磷酸腺苷的含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

圖2 干藏時(shí)間對(duì)活品蝦夷扇貝肌肉蛋白溶解性的影響

2.1.3 橫紋肌與平滑肌的三磷酸腺苷及蛋白溶解性

通過對(duì)扇貝原料閉殼肌不同肌肉組織中的三磷酸腺苷含量及相應(yīng)蛋白溶解性的分析比較，來探究閉殼肌中的三磷酸腺苷是否會(huì)對(duì)其蛋白溶解性的分析產(chǎn)生干擾。分別對(duì)蝦夷扇貝橫紋肌與平滑肌的三磷酸腺苷及肌肉蛋白溶解性進(jìn)行比較，橫紋肌三磷酸腺苷含量明顯高于平滑肌(圖3)；兩種肌肉在蛋白溶解性方面也有明顯差異，平滑肌肌肉蛋白溶解性明顯高于橫紋肌(圖4)。

圖3 活品蝦夷扇貝中橫紋肌與平滑肌的三磷酸腺苷含量

圖4 活品蝦夷扇貝橫紋肌與平滑肌的肌肉蛋白溶解性

2.2 三磷酸腺苷的存在對(duì)肌肉蛋白溶出效果的影響

為探究活品蝦夷扇貝閉殼肌中的三磷酸腺苷是否會(huì)對(duì)其蛋白溶解性的分析產(chǎn)生干擾，進(jìn)一步通過對(duì)三磷酸腺苷進(jìn)行抑制或排除，探究三磷酸腺苷的存在對(duì)肌肉蛋白溶出過程的影響機(jī)制。采用Ca2+螯合劑EGTA對(duì)三磷酸腺苷酶活性進(jìn)行抑制，試驗(yàn)分為添加5 mmol/L EGTA的處理組和未添加EGTA的對(duì)照組。結(jié)果顯示，EGTA處理組的肌肉蛋白溶解性顯著高于對(duì)照組(圖5)。

圖5 EGTA對(duì)活品蝦夷扇貝肌肉蛋白溶解性的影響

對(duì)閉殼肌碎肉進(jìn)行漂洗，設(shè)置漂洗組和未漂洗組，處理步驟見材料與方法1.3肌肉分離及蛋白提取。每次漂洗后洗脫液中三磷酸腺苷的含量見圖6。結(jié)果表明，漂洗處理對(duì)碎肉三磷酸腺苷有洗脫作用；首次漂洗的三磷酸腺苷洗脫效果最明顯，漂洗液中三磷酸腺苷含量為0.51 μmol/g，之后的洗脫效果顯著降低，第2、3次漂洗液中三磷酸腺苷含量已經(jīng)很低，分別為0.05 μmol/g和0.03 μmol/g。值得指出的是，與原料肌肉中5.26 μmol/g(未在圖中顯示)的三磷酸腺苷含量相比，漂洗處理的三磷酸腺苷脫除效果比較有限。

圖6 蝦夷扇貝閉殼肌碎肉漂洗液中三磷酸腺苷含量

分別對(duì)漂洗前后的碎肉進(jìn)行肌原纖維蛋白提取并測(cè)定其溶解性，結(jié)果見圖7。與未漂洗組相比，漂洗組的肌肉蛋白溶解性有明顯的升高。如前所述，漂洗對(duì)三磷酸腺苷有洗脫作用，由此可以判斷，三磷酸腺苷含量越高肌肉蛋白溶解性越低，即三磷酸腺苷的存在對(duì)肌肉蛋白溶出有制約作用。

圖7 蝦夷扇貝閉殼肌碎肉漂洗脫除三磷酸腺苷后肌原纖維蛋白溶解性

為進(jìn)一步探索三磷酸腺苷在肌肉蛋白溶出過程中的作用，對(duì)三磷酸腺苷漂洗后的肌原纖維蛋白溶解產(chǎn)物進(jìn)行組分分析(圖8)。結(jié)果表明，在鹽濃度為0.3～0.6 mol/L下三磷酸腺苷漂洗組的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白顯著高于未漂洗對(duì)照組。

圖8 碎肉漂洗脫除三磷酸腺苷后蝦夷扇貝閉殼肌肌原纖維蛋白溶出變化

2.3 肌肉均質(zhì)過程中的三磷酸腺苷降解

肌肉蛋白提取過程中三磷酸腺苷降解對(duì)蛋白溶解效果有影響，因此，需要進(jìn)一步探跟蹤分析肌肉細(xì)胞破碎前后三磷酸腺苷含量的變化。分別對(duì)活貝肌肉及其通過未漂洗組操作后的均質(zhì)肌肉勻漿中三磷酸腺苷含量進(jìn)行檢測(cè)?；钬惣∪庵腥姿嵯佘盏暮扛哌_(dá)4.0 μmol/g，在進(jìn)行均質(zhì)處理(10 000 r/min，30 s)3次后三磷酸腺苷全部降解，大量的二磷酸腺苷生成(圖9)。此結(jié)果證實(shí)了三磷酸腺苷對(duì)肌肉溶解性的影響主要發(fā)生在溶出過程，即細(xì)胞破碎處理的均質(zhì)階段，原因是高含量的三磷酸腺苷在均質(zhì)過程全部降解，所釋放的能量使肌肉粗絲與細(xì)絲收縮，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白發(fā)生收縮凝集導(dǎo)致溶解性降低。因此，在活品蝦夷扇貝肌肉中三磷酸腺苷的存在會(huì)對(duì)溶解性的測(cè)定造成影響。

圖9 蝦夷扇貝閉殼肌均質(zhì)過程三磷酸腺苷含量的變化

3 討 論

3.1 三磷酸腺苷與活品扇貝肌肉蛋白溶解性的關(guān)聯(lián)

肌肉蛋白溶解性與肌肉品質(zhì)特別是咀嚼感密切相關(guān)，往往用做魚品品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)。李強(qiáng)[20]在對(duì)草魚(Ctenopharyngodonidellus)冷藏過程中肌肉蛋白性質(zhì)變化的研究中發(fā)現(xiàn)，草魚肌動(dòng)球蛋白溶解性呈下降趨勢(shì)，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，下降趨勢(shì)逐漸減緩，而肌動(dòng)球蛋白鹽溶解性的下降可能是凍藏過程中草魚肌肉蛋白質(zhì)變性引起的，尤其是肌球蛋白的降解。李娜等[21]在對(duì)冰藏過程尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)魚片肌肉蛋白質(zhì)變化的研究中推測(cè)，肌原纖維蛋白含量下降可能由于尼羅羅非魚冷藏期間肌肉組織中內(nèi)源性蛋白酶持續(xù)作用于蛋白質(zhì)，同時(shí)微生物的生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生大量外源性蛋白酶，共同作用使蛋白質(zhì)降解。因此，對(duì)于凍藏魚類來說，肌肉蛋白變性帶來的降解、聚集等原因使蛋白溶解性發(fā)生變化，使魚肉品質(zhì)受到破壞?；钇坟愵愘A藏中溶解性變化與冷凍魚類有明顯的差異。對(duì)于活體貝類來說，三磷酸腺苷為生命機(jī)體主要能量代謝物質(zhì)，并且與肌肉收縮密切相關(guān)[22]，而肌肉蛋白溶解性也與肌肉收縮密不可分。在本試驗(yàn)中，隨著蝦夷扇貝生命活力的下降，三磷酸腺苷的含量明顯降低，但是溶解性顯著升高。說明三磷酸腺苷與溶解性之間可能存在負(fù)相關(guān)性。貝類的閉殼肌由橫紋肌和平滑肌構(gòu)成，橫紋肌占閉殼肌的大部分，平滑肌僅占閉殼肌的一小部分，兩種類型的肌肉在肌肉組織形態(tài)、蛋白組成、溶解性等方面均存在差異[23]，并且兩種類型的肌肉主導(dǎo)著貝類不同的收縮狀態(tài)。在針對(duì)閉殼肌兩種肌肉類型肌肉即橫紋肌與平滑肌的研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷含量較高的橫紋肌，其蛋白溶解性明顯低于三磷酸腺苷含量較低的平滑肌，這也說明對(duì)于活品貝類而言，三磷酸腺苷與肌肉蛋白溶解性有著密不可分的關(guān)聯(lián)。

3.2 三磷酸腺苷對(duì)活品扇貝肌肉蛋白溶解性干擾作用

采用EGTA對(duì)Ca2+進(jìn)行螯合處理，進(jìn)而抑制三磷酸腺苷酶活性使三磷酸腺苷失去調(diào)節(jié)作用后再對(duì)肌肉蛋白溶解性進(jìn)行分析比較。三磷酸腺苷在活品蝦夷扇貝閉殼肌肌肉收縮過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)與兩種收縮蛋白肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白有關(guān)。肌球蛋白頭部具有三磷酸腺苷酶活性，在Ca2+存在下可以分解三磷酸腺苷產(chǎn)生能量，從而促進(jìn)肌絲滑動(dòng)引起肌肉收縮[22,24-25]。本研究中，EGTA的加入抑制了三磷酸腺苷酶活性，有效阻擋了三磷酸腺苷降解，由此判斷肌肉蛋白溶解性與肌肉中的三磷酸腺苷有密切關(guān)聯(lián)。而通過漂洗肌肉對(duì)三磷酸腺苷進(jìn)行洗脫后也導(dǎo)致其溶解性的升高，進(jìn)一步證實(shí)了蝦夷扇貝肌肉蛋白溶解性與三磷酸腺苷之間的關(guān)聯(lián)。肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白與肌肉收縮密切相關(guān)，活體肌肉收縮依賴三磷酸腺苷降解所提供的能量；三磷酸腺苷是調(diào)節(jié)肌肉收縮的重要能量物質(zhì)，當(dāng)三磷酸腺苷消耗殆盡時(shí)肌原纖維蛋白粗絲與細(xì)絲便會(huì)無(wú)法進(jìn)行收縮而使肌絲緊密結(jié)合[26,27]。閉殼肌肌原纖維蛋白中的肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白在三磷酸腺苷存在下，發(fā)生類似活體收縮的肌動(dòng)球蛋白形成，即超沉淀現(xiàn)象[28]，導(dǎo)致溶解性下降，三磷酸腺苷漂洗組與未漂洗組的溶解性差異說明了三磷酸腺苷的存在對(duì)肌肉蛋白溶出的干擾效應(yīng)。

4 結(jié) 論

活力狀態(tài)好的活品蝦夷扇貝閉殼肌富含三磷酸腺苷，且橫紋肌三磷酸腺苷含量高于平滑肌。冷卻干藏期間三磷酸腺苷呈下降趨勢(shì)，5 d內(nèi)三磷酸腺苷耗盡，同時(shí)伴隨著肌肉蛋白質(zhì)溶解性上升。漂洗閉殼肌碎肉有三磷酸腺苷洗脫效果，肌肉細(xì)胞破碎過程會(huì)引起三磷酸腺苷降解。無(wú)論是抑制三磷酸腺苷酶活性還是對(duì)三磷酸腺苷進(jìn)行洗脫，均會(huì)提高肌肉蛋白溶解性。三磷酸腺苷對(duì)肌肉蛋白溶出效果的影響機(jī)制發(fā)生在肌肉細(xì)胞破碎過程中，三磷酸腺苷降解引起肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白發(fā)生凝集收縮導(dǎo)致蛋白溶解性下降。對(duì)于捕后早期富含三磷酸腺苷的活品蝦夷扇貝，肌肉蛋白溶解性是否能夠作為其品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)，還需進(jìn)一步對(duì)三磷酸腺苷及溶解性的關(guān)聯(lián)進(jìn)行系統(tǒng)探明。