王鳳儒 徐京育 杜 琳 成春鋒 梁 群△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

心肌缺血是由于冠脈循環(huán)與心肌供需失衡而引起的一類臨床常見(jiàn)疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病死率高，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量［1-3］。近年來(lái)隨著中醫(yī)藥對(duì)心肌缺血保護(hù)作用的研究逐漸深入，臨床上治療心肌缺血的中成藥復(fù)方制劑日益增多［4-7］。中醫(yī)藥治療冠心病心絞痛臨床效果顯著且耐藥性較少，優(yōu)勢(shì)明顯［8-9］。參桂湯由丹參、苦參、玄參、桂枝4味中藥組成，是本科治療冠心病心肌缺血及心律失常的常用方劑。本實(shí)驗(yàn)予垂體后葉素誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)急性心肌缺血狀態(tài)，觀察各組大鼠心肌缺血及心律失常程度，明確參桂湯抗心肌缺血的機(jī)制及作用靶點(diǎn)，為新藥的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，雌雄各半，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.2 試藥與儀器 參桂湯，藥物組成：苦參30 g，丹參20 g，玄參20 g，桂枝15 g；由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科按原生藥質(zhì)量濃度1.530 g/mL規(guī)格煎制。0.9%氯化鈉注射液（中國(guó)大冢制藥有限公司，批號(hào)0B72H2），垂體后葉素（寧波第二激素廠，批號(hào)150624），鹽酸胺碘酮（賽諾菲杭州制藥有限公司，批號(hào)8HG0313），3%戊巴比妥鈉；乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒（富士膠片和光純藥株式會(huì)社，批號(hào)AH991），超氧化物歧化酶（SOD）活性試劑盒（北京誠(chéng)林生物科技有限公司，批號(hào)201811），丙二醛（MDA）試劑盒（北京誠(chéng)林生物科技有限公司，批號(hào)201811），一氧化氮合成酶（iNOS）試劑盒（北京誠(chéng)林生物科技有限公司，批號(hào)201811）。ECG-1150型心電機(jī)，AB204-N電子秤。低溫高速離心機(jī)（日本日立公司），穩(wěn)壓電源（天能，EPS300），超低溫冰箱（中科美菱，DW-HL328），多功能微孔板檢測(cè)儀（Infinite M1000 Pro，Tecan，瑞士），Milli-Q純水儀（Milli-Q Gradient，Millipore，美國(guó)），托盤(pán)天平（天津醫(yī)療器械廠），常規(guī)手術(shù)器械若干（京津醫(yī)療器械廠）。

1.3 分組與給藥 將56只大鼠隨機(jī)分為7組：空白組，假手術(shù)組（予等體積0.9%氯化鈉溶液）及模型組（予等體積0.9%氯化鈉溶液），胺碘酮（25 mg/kg）組，參桂湯高（3.060 g/200 g）、中（1.530 g/200 g）、低（0.765 g/200 g）劑量組，每組8只，連續(xù)灌胃給藥14 d。

1.4 模型制備 末次給藥1 h后，稱取大鼠體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，固定并連接心電圖機(jī)，測(cè)定心電圖至正常（麻醉后測(cè)定心電圖S點(diǎn)不高于基線為合格）。于5～10 s內(nèi)完成各組大鼠舌下靜脈注射垂體后葉素（0.5 U/kg，1 U/mL），空白組及假手術(shù)組除外。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 觀察并記錄注射垂體后葉素后各組大鼠5、15、30、60、300 s的ECG，20 min后處死大鼠，于腹主動(dòng)脈處采血5 mL，放置于4℃冰箱1 h，3 000 r/min冷凍離心10 min，取血清2 mL放入EP管內(nèi)，-80℃冰箱保存。測(cè)定時(shí)快速解凍，ELISA法測(cè)定血清iNOS、MDA含量和SOD的活性，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A值（波長(zhǎng)為450 nm）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。進(jìn)行組間方差分析及t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間段心電圖ST段表現(xiàn)比較 見(jiàn)表1。在注射垂體后葉素之前各組之間無(wú)明顯差異，注射垂體后葉素后，模型組在5 s時(shí)ST段顯著抬高，抬高幅度超過(guò)0.1 mV，與空白組比較具有顯著差異（P<0.01），提示造模成功。模型組給藥后15 s內(nèi)ST段持續(xù)升高，30 s時(shí)出現(xiàn)回落，60 s回落明顯，300 s時(shí)ST段接近于正常。各給藥組在注射垂體后葉素后均能夠?qū)筍T段的升高，升高幅度均不超過(guò)0.1 mV，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。各給藥組ST段在15 s時(shí)已出現(xiàn)明顯回落，時(shí)間較模型組提前，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。造模后60 s，與模型組比較，各藥物組ST段均顯著性降低，效應(yīng)強(qiáng)度為：胺碘酮組>參桂湯高劑量組>參桂湯中劑量組>參桂湯低劑量組。

表1 各組大鼠不同時(shí)間段心電圖ST段表現(xiàn)比較（mV，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間段心電圖ST段表現(xiàn)比較（mV，±s）

與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同

注射垂體后葉素后組 別n 注射垂體后葉素前5 s 15 s 30 s 60 s 300 s空白組假手術(shù)組模型組胺碘酮組參桂湯低劑量組參桂湯中劑量組參桂湯高劑量組8 8 8 8 8 8 8 0.03±0.02 0.02±0.02 0.02±0.03 0.02±0.02 0.02±0.02 0.02±0.01 0.03±0.01 0.05±0.02△△0.03±0.01△△0.22±0.15 0.06±0.05△△0.09±0.03△0.07±0.06△0.05±0.07△△0.04±0.01△△0.02±0.02△△0.25±0.11 0.03±0.03△△0.04±0.02△△0.04±0.03△△0.02±0.03△△0.04±0.03△0.02±0.02△0.21±0.12 0.02±0.01△△0.04±0.02△0.03±0.01△△0.02±0.01△△0.04±0.02△△0.03±0.02△△0.14±0.09 0.02±0.03△△0.03±0.01△△0.01±0.02△△0.02±0.00△△0.04±0.01△△0.03±0.03△△0.06±0.03 0.01±0.00△△0.02±0.00△△0.01±0.00△△0.01±0.00△△

2.2 各組血清iNOS、MDA、SOD水平比較 見(jiàn)表2。空白組與假手術(shù)組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組大鼠血清中iNOS、MDA的活性水平明顯高于空白組，SOD活性水平顯著低于空白組（P<0.05），提示造模成功。各給藥組與模型組比較血清SOD活性水平不同程度提高，血清MDA、iNOS活性水平不同程度降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。在降低iNOS和MDA方面，參桂湯高、中劑量組與胺碘酮組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），參桂湯低劑量組降低大鼠血清中MDA的水平不如胺碘酮組有效（P<0.01）。

表2 各組血清iNOS、MDA、SOD水平比較（±s）

表2 各組血清iNOS、MDA、SOD水平比較（±s）

組別空白組假手術(shù)組模型組胺碘酮組參桂湯低劑量組參桂湯中劑量組參桂湯高劑量組n 8 8 8 8 8 8 8 iNOS（μmol/L）0.59±0.015 0.62±0.017 1.71±0.105**1.19±0.128△△1.39±0.038△△1.15±0.069△△0.95±0.080△△MDA（nmol/L）0.79±0.418 0.91±0.180 1.68±0.131*1.22±0.059△1.40±0.019△1.23±0.108△△1.09±0.076△△SOD（ng/L）45.67±5.894 44.85±8.678 14.28±4.740**32.40±1.264△△18.95±0.263△28.88±0.620△△31.30±0.876△△

3 討 論

1938年Milville用垂體后葉素成功建立急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，此后學(xué)者對(duì)該模型分別從心電圖、冠脈流量、血流動(dòng)力學(xué)等方面進(jìn)行缺血效應(yīng)的觀察，均取得了良好的效果，因此常被用于模擬臨床變異性心絞痛的發(fā)病過(guò)程。該模型操作簡(jiǎn)單易行，成功率高，可以用不同劑量的垂體后葉素造成不同程度的心肌缺血損傷，后來(lái)也成為眾多學(xué)者研發(fā)抗心肌缺血藥物的經(jīng)典模型。垂體后葉素中含有血管升壓素，大劑量的垂體后葉素能夠使全身血管平滑肌收縮，該作用更多的突出表現(xiàn)在收縮毛細(xì)血管和小動(dòng)脈，造成外周阻力增加，血壓升高，加重心臟負(fù)荷，同時(shí)也可引起冠脈血管痙攣，造成心肌急性缺血缺氧［10］。我們采用此模型來(lái)觀察參桂湯對(duì)垂體后葉素所致大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用。

心電圖ST段的變化反映了心肌缺血性損傷的范圍及程度，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明參桂湯高、中、低劑量均能夠明顯抑制垂體后葉素引起的大鼠心電圖ST段的變化，降低大鼠心肌缺血的程度和陽(yáng)性率，說(shuō)明參桂湯具有抗心肌缺血作用。

當(dāng)心肌急性缺血缺氧時(shí)，無(wú)氧糖酵解就會(huì)成為ATP的主要來(lái)源［11］，氧自由基的生成就會(huì)增加，造成廣泛的氧化損傷，并可激發(fā)炎癥反應(yīng)［12］。同時(shí)氧自由基的增加也會(huì)加重脂質(zhì)過(guò)氧化，SOD是氧自由基的主要代謝酶，主要作用是清除氧自由基，減輕氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損傷［13］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，SOD的活性水平會(huì)明顯下降，SOD可以用于評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度［14］。MDA是氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其活性水平能夠反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度以及細(xì)胞損傷程度［15］。iNOS在正常生理情況下含量極低，當(dāng)發(fā)生心肌缺血缺氧時(shí)，多種炎性因子表達(dá)增多，促使巨噬細(xì)胞分泌大量的iNOS，同時(shí)iN?OS的活化也會(huì)增加炎性因子的分泌，二者惡性循環(huán)，加重心肌細(xì)胞的損傷［16］。因此MDA、SOD和iNOS能夠間接反映心肌損傷程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明參桂湯高、中、低劑量均能改善因垂體后葉素引起的大鼠急性心肌缺血，參桂湯高、中劑量組能夠顯著降低急性心肌缺血大鼠血清中MDA水平，降低iNOS的含量，提高內(nèi)源性抗氧化性酶SOD的含量，從而表明參桂湯可能通過(guò)抗氧自由基損傷，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等達(dá)到改善心肌缺血缺氧的作用。

心肌缺血在中醫(yī)可歸于“胸痹”“心悸”范疇。病理基礎(chǔ)為心之氣血兩虛日久，血瘀、濕濁等邪毒痹阻于心而致心脈不通，瘀久化熱。治療上以補(bǔ)虛為本，兼以清熱、活血、化濕。補(bǔ)虛者，補(bǔ)心之陰陽(yáng)，心陽(yáng)足則溫煦心之血脈，使血脈流通，是心陰充沛的前提條件，心陰充則心血滋養(yǎng)臟腑，使五臟得養(yǎng)，是心陽(yáng)充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。參桂湯中苦參為君藥，具有苦寒入心，清熱燥濕的作用，正如《本草經(jīng)百種錄》所言“此以味治也，苦入心，寒除火，故苦參專治心經(jīng)之火”。丹參、玄參共為臣藥。丹參苦，微寒，歸心、心包、肝經(jīng)，中醫(yī)古語(yǔ)云：一味丹參飲，功同四物湯；《本草綱目》記載其有活血，通心包絡(luò)的功效；《醫(yī)林改錯(cuò)》中強(qiáng)調(diào)治療心悸時(shí)若百方無(wú)效，則可換用活血化瘀之法，可見(jiàn)奇功。丹參一味既補(bǔ)血又活血，實(shí)乃心經(jīng)要藥。玄參苦、微寒，入腎經(jīng)，滋養(yǎng)腎陰。心腎兩臟以少陰經(jīng)相連，腎陰充則可消心火又不傷心陽(yáng)。以桂枝為佐藥，桂枝一味其味辛、甘、溫，其溫陽(yáng)之效甚佳，又不似附子之燥熱，又入心、肺、膀胱經(jīng)，《別錄》云“桂通血脈”，《素問(wèn)》曰“心主身之血脈”，故而桂枝乃溫心陽(yáng)、通血脈之佳品，丹參養(yǎng)心陰，桂枝補(bǔ)心陽(yáng)，兩者合用，效果甚佳。參桂湯藥味少，療效高，具有補(bǔ)虛、清熱、活血、燥濕的作用。綜上所述，參桂湯通過(guò)提高SOD活性水平，降低氧自由基含量，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化，從而起到保護(hù)缺血心肌的作用。