陳志娜，薛詠振，葉韜,2，劉天，沈業(yè)橋

1(淮南師范學(xué)院 生物工程學(xué)院， 安徽 淮南， 232038)2(資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮南， 232038)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，好氧，分布廣泛[1]，在其生長(zhǎng)代謝的過程中能夠分泌多種抗菌物質(zhì)，包括核糖體合成的抗菌蛋白和抗菌肽，如細(xì)菌素，和非核糖體合成的脂肽類化合物[2-3]，主要有Iturin、Fengycin和Surfactin三大類[4-5]。脂肽類化合物是由疏水脂肪酸尾部和親水寡肽結(jié)構(gòu)構(gòu)成的雙親分子[6]。與細(xì)菌素相比，脂肽具有耐熱性和抗蛋白酶水解等優(yōu)點(diǎn)，此外，脂肽還具有廣譜抗菌、抗支原體、抗腫瘤、抗病毒等生物活性[7]。表面活性素(Surfactin)是由C12～C17的β-脂肪酸鏈和7個(gè)氨基酸構(gòu)成的環(huán)狀脂肽，作為一種生物表面活性劑，與化學(xué)表面活性劑相比具有毒性低和生物降解性高等特點(diǎn)，并且可以在極端的溫度、pH和鹽度下保持表面活性[8]。Surfactin是目前已知最有效的生物表面活性劑之一，能顯著降低水的表面張力，可有效抑制真菌、細(xì)菌等的生長(zhǎng)，且乳化和氣泡特性顯著，在食品加工保藏、飼料養(yǎng)殖、化妝品、生物醫(yī)藥、石油工業(yè)等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值，越來越受到人們的關(guān)注[9]。

神仙豆是皖北地區(qū)民間發(fā)酵豆制品，是大豆經(jīng)浸泡、煮熟、密封后自然發(fā)酵而成，其發(fā)酵菌種主要為芽孢桿菌屬[10]。本研究以從神仙豆中篩選出的芽孢桿菌為研究對(duì)象，采用血平板法、排油法、抑菌實(shí)驗(yàn)及特定基因檢測(cè)等方法，對(duì)產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的菌株進(jìn)行篩選與鑒定，并對(duì)其所產(chǎn)脂肽的特性及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為該菌株在食品加工及保藏中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

待測(cè)菌株，分離自皖北特色神仙豆；黑曲霉Aspergillusniger，淮南師范學(xué)院食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室保藏；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、16S rDNA細(xì)菌鑒定試劑盒、PCR反應(yīng)相關(guān)試劑，上海生工；成品血瓊脂培養(yǎng)基，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；乙腈、三氟乙酸、甲醇(均為色譜級(jí))，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；EX Zone2電子天平，深圳安普特電子科技有限公司；BSC-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠； ABI 型PCR儀，美國(guó)ABI公司；GEL DOC XR凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-rad；5804R型離心機(jī)，Eppendorf公司；HPLC2998高效液相色譜，Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選與鑒定

1.3.1.1 血平板初篩

在無菌條件下，將活化后的菌株轉(zhuǎn)接到血瓊脂平板培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)48 h后觀察菌落周圍有無溶血現(xiàn)象并記錄。

1.3.1.2 發(fā)酵上清液制備

將活化后的菌株轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、140 r/min 的搖床中培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心10 min后，發(fā)酵上清液過0.45 μm孔徑水系濾膜除菌，進(jìn)行性質(zhì)測(cè)定。

1.3.1.3 排油活性檢測(cè)

取60 mL無菌水加入到直徑為90 mm玻璃皿中，在水面上加入5 mL液體石蠟，形成油膜后加入0.2 mL無菌發(fā)酵上清液，形成排油圈，測(cè)量直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.1.4 抑黑曲霉活性測(cè)定

黑曲霉于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，吸取10 mL生理鹽水加入到培養(yǎng)基中，用接種環(huán)刮取孢子溶解到生理鹽水中，混勻后，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)[11]，配制孢子濃度為104～105CFU/mL的孢子懸液，振蕩均勻。取100 μL孢子懸液均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)中，用無菌鑷子將無菌牛津杯置于培養(yǎng)基中心，吸取150 μL發(fā)酵上清液注入牛津杯中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，觀察抑菌效果[12]。

1.3.1.5 脂肽合成相關(guān)基因檢測(cè)

將待測(cè)菌株接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心收集沉淀，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取待測(cè)菌株的總DNA。擴(kuò)增引物序列參考文獻(xiàn)[13]，引物sfp(編碼Surfactin合成中的4′-phosphopantetheiny transferase，675 bp)：sfpF (5′-ATGAAGTTTACGGAAT-TTA-3′)，sfpR (5′-TTATAAAAGCTCTTCGTACG-3′)；引物ituD(編碼ituD synthetase D， 1203 bp)：ituDF (5′-ATGAACAATCTTGCCTTTTTA-3′)，ituDR (5′-TTATTTTAAAATCCGCAATT-3′)；lpa-14 (編碼脂肽抗菌素iturin A，675 bp)：lpa-14F (5′-GAAAATTTACGGAGTATATATGGACCGC-3′)，lpa-14R (5′-TT-ATAACAGCTCTTCATACGTTTTCATCTC-3′)。PCR采用25 μL體系，以待測(cè)菌株基因組DNA為模板，反應(yīng)條件：擴(kuò)增sfp為94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，48 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min；檢測(cè)ituD和lpa-14為94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，58 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，拍照分析。

1.3.1.6 菌株鑒定

以待測(cè)菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR采用25 μL體系，反應(yīng)條件為： 94 ℃、5 min； 94 ℃、30 s，55 ℃、30 s； 72 ℃、1.5 min，共30個(gè)循環(huán)； 72 ℃、5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行序列相關(guān)性分析，采用MEGA 4.0軟件、以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 脂肽粗提物定性分析

1.3.2.1 Surfactin的制備及傅里葉變換紅外光譜分析

將菌株BS6-2接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃、170 r/min搖床培養(yǎng)2 d，取一定量發(fā)酵液10 000r/min離心20 min去除菌體。參考NAIR等[14]的方法，發(fā)酵上清液經(jīng)酸沉、酸洗、堿中和后用冷凍干燥得Surfactin提取物。利用溴化鉀壓片法對(duì)Surfactin提取物進(jìn)行紅外光譜掃描，確定樣品中的主要官能團(tuán)。

1.3.2.2 高效液相色譜定性分析

參考朱震等[15]的條件，略有修改。高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分析系統(tǒng)Waters Breeze HPLC，色譜柱為Waters RP-C18Analytical Column(5 μm，4.6 nm×250 nm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30 ℃；采用等梯度洗脫進(jìn)行樣品分析，所用流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水(含0.1%三氟乙酸)，流動(dòng)相比例V(A)∶V(B)=70∶30，流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2.3 超高效液相色譜-電噴霧四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-electron spray ionization-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-ESI/Q-TOF MS)分析

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測(cè)模式；離子源溫度為20 ℃；毛細(xì)管電壓3 000 V；錐孔電壓30 V；去溶劑氣體流速500 L/h；去溶劑溫度500 ℃；錐孔氣流50 L/h；范圍m/z100～1 500，檢測(cè)時(shí)間10 min。

1.3.3 Surfactin粗品乳化特性分析

1.3.3.1 乳化指數(shù)(E24測(cè)定)

(1)

式中：h1為乳化層高度；h2為液體總高度。

1.3.3.2 乳化穩(wěn)定性測(cè)定

參考朱震等[15]的方法，將振蕩混勻后的乳化液靜置96 h，每間隔24 h測(cè)量乳化指數(shù)，按公式(2)計(jì)算乳化穩(wěn)定性：

(2)

式中：E0為靜置0 h時(shí)溶液的乳化指數(shù)，Et為溶液靜置th時(shí)的乳化指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

從神仙豆中共分離出25株菌株，經(jīng)血瓊脂平板初篩，篩選出5株溶血效果明顯的菌株BS6、BS6-2、BS17和BS18和BS19。5株菌株的排油圈直徑、抑黑曲霉效果如表1所示，菌株合成Surfactin和Iturin A的相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由表1可知，菌株BS6和BS6-2的排油圈直徑最大；BS6-2、BS17和BS18的發(fā)酵上清液對(duì)黑曲霉的抑制效果最好，說明5株菌均能產(chǎn)生脂肽。由圖1可知，菌株BS6、BS6-2中擴(kuò)增出sfp基因，菌株BS17、BS18、BS19中擴(kuò)增出sfp和lpa-14基因，5株菌中均沒擴(kuò)增到ituD基因。說明菌株BS6、BS6-2所產(chǎn)脂肽可能為Surfactin，菌株BS17、BS18、BS19所產(chǎn)脂肽可能為Surfactin和Iturin A。進(jìn)一步對(duì)5株菌所產(chǎn)脂肽(1 mg/mL)對(duì)黑曲霉的抑制活性進(jìn)行測(cè)定(表1)，結(jié)果表明，5種脂肽均有抑菌效果，其中菌株BS6-2所產(chǎn)脂肽對(duì)黑曲霉的抑制效果最強(qiáng)。綜上，BS6-2的排油圈直徑和抑菌效果均最佳，因此，挑選該菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 菌株的排油能力和對(duì)黑曲霉的抑制效果比較Table 1 Comparison of oil-spread capability and anti-Aspergillus niger activity among screened bacterial strains

M-DL 2000 Marker；1、4、7、10、13-菌株BS6、BS6-2、BS17、BS18、BS19的sfp基因；2、5、8、11、14-菌株BS6、BS6-2、BS17、BS18、BS19的ituD基因；3、6、9、12、15-菌株BS6、BS6-2、BS17、BS18、BS19的lpa-14基因圖1 脂肽相關(guān)基因(sfp、ituD、lpa-14)擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1 Specific amplified results of lipopeptide related genes(sfp, ituD, lpa-14)

2.2 菌株BS6-2的鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，獲得菌株BS6-2的16S rDNA序列片段。進(jìn)一步經(jīng)過BLAST在線比對(duì)，該序列與B.subtilisstrain subtilis (MN611449.1)、B.subtilis(AJ276351.1)、B.subtilisstrain 50-1 (MH475924.1)、B.subtilisstrain SR2-27 (MN421466.1)的相似性達(dá)到99%，與相近種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，初步確定菌株BS6-2為枯草芽孢桿菌B.subtilis。Bacillus屬可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)和蛋白酶、淀粉酶等酶類，在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用。LEE等[9]從韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品chungkookjang中分離篩選出1株脂肽產(chǎn)生菌Bacillussp. LM7，經(jīng)鑒定LM7所產(chǎn)脂肽共包含8種物質(zhì)，分別為4種芽孢菌霉素D和4種Surfactin 同系物；ZHANG等[17]從番茄根際篩選出1株具有抑真菌活性的菌株B.amyloliquefaciensW10，其抑菌活性物質(zhì)為Iturin A(C14～C16)、Fengycin A(C14～C15)、Fengycin A(C16～C17)和Surfactin(C13～C16)；NAIR等[14]發(fā)現(xiàn)海洋綠藻內(nèi)生菌Bacillussp.可分泌兩大類環(huán)狀脂肽Surfactin和Fengycin；JEONG等[18]發(fā)現(xiàn)B.siamensis可以產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，其基因序列顯示至少存在4個(gè)與抗菌物質(zhì)相關(guān)的基因簇，如Iturin、Fengycin、Bacillaene和Difficidin。菌種鑒定的結(jié)果表明，菌株BS6-2可能是一種潛在的生物活性物質(zhì)產(chǎn)生菌。

圖2 菌株BS6-2的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain BS6-2 based on the 16S rDNA sequence

2.3 Surfactin提取物的定性分析

圖3為菌株BS6-2所產(chǎn)Surfactin的紅外圖譜，由圖3可知，3 299.74 cm-1處的寬展吸收峰是由OH和NH基團(tuán)伸縮振動(dòng)引起的[19]。2 960～2 860 cm-1和1 455～1 380 cm-12處窄尖吸收是脂肪酸鏈的C—H伸縮振動(dòng)[20]。1 653.47 cm-1和1 547.74 cm-12處窄尖強(qiáng)吸收為酰胺鍵，說明樣品中含有肽鏈[15]。綜上說明該樣品為脂肽類物質(zhì)。

圖3 菌株BS6-2所產(chǎn)脂肽物質(zhì)的傅里葉變換紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of crude lipopeptide from strain BS6-2

對(duì)提取的脂肽樣品經(jīng) CH3OH 萃取后采用乙腈和三氟乙酸的水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行高效液相色譜分析，與Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖4所示。由圖4-a可知，Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品在保留時(shí)間4.00～6.00 min出現(xiàn)4個(gè)特征峰。不同色譜條件Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間會(huì)出現(xiàn)差異。LEE等[9]以0.1%的甲酸和含0.1%甲酸的乙腈進(jìn)行梯度洗脫，Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間集中在12.00～12.73 min。由圖4-b可知，樣品在保留時(shí)間4.00～6.00 min出現(xiàn)3個(gè)特征峰，且3個(gè)峰均位于標(biāo)準(zhǔn)峰附近，因此可以推測(cè)樣品為Surfactin的同系物。

a-Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品；b-Surfactin提取物圖4 樣品的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC fingerprints of samples

Surfactin的典型結(jié)構(gòu)為不同長(zhǎng)度的β-羥基脂肪酸鏈(一般為C12～C15)和L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D- Leu6-L- Leu7，通過內(nèi)置鍵鏈接而成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[21]。另外，Surfactin的同系物還包括一些氨基酸殘基的取代物，比如(Val7)Surfactin、(Ile7)Surfactin、(Ala4)Surfactin和(Asp1，Glu5)Surfactin[22]，這些氨基酸殘基的取代會(huì)極大地影響Surfactin的生物活性[23]。研究報(bào)道B.coagulans可以產(chǎn)生2種Surfactin同系物，第7位氨基酸分別為L(zhǎng)eu和Val[23]；BAUMGART等[24]也鑒定出兩種Surfactin同系物，第7位氨基酸上的Leu分別被Val和Ile取代。圖5為Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品(a)和Surfactin提取物(b)的[M+H]+質(zhì)譜圖，由圖5可知，2個(gè)樣品均出現(xiàn)了1 008、1 022、1 036m/z3個(gè) [M+H]+離子峰，之間相隔分子量為14，即CH2—，分子量與Surfactin同系物一致，可判斷分別代表C13～C15Surfactin同系物。根據(jù)分子量可初步推斷菌株BS6-2產(chǎn)Surfactin的3種同系物為β-OH-C13-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu(Ile)，第7位氨基酸殘基具體是哪一個(gè)還有待進(jìn)一步分析。

a-Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品; b-Surfactin提取物圖5 樣品的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of samples

2.4 Surfactin提取物的乳化特性分析

微生物表面活性劑是由疏水性和親水性兩個(gè)部分組成的兩親性代謝物，可以在不同極性的液相之間的界面上進(jìn)行分配。脂肽是一種很典型低分子量微生物表面活性劑，可以有效地降低表面張力和界面張力。有大量的研究表明表面活性與乳化活性之間有直接正相關(guān)性[16]，因此E24經(jīng)常被用來作為一種有效的篩選方法。圖6為菌株BS6-2所產(chǎn)將Surfactin提取物的乳化指數(shù)E24(以吐溫-80作對(duì)照)。結(jié)果表明，Surfactin提取物和吐溫-80的乳化指數(shù)E24均隨著溶液濃度增大而升高，且兩者乳化指數(shù)E24差別不大。當(dāng)Surfactin提取物溶液濃度高于500 mg/L時(shí)，E24達(dá)到55%以上，略低于芽孢桿菌ZG0427所產(chǎn)表面活性劑的E24，當(dāng)其質(zhì)量濃度為500 mg/L時(shí)，E24可達(dá)到61.5%[25]，一般認(rèn)為若E24>50%就表明具有很強(qiáng)的乳化能力[26]。圖7為不同質(zhì)量濃度的Surfactin提取物溶液的乳化穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化規(guī)律。由圖7可知，不同質(zhì)量濃度的Surfactin提取物質(zhì)量溶液在放置的過程中其乳化穩(wěn)定性均有所下降，特別是在前24 h，穩(wěn)定性下降幅度比較大，后趨于平穩(wěn)；Surfactin提取物濃度越高，乳化穩(wěn)定性越強(qiáng)，當(dāng)濃度>500 mg/L時(shí)，放置96 h后，乳化穩(wěn)定性下降25%左右，穩(wěn)定性較好。由此可見，Surfactin提取物溶液具有較好的乳化活性。

圖6 不同質(zhì)量濃度Surfactin提取物溶液的乳化指數(shù)Fig.6 Emulsification index of Surfactin extract at different concentrations

圖7 不同質(zhì)量濃度Surfactin提取物的乳化穩(wěn)定性Fig.7 Emulsification stability of Surfactin extract at different concentrations

3 結(jié)論

本研究通過溶血性、排油圈、抑菌試驗(yàn)及其編碼基因檢測(cè)，篩選出1株產(chǎn)Surfactin的菌株BS6-2。經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，將菌株BS6-2鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis。利用傅里葉變換紅外光譜、高效液相色譜和UPLC-ESI/Q-TOF MS分析，推測(cè)菌株BS6-2所產(chǎn)Surfactin為3種同系物，其可能結(jié)構(gòu)為β-OH-C13-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu(Ile)。Surfactin提取物表現(xiàn)出良好的乳化性能和抑黑曲霉活性，但其有效組分仍需進(jìn)一步分離純化。