宋俊華， 許 梅

(1.上海沈化院科技有限公司，上海 201210； 2.利民化學(xué)有限責(zé)任公司，江蘇 新沂 221400)

由利民化學(xué)有限責(zé)任公司(以下簡稱“利民化學(xué)”)自主研發(fā)的代森錳鋅液相色譜分析方法，在2019年德國布倫瑞克召開的第63屆國際農(nóng)藥分析協(xié)作委員會(CIPAC)年會上順利通過答辯，成功晉升為CIPAC方法。該方法自2016年提出申請，其間歷經(jīng)多次答辯，有效解決了多個技術(shù)難題，方法才得以完善。本文兩位作者分別作為方法答辯人和開發(fā)者，親身經(jīng)歷，感受良多，為此認真進行總結(jié)梳理，以為我國農(nóng)藥標準方法走向國際提供借鑒。

1 CIPAC方法申請背景

原代森錳鋅FAO標準于老程序下建立(1980頒布)，俗稱“老標準”。FAO現(xiàn)有類似“老標準”近200多個，但因其不能作為相同產(chǎn)品認定的首家，發(fā)揮不了國際標準應(yīng)有的作用，為此2016年FAO制定了“老變新計劃”及“更新優(yōu)先列表”，代森錳鋅被列入到第一批更新名單中。作為全球第二大代森錳鋅生產(chǎn)和出口企業(yè)，利民化學(xué)在第一時間內(nèi)提交了該產(chǎn)品標準的更新申請，但首先遇到的難題就是有效成分分析方法問題，老標準使用的代森錳鋅分析方法(CIPAC 34/TC/M/- )為化學(xué)法，存在操作復(fù)雜，重復(fù)性差，在常規(guī)實驗室不易開展，且還需使用高毒試劑等諸多缺陷。而CIPAC方法是申請FAO產(chǎn)品標準的第一步，申請標準首先需攻克CIPAC方法這一難題。

2 成功晉升CIPAC方法的艱難歷程

常規(guī)分析方法要上升為CIPAC方法，需在全球近20家實驗室進行方法的小范圍及大范圍驗證(實驗室間驗證)，且驗證結(jié)果需按照CIPAC要求的方法進行統(tǒng)計，并在CIPAC大會上匯報，在現(xiàn)場經(jīng)受來自全球30多個國家質(zhì)量管理實驗室及行業(yè)實驗室專家挑剔的目光考驗，再由20多位國際專家組成的評審團評審?fù)ㄟ^后才能成為CIPAC方法，適用于全球農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)管。

代森錳鋅儀器分析方法的難點在于其“難溶解、易分解”的特性。新方法采用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)絡(luò)合法，在堿性條件下將代森錳鋅溶解，采用液相色譜外標法定量，與原老化學(xué)分析法相比，該方法具有準確、簡便、環(huán)保等諸多優(yōu)點。

按照CIPAC程序要求，該方法首先于2016年在國內(nèi)4家實驗室完成了小范圍驗證試驗，統(tǒng)計結(jié)果顯示各項指標滿意，并于同年在日本東京舉辦的第60屆CIPAC會議上進行了匯報。隨后CIPAC同意該方法進行下一步大范圍驗證試驗，并在其網(wǎng)站上公布了大范圍驗證試驗通知，先后有全球20多家實驗室自愿報名參加。由于樣品國際長途運輸時間長、環(huán)境不可控、部分實驗室對代森錳鋅性質(zhì)不熟悉等多種原因，在首次大范圍驗證試驗中，國外多家實驗室反映樣品不易溶解或溶解后不穩(wěn)定分解嚴重，導(dǎo)致在2017年第61屆CIPAC會議上進行的首次大范圍驗證結(jié)果答辯未能獲得通過。CIPAC要求對方法進行改進，并補充提交改進后方法的方法確認報告及溶液穩(wěn)定性報告等。

為解決上述問題，針對代森錳鋅產(chǎn)品本身的特性，利民化學(xué)改進了分析方法，通過增加環(huán)境溫度控制(17℃)、降低柱溫(15℃)，以及使用短柱減少分析時間等多種方式來保證溶液穩(wěn)定性。改進后的方法按照CIPAC要求完成了方法確認報告，結(jié)果顯示方法線性、準確度、精密度、回收率及溶液穩(wěn)定性等各項指標合格，并于2017年通過CIPAC平臺重新組織進行了大范圍驗證試驗。

但在2018年召開的第62屆CIPAC會議答辯時，該方法再次遇到了挑戰(zhàn)，因代森錳鋅化合物本身的特殊性及首次答辯時殘余的對方法的不信任感，會議代表們對方法提出了諸多質(zhì)疑，如：因方法為衍生化法，實際的分析物是什么？分析原理是什么？保留時間和紅外光譜是否足以對分析物進行準確定性？既然驗證試驗所用標準物質(zhì)來自利民化學(xué)，那么其含量是否準確，國際市場上是否有含量可靠的標準物質(zhì)供應(yīng)？17℃的環(huán)境溫度對于大多數(shù)試驗室來說，條件是否過于苛刻？最終因存疑問題過多，該方法被CIPAC評審委員會再次否決。

為解決上述問題，在查閱大量文獻后，經(jīng)交叉核實，確認了方法的分析原理。

即實際分析物為乙烯雙二硫代氨基甲酸(EBDC)離子。對于方法定性不充分的問題，經(jīng)與CIPAC協(xié)商確定，定性方法除了保留時間和紅外光譜，再加上CIPAC MT 165 紫外吸收測試法，以準確區(qū)分代森錳鋅和代森錳。針對17℃環(huán)境溫度控制不夠現(xiàn)實的質(zhì)疑，通過多次嘗試將環(huán)境溫度調(diào)整到20℃，并重新在此條件行進行了溶液穩(wěn)定性試驗，直到試驗結(jié)果顯示穩(wěn)定性數(shù)據(jù)合格為止。對液譜分析而言，定量準確來源可靠的標準物質(zhì)是基石，但從Dr. Ehrenstorfer GmbH購得的代森錳鋅標準物質(zhì)含量只有70%多(代森錳鋅含量越高越不穩(wěn)定)，為了打消評委們的疑慮，利民化工將此標準品再次同時用化學(xué)法和液譜法進行了定量，以確認含量的準確性，結(jié)果顯示Dr．Ehrenstorfer GmbH 70%的標準品含量可靠，可用于常規(guī)定量分析。

改進后的方法又一次在國內(nèi)6家實驗室和國外2家實驗室進行了驗證試驗，并在2019年第63屆CIPAC會議上再次答辯，在強大的證據(jù)支持下，該方法最終獲得專家認可，經(jīng)過2016-2019的4年艱辛歷程，利民化學(xué)的代森錳鋅液相色譜法成功晉升為CIPAC方法。

3 方法提要

在小于20℃環(huán)境溫度下，試樣用緩沖液B溶解，以甲醇和緩沖液A為流動相，使用以Agilent Extent C18為填料的液相色譜柱(色譜柱pH值耐受范圍為2.0～11.5)和紫外檢測器，在282nm處，對試樣中的代森錳鋅進行高效液相色譜分離，外標法定量。

典型色譜操作條件：流動相： (甲醇+緩沖溶液A)=30+70(V/V) ， 經(jīng)濾膜過濾；柱溫：15℃；檢測器波長：282nm；流速：1.0mL/min；進樣體積：5.0 μL；保留時間：約7.8min。

緩沖溶液A制備：稱取乙二胺四乙酸(EDTA)3.72g、磷酸氫二鈉1.42g、四丁基硫酸氫銨3.39g溶于1 000mL的水中，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至10.0。超聲混勻后用0.22μm膜過濾，備用。

緩沖溶液B制備：稱取EDTA 7.44g、磷酸氫二鈉1.42g、四丁基硫酸氫銨3.39g、亞硫酸鈉3g溶于1 000mL的水中，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至11.0。超聲混勻后靜置30min，備用。

4 成功申請CIPAC方法的意義及啟示

4.1 為下一步成功申請FAO標準打好前站 CIPAC方法是申請FAO標準的第一步，《FAO/WHO農(nóng)藥標準制定和使用手冊》第2.9部分明確提到：FAO和WHO標準中使用的農(nóng)藥原藥和制劑有效成分的檢測方法，都要經(jīng)過CIPAC和AOAC協(xié)同驗證與認可，其中90%以上來自于CIPAC認可的方法。成功晉升CIPAC方法為下一步申請代森錳鋅FAO標準打好了前站。

4.2 為利民化學(xué)代森錳鋅走向世界奠定了基礎(chǔ) FAO標準是全球認可的鑒別同一藥劑不同產(chǎn)品質(zhì)量好壞的通用標準，可為產(chǎn)品質(zhì)量背書，獲得國際機構(gòu)和專家對其免費的宣傳，更加便捷的競標聯(lián)合國和有關(guān)政府、公益組織的采購項目，是產(chǎn)品走向國際市場的通行證和敲門磚。代森錳鋅CIPAC方法和FAO標準必將成為利民化學(xué)開拓國際代森錳鋅市場可用的兩張響當(dāng)當(dāng)?shù)拿?/p>

4.3 解決了全球代森錳鋅產(chǎn)品因分析方法導(dǎo)致的質(zhì)控難問題 代森錳鋅老方法存在操作復(fù)雜，重復(fù)性差，在常規(guī)實驗室不易開展，且還需使用高毒試劑等諸多缺陷。新方法雖歷經(jīng)多次答辯，但CIPAC一直沒有放棄，繼續(xù)給與利民化學(xué)不斷完善的機會，就是因為他們也需要一個更加方便快捷的代森錳鋅CIPAC方法供全球代森錳鋅產(chǎn)品質(zhì)量控制之用，從另一個角度看，利民化學(xué)幫助CIPAC解決了這個難題。

4.4 對開展CIPAC全球驗證試驗的體會 從利民化學(xué)申請代森錳鋅CIPAC方法的歷程來看，除了方法開發(fā)本身，方法的申請者還需要重點關(guān)注

以下環(huán)節(jié)：CIPAC全球驗證試驗需要在CIPAC官網(wǎng)上發(fā)出通知，并明確參加實驗室數(shù)量要求，實驗室數(shù)量的確定既要考慮實驗成本也需兼顧統(tǒng)計結(jié)果的可靠性；寄送試驗樣品及標樣前需了解目的地國家試驗樣品管理政策，以避免寄送時間過長導(dǎo)致樣品分解等，必要時可向CIPAC求助出具“試驗樣品證明”；試驗報告模板要求應(yīng)明確，以有利于試驗完成后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并要求實驗室提供部分原始數(shù)據(jù)以備試驗結(jié)果出現(xiàn)問題后有據(jù)可查；試驗過程中保持與實驗室的溝通，跟蹤試驗進程，對實驗室提出的問題進行及時答復(fù)；試驗結(jié)果統(tǒng)計過程中對出現(xiàn)的離群值或歧離值不能隨意剔除，需提供確鑿的證據(jù)支持。