吳 冕，李婷婷，汪夢圓，方文秀，黎文軍，王 琮，俞 浩

(安徽科技學院 生命與健康科學學院，安徽 鳳陽 233100)

相對單體化學成分來說,中藥組分活性研究更能體現(xiàn)中藥的作用特點,因此,中藥組分及組分配伍活性研究越來越受到研究者的重視[1]。滁菊Dendranthema morifolium Ramat.為栽培藥材,產(chǎn)地僅限于安徽滁州地區(qū),為“十大皖藥”之一,臨床主要用于治療肝陽上亢證[2]。清光緒年間《滁州志》既有甘菊產(chǎn)大柳者藥用價值高,且功效優(yōu)于杭菊的記載,大柳即現(xiàn)在的安徽省滁州市南譙區(qū)大柳鎮(zhèn)。葉桔泉所著的《現(xiàn)代實用中藥》再次肯定了滁菊的藥用價值,認為滁菊在藥用菊花中品質(zhì)最優(yōu),藥效最好。滁菊富含多種活性成分,如黃酮、多糖、揮發(fā)油、微量元素等[3]。其中滁菊總黃酮(Total flavonoids of Chuzhou chrysanthemum,TFCC)能夠顯著改善缺血性心腦血管疾病,機制是抗脂質(zhì)過氧化損傷[4-7]。同時,TFCC對炎癥、疼痛和血液流變學均有顯著的生理活性[8-10]。滁菊多糖(Polysaccharides of Chuzhou chrysanthemum,PCC)能夠抗疲勞、抗氧化和增強耐缺氧能力[11-12]。本研究從滁菊中提取TFCC和PCC,觀察TFCC和PCC配伍的體內(nèi)外抗氧化活性,以期為滁菊及其活性組分的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 SPF級昆明種小鼠,雄性,18月齡,購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場,實驗動物許可證號:SCXK(蘇)2017-0001。飼養(yǎng)與實驗期間動物自由攝食飲水。

1.1.2 藥材與試劑 滁菊,采自安徽科技學院中藥科技園,經(jīng)安徽科技學院俞浩教授鑒定為正品滁菊;DPPH(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號:1929061);ABTS(美國Sigma公司);維生素C(Vc，北京化學試劑有限公司);超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽還原酶(GSH-Px),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號分別為20180920、20180913、20180920)。

1.1.3 儀器設(shè)備 中藥粉碎機(吉首市中州制藥器械廠);HH-4型恒溫水浴鍋(鄭州群英予華儀器有限公司);UV-5600PC紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);TDL-5型離心機(上海安亭科學儀器廠);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發(fā)機械制造有限公司);TG16-WS型臺式高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 滁菊加工處理 滁菊采摘后，置50 ℃烘箱48 h烘干，粉碎成粗粉，置陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 TFCC提取純化及含量測定 經(jīng)70%乙醇提取,D-101大孔樹脂純化,得純化后的TFCC溶液[13-14],置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收乙醇,將剩余液體于冷凍干燥機中冷凍干燥,得TFCC粉末。以蘆丁為標準對照,繪制標準曲線。稱取TFCC 2.032 mg,置10 mL容量瓶中70%乙醇溶解并定容,測定吸光度,繪制計算TFCC含量。

1.2.3 PCC提取純化及含量測定 參照文獻方法[15]采用水提醇沉法提取PCC,sevage試劑去蛋白,取離心后上清液,加入氯仿萃取,直至無渾濁,得沉淀,然后用80%乙醇、丙酮、石油醚各洗滌3次,得PCC。以葡萄糖為標準對照,測定并計算PCC含量。

1.2.4 TFCC和PCC配伍比例 精密稱定TFCC和PCC,1%二甲基亞砜溶解后配制成不同比例配伍的待測樣品溶液(表1)。

表1 TFCC和PCC配伍比例

1.2.5 TFCC和PCC配伍抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測定 參照文獻方法配制25 μg/mL DPPH溶液[16-17]。精密量取2 mL不同比例配伍的待測樣品溶液,按表2加入相應(yīng)反應(yīng)試劑,利用DPPH自由基單電子與抗氧化劑反應(yīng)后顏色變淺,測定吸光度(重復3次),計算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

表2 DPPH自由基清除率測定試劑加樣表

1.2.5.2 羥自由基清除率測定 精密量取2 mL不同比例配伍的待測樣品溶液,利用·OH與水楊酸作用產(chǎn)生顏色反應(yīng),抗氧化劑能清除·OH,使顏色變淺的原理,測定吸光度(A1)[16-17]。以蒸餾水替代待測樣品溶液的吸光度(A0),以蒸餾水代替水楊酸的吸光度(A2)。各檢測樣品分別重復測定3次。計算羥自由基清除率,羥自由基清除率(%)=100×[A0-(A1-A2)]/A0。

1.2.5.3 ABTS+·自由基清除率測定 精密量取不同比例配伍的待測樣品溶液,利用抗氧化劑與ABTS+·溶液作用后顏色變淺的原理,測定吸光度(A1)[18]。各檢測樣品分別重復測定3次。計算ABTS自由基清除率,ABTS自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

1.2.5.4 Fe3+相對還原力測定 精密量取不同比例配伍的待測樣品溶液,利用抗氧化劑能將K3[Fe(CN)6]還原成K4Fe(CN)6,并進一步與FeCl3反應(yīng)生成Fe4[Fe(CN)6]3的原理,測定吸光度(A1)[19]。采用Vc(0.1 mg/mL)作陽性對照,測定吸光度(A)。測定空白管吸光度(A0)。各檢測樣品分別重復測定3次。計算Fe3+相對還原力,Fe3+相對還原力(%)=[(A1-A0)/(A-A0)]×100。

1.2.6 TFCC和PCC配伍對老年小鼠的抗氧化作用

1.2.6.1 動物分組及給藥 取小鼠50只,隨機分為TFCC+PCC組(40 mg/kg+60 mg/kg)、TFCC組(40 mg/kg)、PCC組(60 mg/kg)、維生素E組(200 mg/kg)和正常對照組,每組10只。采用灌胃方式給藥,連續(xù)14 d,1次/d。

1.2.6.2 血清及肝臟SOD、GSH-Px、MDA水平測定 末次給藥2 h后,采集血液和肝臟,制備血清和肝勻漿液,按試劑盒說明書測定各指標含量[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFCC測定結(jié)果

精密稱定蘆丁標準品,70%乙醇溶解并定容,配制成0.02 mg/mL的蘆丁標準品溶液。蘆丁標準曲線方程為:Y=9.65X-0.028,R2=0.997 8,在0.02～0.1 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。TFCC含量為722.41 mg/g。

2.2 PCC測定結(jié)果

葡萄糖標準曲線方程為:Y=9.91X+0.126 3,R2=0.999 9,在0.01～0.09 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。PCC含量為626.32 mg/g。

2.3 TFCC和PCC配伍對DPPH自由基清除率的影響

由圖1可知,TFCC和PCC不同比例配伍均有清除DPPH自由基作用,不同比例配伍間清除率存在差異,其中2∶3配伍自由基清除率最高,為92.13%;1∶1配伍自由基清除率最低,為64.24%。

圖1 TFCC和PCC配伍對DPPH自由基清除率的影響

2.4 TFCC和PCC配伍對羥自由基清除率的影響

由圖2可知,TFCC和PCC不同比例配伍均有羥自由基清除作用,不同比例配伍間清除率存在差異,其中2∶3配伍自由基清除率最高,為86.76%;1∶1配伍自由基清除率最低,為59.31%。

圖2 TFCC和PCC配伍對對羥自由基清除率的影響

2.5 TFCC和PCC配伍對ABTS+·自由基清除率的影響

由圖3可知,TFCC和PCC不同比例配伍均有ABTS+·自由基清除作用,不同比例配伍間清除率存在差異,其中2∶3配伍自由基清除率最高,為88.23%;1∶1配伍自由基清除率最低,為60.65%。

圖3 TFCC和PCC配伍對ABTS+·自由基清除率的影響Fig.3 Effect of TFCC and PCC on ABTS+·scavenging rate

2.6 TFCC和PCC配伍對Fe3+還原能力的影響

由圖4可知,TFCC和PCC不同比例配伍均具有Fe3+還原作用,不同比例配伍間還原能力存在差異,其中2∶3配伍對Fe3+還原能力最強,與0.1 mg/mL Vc比較,相對還原力為102.73%;1∶1配伍對Fe3+還原能力最弱,與0.1 mg/mL Vc比較,相對還原力為69.82%。

圖4 TFCC和PCC配伍對Fe3+還原能力的影響Fig.4 Effect of TFCC and PCC on Fe3+ reduction ability

2.7 TFCC和PCC配伍對老年小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

TFCC+PCC組、TFCC組、PCC組小鼠血清SOD、GSH-Px活性均顯著高于正常對照組(P<0.05或P<0.01),且TFCC+PCC升高小鼠血清SOD、GSH-Px活性作用顯著強于單獨給予TFCC或PCC(P<0.01)。TFCC+PCC組、TFCC組、PCC組小鼠血清MDA含量均顯著低于正常對照組(P<0.05或P<0.01),且TFCC+PCC降低小鼠血清MDA含量作用顯著強于單獨給予TFCC或PCC(P<0.05或P<0.01)。維生素E與TFCC+PCC比較作用相當,無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 TFCC和PCC配伍對老年小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

2.8 TFCC和PCC配伍對老年小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

TFCC+PCC組、TFCC組、PCC組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性均顯著高與正常對照組(P<0.05或P<0.01),且TFCC+PCC升高小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性作用顯著強于單獨給予TFCC或PCC(P<0.05或P<0.01)。TFCC+PCC組、TFCC組、PCC組小鼠肝臟MDA含量均顯著低于正常對照組,且TFCC+PCC降低小鼠肝臟MDA含量作用顯著強于單獨給予TFCC或PCC(P<0.05或P<0.01)。維生素E與TFCC+PCC比較作用相當,比較無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 TFCC和PCC配伍對老年小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

滁菊臨床應(yīng)用歷史悠久,滁菊產(chǎn)業(yè)現(xiàn)已發(fā)展成為地方主要支柱產(chǎn)業(yè),2018年滁菊獲批“十大皖藥”,助推了滁菊產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。動物實驗研究證實,滁菊活性組分對心血管系統(tǒng)具有顯著藥理作用,TFCC、PCC均顯示了較好的抗氧化活性。隨著中藥藥理研究的不斷深入,從中藥中提取活性組分,并進行定量分析,開展組分配伍的作用和作用機制評價,相對中藥單體化學成分藥理活性研究來說,更能體現(xiàn)中藥整體觀的特點[21]。本研究從滁菊中提取并純化總黃酮和多糖,觀察TFCC和PCC配伍的體內(nèi)外抗氧化作用,對闡明中藥組分配伍的合理性和滁菊的進一步深入研究具有重要意義。

本研究采用自由基清除法和Fe3+還原法觀察TFCC和PCC的體外抗氧化作用[22-23]。結(jié)果表明,TFCC和PCC不同比例配伍均有清除DPPH自由基、羥自由基、ABTS+·自由基作用和Fe3+有還原作用,其中2∶3配伍抗氧化活性最強,1∶1配伍抗氧化活性最低。以Fe3+還原力為評價指標,TFCC和PCC 2∶3配伍對Fe3+還原力強于0.1 mg/mL Vc,相對還原力為102.73%。

在體外實驗的基礎(chǔ)上,以老年小鼠為研究對象,觀察TFCC和PCC 2∶3配伍的體內(nèi)抗氧化活性。TFCC體內(nèi)試驗劑量設(shè)置參照本課題組前期研究結(jié)果[3-4,10],設(shè)置TFCC劑量40 mg/kg,PCC劑量為60 mg/kg。SOD和GSH-Px是抗氧化酶,MDA是過氧化產(chǎn)物,血清和組織中抗氧化酶活性高低和過氧化產(chǎn)物含量多少能夠客觀反映藥物的抗氧化活性[24-26]。研究結(jié)果表明,TPCC和PCC 2∶3配伍能夠顯著增加小鼠血清和肝臟SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量,且活性顯著強于單用TFCC或PCC,二者配伍在抗氧化活性方面產(chǎn)生了很好的協(xié)同作用,其機制有待進一步深入研究。