鄭文寅，陳心婷，劉家欣，錢偉豪，姜 淼，廖 涵，張 持

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，安徽 合肥 230036)

單寧又稱單寧酸，鞣酸，是具有澀味的復(fù)雜的多元酚類化合物，在很多蔬果谷物中都存在[1]。單寧具有多重作用，如抗氧化、沉淀蛋白質(zhì)、植物防御和營養(yǎng)健康等，而受到營養(yǎng)學(xué)家、生理學(xué)家、育種學(xué)家的關(guān)注[2]。在高粱、油菜等種子中，單寧含量較高，不僅可以影響種子的透性，還具有殺菌作用，單寧含量高的種子不僅能夠抗穗發(fā)芽，還能減少種子的發(fā)霉[3]?？梢姡瑔螌幒头N子的生理及品質(zhì)有著密切的關(guān)系。

植物單寧的測定方法有很多[4-5]，如蛋白質(zhì)沉淀法、高效液相色譜法、Folin酚還原法、正丁醇鹽酸法和香草醛法等[6-8]。Folin酚還原法適合測定植物的總酚含量，但其他一些容易被氧化的物質(zhì)如抗壞血酸或非單寧酚的存在會使測定結(jié)果偏高。正丁醇鹽酸法和香草醛法都適用于縮合單寧的測定，尤其香草醛法可以測定縮合單寧的前體如兒茶素等黃烷醇類物質(zhì)[9]，同時不與黃酮反應(yīng)，尤其適合測定含有黃酮類物質(zhì)的樣品。

影響植物單寧測定的因素有很多。對于丙酮濃度的影響，李學(xué)強(qiáng)等[10]認(rèn)為提取歐李肉中單寧的最佳提取條件中丙酮的濃度為60%，而張立華等[11]研究超聲波輔助提取石榴葉中單寧時也認(rèn)為丙酮溶液對單寧的溶解能力最強(qiáng)，宜選用丙酮作為提取劑。不同的料液比也會影響單寧提取效果，料液比1∶10～1∶40(g/mL)范圍內(nèi)隨溶劑用量的加大，單寧提取率也隨之提高。提取時間的長短直接決定了樣品中的單寧能否被提取徹底，由侯萬偉等[12]對蠶豆種皮中單寧提取工藝優(yōu)化的研究，他們在冷浸材料3、5、7、9、11 h測定單寧含量，結(jié)果表明當(dāng)?shù)竭_(dá)7 h時，單寧提取量最大，9 h相對7 h稍有降低。范璐等[13]探討了高速離心與雙層中速濾紙過濾法的差異對高粱中單寧含量的影響，結(jié)果表明兩種方法的測定結(jié)果并無明顯差異，考慮到試驗效率，選用高速離心法分離提取液， 離心時間的長短影響到上清液中小麥粉的殘留，時間太短則殘留過多，顯色結(jié)果影響就較大。蒸餾過程中的一些因素也會影響單寧提取量，如蒸餾瓶中上清液能否蒸干，即蒸餾時間的長短等，可能會影響顯色結(jié)果。此外，顯色溫度的確定對于準(zhǔn)確測定單寧具有重要影響，劉琴等[9]人的研究認(rèn)為，當(dāng)反應(yīng)溫度為20 ℃或25 ℃時，吸光度接近，當(dāng)反應(yīng)溫度升高至30 ℃后，體系的吸光值呈明顯下降趨勢。

迄今為止，尚未見有效測定小麥籽粒單寧含量的相關(guān)報道。因此，本試驗主要研究小麥中的縮合單寧，選用香草醛法，在單因素預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗進(jìn)行小麥單寧含量測定方法的進(jìn)一步優(yōu)化，并用56份來源廣泛的小麥種質(zhì)資源進(jìn)行驗證這一方法的精確度，以期獲得一種經(jīng)濟(jì)高效的小麥籽粒單寧的測定方法，為研究其生理和品質(zhì)效應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

正交試驗和驗證試驗所用到的材料均來自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院種子科學(xué)試驗室收集小麥種質(zhì)資源。使用的主要試劑包括丙酮(分析純，西隴化工股份有限公司)；甲醇(分析純，上海振興化工一廠)；兒茶素(標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司)；香草醛(標(biāo)準(zhǔn)品，源葉生物)；冰醋酸(生物工程(上海)股份有限公司)；濃硫酸(分析純，西隴化工股份有限公司)。主要儀器設(shè)備包括AX324ZH電子分析天平；BECKMAN-Allegra離心機(jī)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸餾儀；JK-3200B超聲波清洗儀；TU-1810紫外可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 對各小麥品種去除空癟粒和雜質(zhì)，分別選取20 g左右的種子用高速萬能粉碎機(jī)約粉碎1 min，然后放塑封袋于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 參考劉琴等[9]的方法，準(zhǔn)確稱取0.002 5 g兒茶素，用甲醇溶劑將其配制成濃度為500 μg/mL的母液，并將其稀釋得40、80、120、160、200 μg/mL的梯度溶液備用；然后稱取1.000 0 g香草醛溶于100 mL冰醋酸配制成1%香草醛-冰醋酸溶液、量取35 mL濃硫酸與65 mL冰醋酸混合配置成35%濃硫酸-冰醋酸溶液，用前將兩份溶液混合即為工作液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。取各梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，設(shè)置0.2 mL甲醇為空白，然后分別加6 mL工作液搖勻靜置20 min，用甲醇處理組作參照，于510 nm處測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 正交試驗 綜合文獻(xiàn)及預(yù)試驗，選取小麥料液比、浸提時間、離心時間等7因素(各因素間無明顯交互作用)3水平進(jìn)行L18(37)正交試驗，試驗設(shè)計如表1。

表1 小麥籽粒單寧提取因素水平表

1.2.4 小麥籽粒單寧含量的測定 按表1將1.2.1中制備的樣品稱取一定量于50 mL離心管中，加入一定量的丙酮，室溫浸提一定時間，用離心機(jī)中離心(4 000 r/min)一定時間，取上清液于蒸餾瓶中，用真空旋轉(zhuǎn)蒸餾儀蒸干(45 ℃)。在蒸干的蒸餾瓶內(nèi)加入一定量的甲醇溶液，保鮮膜封口，在超聲波清洗機(jī)中清洗一定時間，吸取燒瓶中的溶液即為單寧提取液(待測液)。

分別吸取待測液和標(biāo)液各0.2 mL，并加入6 mL的工作液中，搖勻，在一定的溫度下顯色一定時間，測定其在510 nm處的吸光值，記錄數(shù)據(jù)。單寧含量計算公式為：

W=0.001cV/m

式中：W為單寧含量(mg/g)；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得單寧的濃度(μg/mL)；V為甲醇體積(mL)；m為稱取的小麥樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.5 重復(fù)性驗證試驗 選取了56份材料用確定好的試驗條件進(jìn)行單寧的提取，對比各品種間和重復(fù)間單寧含量的差異性，獲得RSD值，以驗證本試驗方法的精確度。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用excel對數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理，利用SPSS 6.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析2.1 正交試驗結(jié)果與方差分析

根據(jù)正交試驗結(jié)果，計算出每個因素同一水平下的試驗值之和Ki及每一因素同水平下的數(shù)據(jù)平均值ki，并根據(jù)Ki 和ki計算出同一因素不同水平間平均值的極差R。R值反映了影響因素對反應(yīng)體系的影響，R越大，影響越顯著，反之，影響越不顯著。由表2中極差結(jié)果可以看出，各因素對小麥籽粒中單寧含量測定結(jié)果的影響順序為C(離心時間)>F(清洗時間)>A(料液比)>E(甲醇體積)>G(顯色溫度)>D(蒸餾時間)> B(浸提時間),即離心時間的長短對單寧提取量影響最大，而浸提時間影響最小。從表2中可以看出小麥籽粒單寧提取的最佳條件為A1、B1、C1、D1、E3、F3、G2，即以料液比為1∶10，室溫浸提12 h，離心10 min，蒸餾8 min。2.5 mL甲醇溶解，超聲波清洗8 min，并在20 ℃下顯色測定單寧含量。

為了確定不同因素的顯著性影響，同時對正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，重復(fù)間差異不顯著，而A、C、E、F、G各因素水平對單寧含量有顯著影響，B、D兩因素各水平對試驗結(jié)果無顯著影響，即浸提時間與蒸餾時間對試驗結(jié)果無顯著影響，與表3的極差分析結(jié)果基本一致。

綜上分析，為省時高效，在后面的驗證時間中，選擇較短浸提時間6 h來測定小麥籽粒單寧的提取，即本試驗中優(yōu)化的方法為:料液比為1∶10，浸提時間為6 h，離心時間為10 min，蒸餾時間為8 min，甲醇體積為2.5 mL，清洗時間為8 min，顯色溫度為20 ℃。

表2 正交試驗設(shè)計L18(37)及結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

2.2 重復(fù)性驗證試驗

從表4可見，該測定方法的精確度為0.25%～5.00%，RSD均不小5%，達(dá)到了分析精度要求，因此這一優(yōu)化方法是有效的。

為了進(jìn)一步地給小麥籽粒中單寧含量遺傳分析提供理論基礎(chǔ)，對56份材料進(jìn)行了方差分析。由表5可知，品種間的F=19.078，P<0.01，表明用該方法提取不同品種小麥籽粒單寧含量具有極顯著差異，也說明不同小麥籽粒單寧含量間有極顯著差異，即該方法能有效測定和區(qū)分不同品種小麥籽粒的單寧含量。

表4 驗證試驗結(jié)果

表5 56份材料的方差分析

3 結(jié)論與討論

測定小麥籽粒單寧含量的方法，國內(nèi)暫無相關(guān)報道，國外相關(guān)研究也很少。不同植物間單寧含量測定方法存在差異，也間接說明了探究一種適合小麥單寧含量測定的方法的必要性。本試驗借鑒上述參考文獻(xiàn)中其他植物單寧的提取方法，確定了七因素三水平的正交試驗以進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果中，料液比1∶10與馮愛青等[14]等人以銀杏葉為試驗材料提取單寧的方法結(jié)果一致，但與張立華等[11]提取石榴葉中的單寧，顧海峰等[15]提取柿子中的單寧，任平等[16]提取石榴皮中的單寧，鐘雨坤等[17]提取桑葉中單寧，李學(xué)強(qiáng)等[10]提取歐李果肉中的單寧的結(jié)果不完全一致，可能是由于試驗材料及試驗方法的不同造成的，其他條件如浸提時間，浸提，顯色溫度的不同也與料液比的原因類似。顯色溫度對測定單寧的影響并不顯著，即在20、25和30 ℃這3個溫度下的顯色結(jié)果無顯著差異。此外，離心時間，清洗時間，甲醇體積等因素在其他植物單寧提取中并未涉及，而我們在單因素試驗過程中發(fā)現(xiàn)它們可能會影響測定結(jié)果的因素。正交試驗結(jié)果表明，以上3因素對試驗結(jié)果有極顯著影響，充分考慮這3個因素，可以提高該測定方法的有效性和準(zhǔn)確性。

本研究中，由56個不同基因型小麥品種的籽粒單寧含量的方差分析結(jié)果可知小麥品種間存在著極顯著差異，說明不同品種類型小麥籽粒里的單寧含量也有所不同，這表明小麥籽粒里的單寧含量受品種類型的影響。本研究可為小麥品種選育奠定基礎(chǔ)，通過采取不同的育種方法培育所需高低單寧含量的小麥品種，進(jìn)而為小麥種子單寧的生理和品質(zhì)效應(yīng)提供種質(zhì)資源材料。另一方面可通過雜交、回交等常規(guī)育種方法培育較高單寧含量的小麥品種，以內(nèi)源單寧替代外源添加劑的使用，同時有效提高小麥的烘培品質(zhì)。

綜上所述，本試驗通過正交試驗，確定了香草醛法測定小麥籽粒單寧含量的優(yōu)化方法為：料液比為1∶10，浸提時間為6 h，離心時間為10 min，蒸餾時間為8 min，甲醇體積為2.5 mL，清洗時間為8 min，顯色溫度為20 ℃。并用此方法測定了56份材料，精密度RSD均小于5%，且不同小麥品種間單寧含量具有極顯著差異，因此，該方法是一種經(jīng)濟(jì)、有效、準(zhǔn)確的方法，并且可以區(qū)分不同小麥品種間單寧含量的差異。