梁娟紅，李巧麗，賴(lài) 晶，張小花，張騰國(guó)

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

5’-三磷酸腺苷(adenosine-5’-triphosphate, ATP)作為一種高能化合物，是生物體內(nèi)進(jìn)行正常物質(zhì)代謝和能量代謝的直接能量來(lái)源。已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)中也存在ATP，即胞外ATP(extracellular ATP，eATP)，它可以作為一種重要的信使分子，通過(guò)特定的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制參與植物對(duì)生物、非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程[1]。Luattge等[2]研究發(fā)現(xiàn)施加ATP能夠促進(jìn)燕麥葉片維管束鞘細(xì)胞對(duì)K+的吸收。此外施加ATP還增強(qiáng)了核酸內(nèi)切酶的活性[3]。也有研究表明：增加細(xì)胞外ATP濃度會(huì)抑制擬南芥根的向重力性，跨膜ATP濃度會(huì)破壞生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸[4]，導(dǎo)致花粉不萌發(fā)以及抑制花粉管生長(zhǎng)[5]。另外，外源ATP還參與次生代謝物的積累[6]、細(xì)胞凋亡[7]、脅迫抗性[8]等生理過(guò)程。但關(guān)于外源ATP對(duì)種子萌發(fā)及抗鹽性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

植物液泡為儲(chǔ)存Na+提供了一個(gè)比較大的空間，液泡膜中的鈉-氫交換蛋白(NHX)可以將細(xì)胞質(zhì)中的Na+螯合到液泡中，降低細(xì)胞質(zhì)中Na+濃度，減少過(guò)量Na+對(duì)植物的毒害[12]。第一個(gè)NHX轉(zhuǎn)運(yùn)體基因是在擬南芥中克隆并命名為AtNHX1[13]。研究發(fā)現(xiàn)，NHX也會(huì)影響植物體內(nèi)K+的區(qū)室化。過(guò)表達(dá)AtNHX1基因的番茄在鹽脅迫條件下促進(jìn)了K+從地下向地上運(yùn)輸，液泡中K+濃度上升，細(xì)胞間Na+/K+降低，從而有效降低鹽脅迫對(duì)過(guò)表達(dá)番茄的鹽害作用[14]。Zhao等[15]在兩種耐鹽性不同的楊樹(shù)中研究發(fā)現(xiàn)，外源ATP的施用顯著降低了兩種楊樹(shù)中鹽誘導(dǎo)的K+外流，觸發(fā)鹽敏感植株中的SOS(鹽超敏感信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并有助于鹽度下Na+穩(wěn)態(tài)的控制。除此之外，在植物響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中SOS信號(hào)途徑也發(fā)揮著重要的作用，其中SOS1是參與Na+從細(xì)胞質(zhì)向質(zhì)外體轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵基因[16]，在細(xì)胞膜上編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在種子萌發(fā)過(guò)程中起重要作用，處于鹽脅迫條件下也能幫助植物更好地生長(zhǎng)發(fā)育[17]。Jeter等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，ATP的外源處理可以激活MAP激酶途徑以及參與乙烯生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)錄物水平。同時(shí)，MAP激酶級(jí)聯(lián)途徑也參與抗鹽調(diào)控過(guò)程。有研究表明，MEKK1-MKK2-MPK4/MPK6級(jí)聯(lián)途徑可以參與鹽脅迫下擬南芥的信號(hào)響應(yīng)過(guò)程[19]，而MKK9-MPK3/MPK6級(jí)聯(lián)途徑參與調(diào)節(jié)乙烯的合成并在擬南芥對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮作用[20]。

隨著冬油菜北移技術(shù)的成功示范，白菜型冬油菜(Brassicacampestris)已成為北方寒旱區(qū)主要的油料作物和生態(tài)作物[21]。但北方土壤廣泛存在不同程度的鹽漬化，嚴(yán)重影響了冬油菜的生長(zhǎng)發(fā)育和高產(chǎn)潛力的發(fā)揮[22]。因此，本文以白菜型冬油菜‘隴油8號(hào)’為材料，研究外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜種子萌發(fā)、幼苗生理及相關(guān)基因表達(dá)(MAPK3和MAPK6、SOS1和NHX1)的影響，為提高油菜抗鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料處理及培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿(mǎn)、大小均一的‘隴油8號(hào)’種子(由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供)用自來(lái)水反復(fù)沖洗，室溫下浸泡2 h，再進(jìn)行以下處理。(1)不同濃度的外源ATP溶液浸種處理：將種子分別置于濃度為0、1、10、25、50、100 μmol·L-1的外源ATP溶液中，于(25±1)℃培養(yǎng)箱黑暗浸種12 h;浸種后的種子用0.5%的次氯酸鈉消毒5 min，無(wú)菌水沖洗5～6次后接種到1/2 MS固體培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置30粒種子，置于(25±1)℃、光照強(qiáng)度為250 μmol·(m2·s)-1、光照周期16 h/8 h(光照/黑暗)的培養(yǎng)箱(RDN型人工氣候箱)中培養(yǎng)。每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。(2)CK：將油菜種子置于1/2 MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件與(1)處理相同。(3) NaCl單獨(dú)處理：將油菜種子置于含200 mmol·L-1NaCl的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件與(1)處理相同。(4)ATP+NaCl復(fù)合處理：用25 μmol·L-1外源ATP溶液，按照(1)處理的方法浸種。用上述方法接種于含200 mmol·L-1NaCl的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件與(1)處理相同。

1.2 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

培養(yǎng)3 d后觀察種子萌發(fā)情況，以胚根凸出種皮長(zhǎng)度大于等于種子長(zhǎng)度作為發(fā)芽標(biāo)志，計(jì)算發(fā)芽勢(shì)。處理7 d后觀察種子發(fā)芽情況，再以上述方法觀察種子的萌發(fā)情況，計(jì)算發(fā)芽率。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

取培養(yǎng)7 d的油菜幼苗地上部分進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。幼苗根長(zhǎng)與株高測(cè)定參照田夢(mèng)雨[23]的方法；過(guò)氧化氫(H2O2)含量測(cè)定參照Yin等[24]的方法；羥自由基(·OH)含量測(cè)定參照Halliwell[25]的方法；丙二醛(MDA)含量測(cè)定參照硫代巴比妥酸法[26]；相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定參照電導(dǎo)率儀法[27]；游離脯氨酸含量測(cè)定參照磺基水楊酸法[28]；可溶性糖含量測(cè)定參照蒽酮顯色法[29]。

1.4 活性膠電泳及染色

活性膠制備參照Lammli[30]的方法。采用5%的濃縮膠和12%的分離膠。CAT上樣量為6 μL，POD上樣量為9 μL。濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V，冰浴中穩(wěn)壓電泳約5～6 h。

CAT活性染色參照 Woodbury等[31]的方法；POD同工酶活性膠染色參照黃永芬等[32]的醋酸聯(lián)苯胺方法。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

油菜幼苗總RNA的提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒，參照試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作。以提取的總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以Actin-F、Actin-R為管家基因引物，MAPK3-F和MAPK3-R為MAPK3引物，MAPK6-F和MAPK6-R為MAPK6引物，SOS1-F和SOS1-R為SOS1引物，NHX1-F和NHX1-R為NHX1引物(表1)，按照熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(購(gòu)自TaKaRa公司)的操作步驟用25 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。采用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度外源ATP浸種對(duì)油菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

由表2可知，與CK相比較，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均隨外源ATP濃度增大呈先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)外源ATP濃度為25 μmol·L-1時(shí)，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率達(dá)到最大值，分別比CK提高26.9%和17.2%。結(jié)果表明，外源ATP濃度在一定范圍內(nèi)對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，而25 μmol·L-1的外源ATP處理效果最明顯。

表2 不同濃度外源ATP對(duì)油菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

2.2 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

如表3所示，與CK相比，200 mmol·L-1NaCl脅迫處理顯著抑制了油菜種子萌發(fā)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)分別下降了13.5%、4.7%；ATP+NaCl復(fù)合處理下的種子萌發(fā)情況顯著優(yōu)于NaCl單獨(dú)處理，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)分別提高了13.7%和15.0%。結(jié)果表明，NaCl脅迫處理顯著抑制了油菜種子萌發(fā)，而ATP浸種能顯著緩解NaCl脅迫對(duì)油菜種子萌發(fā)的抑制作用。

表3 外源ATP 浸種對(duì)NaCl脅迫處理下 油菜種子萌發(fā)的影響

2.3 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗生物量的影響

如表4所示，200 mmol·L-1NaCl脅迫處理下的油菜幼苗根長(zhǎng)、株高及鮮重均低于CK且鮮重顯著下降；ATP+NaCl復(fù)合處理下的油菜幼苗根長(zhǎng)、株高及鮮重相較于NaCl單獨(dú)處理分別升高了23.6%、27.3%、28.6%。結(jié)果表明，NaCl脅迫處理能抑制油菜幼苗生長(zhǎng)和生物量積累，外源ATP浸種能夠緩解NaCl脅迫處理對(duì)油菜幼苗的抑制作用。

表4 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下 油菜幼苗生物量的影響

2.4 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗生理特性的影響

2.4.1 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗H2O2和·OH含量的影響 如圖1顯示，與CK相比，外源ATP浸種、NaCl脅迫處理均顯著誘導(dǎo)油菜幼苗中H2O2(圖1A)和·OH(圖1B)的產(chǎn)生；ATP+NaCl復(fù)合處理與NaCl單獨(dú)脅迫處理相比，H2O2和·OH的含量分別降低了13.6%和6.3%。結(jié)果表明，NaCl脅迫處理顯著促進(jìn)了油菜幼苗中ROS的積累，而外源ATP浸種能夠降低NaCl脅迫處理下油菜中活性氧(ROS)含量，緩解鹽脅迫對(duì)油菜幼苗的損傷。

2.4.2 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗CAT和POD活性的影響 由圖2A可知，不同處理下CAT同工酶條帶數(shù)相同，有且僅有一條帶，在外源ATP浸種、NaCl單獨(dú)脅迫處理下，油菜幼苗CAT酶帶相對(duì)灰度比CK分別高3.0%和16.0%；ATP+NaCl處理下的CAT酶帶相對(duì)灰度比NaCl單獨(dú)脅迫處理高10.3%。如圖2B所示，4個(gè)處理下的POD有5條同工酶帶，但同一酶帶在不同處理下有差異。NaCl脅迫處理下油菜幼苗POD酶帶相對(duì)灰度比CK高89.0%；ATP+NaCl處理下POD同工酶條帶相對(duì)灰度比NaCl單獨(dú)處理高27.0%。結(jié)果表明，外源ATP浸種、NaCl脅迫處理都會(huì)提高CAT、POD酶活性水平；外源ATP浸種進(jìn)一步提高了NaCl脅迫下油菜幼苗中的CAT、POD酶活性，增強(qiáng)了油菜幼苗對(duì)體內(nèi)過(guò)量ROS的清除能力。

圖2 鹽脅迫處理下外源ATP浸種的油菜幼苗CAT(A)和POD(B)電泳圖及相對(duì)灰度分析Fig. 2 Electrophoresis and relative grayscale analysis of antioxidant enzymes in Brassica campestris seedling under NaCl stress by exogenous ATP seed soaking

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters in theFigure indicate significant differences among treatments (P<0.05). The same below.圖1 NaCl脅迫處理下外源ATP浸種的油菜幼苗中H2O2 (A)和·OH (B)含量Fig.1 H2O2 (A) and ·OH (B) accumulation of Brassica campestris seedling exposed under NaCl stress by exogenous ATP seed soaking

2.4.3 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗膜損傷程度的影響 逆境條件下，MDA和相對(duì)電導(dǎo)率能夠作為細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)。從圖3可以看出，與CK相比，NaCl脅迫顯著增加了油菜中的MDA含量(圖3A)和相對(duì)電導(dǎo)率(圖3B)，表明NaCl脅迫可以加劇油菜幼苗的膜脂過(guò)氧化程度。外源ATP浸種顯著降低了NaCl脅迫處理下的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率，MDA含量降低了27.6%，相對(duì)電導(dǎo)率降低了20.5%。結(jié)果表明，外源ATP浸種可以降低NaCl脅迫處理下油菜中的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率，減少膜脂過(guò)氧化程度和電解質(zhì)的滲漏，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，減輕鹽脅迫對(duì)油菜的損傷。

圖3 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗中丙二醛(A)和相對(duì)電導(dǎo)率(B)的影響Fig.3 Effects of seed soaking with exogenous ATP on malondialdehyde (A) and relative conductivity (B) of Brassica campestris seedling under NaCl stress

2.4.4 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 可溶性糖和脯氨酸是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白分子，穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)。如圖4可見(jiàn)，NaCl脅迫處理、ATP+NaCl復(fù)合處理都顯著增加了油菜幼苗中可溶性糖(圖4A)和脯氨酸(圖4B)含量，NaCl脅迫處理下可溶性糖、脯氨酸含量分別達(dá)到CK的187.8%和459.5%；ATP+NaCl復(fù)合處理下油菜幼苗中可溶性糖和脯氨酸含量分別達(dá)到NaCl脅迫處理的15.9%和41.0%。結(jié)果表明，NaCl脅迫處理下外源ATP浸種能顯著增加油菜幼苗中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，增強(qiáng)細(xì)胞的持水能力，維持細(xì)胞的正常生理代謝，從而增強(qiáng)油菜幼苗的耐鹽性。

圖4 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗中可溶性糖(A)和脯氨酸(B)的影響Fig.4 Effects of seed soaking with exogenous ATP on soluble sugar (A) and proline (B) content of Brassica campestris seedling under NaCl stress

2.5 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5.1 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗MAPK3/MAPK6基因表達(dá)的影響 如圖5所示，外源ATP處理下的油菜幼苗中MAPK3(圖5A)和MAPK6(圖5B)基因表達(dá)量分別較CK增加16.0%、7.0%。在NaCl單獨(dú)脅迫處理下的MAPK3和MAPK6基因表達(dá)量分別較CK增加86.0%和69.0%。ATP+NaCl處理下的MAPK3和MAPK6基因表達(dá)量分別較NaCl單獨(dú)脅迫處理增加75.3%、146.2%。結(jié)果表明，油菜幼苗中MAPK3和MAPK6基因的表達(dá)水平受到NaCl脅迫處理的誘導(dǎo)，外源ATP浸種增強(qiáng)了NaCl脅迫處理下油菜幼苗中MAPK3和MAPK6基因的表達(dá)。

圖5 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗中MAPK3(A)和MAPK6(B)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of seed soaking with exogenous ATP on the expression of MAPK3 (A) and MAPK6 (B) genes in Brassica campestris seedling under NaCl stress

2.5.2 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗SOS1/NHX1基因表達(dá)的影響 如圖6所示，NaCl脅迫處理下的油菜幼苗中NHX1(圖6A)和SOS1(圖6B)基因表達(dá)量上調(diào)，分別是CK的1.41倍和1.34倍。與NaCl單獨(dú)脅迫處理相比，ATP+NaCl處理下的油菜幼苗中NHX1和SOS1基因表達(dá)量分別上升了17.0%和66.4%。結(jié)果表明：油菜幼苗中NHX1和SOS1基因的表達(dá)受到NaCl脅迫處理的誘導(dǎo)，外源ATP浸種進(jìn)一步提高了NaCl脅迫處理下油菜幼苗中NHX1和SOS1基因的表達(dá)。

圖6 外源ATP浸種對(duì)NaCl脅迫處理下油菜幼苗NHX1(A)和SOS1(B)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of seed soaking with exogenous ATP on the expression of NHX1 (A) and SOS1 (B) genes in Brassica campestris seedling under NaCl stress

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫對(duì)植物的危害包含離子脅迫和滲透脅迫。斯琴巴特爾等[33]研究玉米(Zeamays)種子萌發(fā)時(shí)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫抑制了玉米種子的發(fā)芽。孫君艷等[34]研究鹽脅迫對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度鹽處理對(duì)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)起抑制作用。Chivasa等[35]研究結(jié)果表明：細(xì)胞外ATP可能通過(guò)直接或間接的方式與細(xì)胞膜外的某種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而在脅迫條件下提高細(xì)胞生存率。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200 mmol·L-1NaCl處理對(duì)油菜種子萌發(fā)有抑制作用，而25 μmol·L-1的外源ATP對(duì)油菜種子萌發(fā)有顯著的促進(jìn)作用，并能夠提高油菜幼苗的生物量積累，外源ATP浸種能緩解NaCl處理對(duì)油菜種子萌發(fā)的抑制作用。

植物在遭受鹽脅迫時(shí)會(huì)觸發(fā)一系列抗鹽相關(guān)基因的表達(dá)，如NHX和SOS基因的表達(dá)。液泡型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX1)可以將細(xì)胞質(zhì)中的Na+逆Na+濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中進(jìn)行區(qū)室化，質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SOS1)也可以將Na+排到胞外，防止細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器受到Na+的危害。過(guò)表達(dá)OsNHX1轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞在鹽條件下存活較好，生長(zhǎng)速度和總Na+含量顯著高于野生型[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，油菜幼苗中NHX1、SOS1基因的表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，而外源ATP浸種提高了鹽脅迫處理下油菜幼苗中NHX1、SOS1基因的表達(dá)，NHX1和SOS1轉(zhuǎn)錄水平的提高，預(yù)示著外源ATP處理觸發(fā)了NHX基因家族和SOS途徑介導(dǎo)的Na+外排。MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑在植物應(yīng)對(duì)鹽、干旱、寒冷、炎熱和受傷等信號(hào)過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用，主要是MAPK3、MAPK4和MAPK6被快速激活[39]。Teige等[20]研究發(fā)現(xiàn)，冷和鹽脅迫激活擬南芥的MKK2，控制冷應(yīng)答基因(COR)的表達(dá)，調(diào)控植物耐冷和耐鹽能力。而且，MKK2上游的MEKK1和下游的MPK4和MPK6都能被各種脅迫所激活。在本研究結(jié)果中，油菜幼苗中MAPK3、MAPK6基因的表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，而外源ATP浸種提高了鹽脅迫處理下油菜幼苗中MAPK3、MAPK6基因的表達(dá)。以上這些研究結(jié)果表明，外源ATP在調(diào)節(jié)植物響應(yīng)鹽脅迫的過(guò)程中，鹽超敏感 (SOS)通路以及MAPK激酶途徑等多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間可能存在交叉對(duì)話(huà)。

綜上所述，外源ATP浸種通過(guò)激活ROS清除系統(tǒng)來(lái)有效地清除過(guò)量的ROS，降低NaCl脅迫處理下油菜幼苗膜脂過(guò)氧化程度，促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累及抗鹽脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，有效保證油菜幼苗代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行，從而提高油菜幼苗的抗鹽性。