趙小強,方 鵬,彭云玲,張金文

(甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

低溫冷害是導(dǎo)致我國糧食產(chǎn)量波動的重要限制因素之一，其具有大尺度性、綜合性及地理區(qū)域差異性。玉米(ZeamaysL.)是集糧食、飼料、工業(yè)用途為一體的多功能作物，在保障國計民生中發(fā)揮著重要作用。由于玉米起源于熱帶、亞熱帶，是一種喜溫、短日照C4作物，生育期內(nèi)對溫度要求較高，遇低溫冷害時易受到傷害[1-2]。萌發(fā)期遇到10℃以下低溫時，玉米種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、種子活力明顯降低；5℃以下低溫時玉米種子不能發(fā)芽，且易感染病害而引發(fā)爛種[3-5]。苗期遇到10℃以下低溫時玉米幼苗生長明顯受到抑制，生理代謝紊亂；6～8℃低溫時幼苗停止生長；更低溫度時玉米幼苗細胞和組織產(chǎn)生不可逆的傷害，幼苗死亡[6-7]?；ㄆ谟龅?8℃以下低溫時抑制玉米開花[8]。灌漿期遇到20℃以下低溫時灌漿速度明顯減緩；16℃以下低溫時則明顯影響玉米淀粉酶活性而抑制碳水化合物的運輸與累積，進而導(dǎo)致減產(chǎn)[9]；收獲到脫粒前玉米種子含水量一般高于30%，這時極易發(fā)生0℃以下低溫致使種子活力喪失[5]。其中萌發(fā)期和苗期玉米對低溫冷害最為敏感，因而，深入研究低溫冷害對玉米萌發(fā)及幼苗的傷害機理，探索玉米耐寒性響應(yīng)機制，篩選、鑒定、創(chuàng)制耐寒種質(zhì)資源及尋找提高玉米耐寒性的有效方法一直是學(xué)者關(guān)注的熱點。

馬彥華等[3]在2℃低溫培養(yǎng)6 d后用存活率鑒定了36份玉米自交系的耐寒性強弱，篩選出7份強耐寒性自交系，并發(fā)現(xiàn)來自俄羅斯的自交系芽苗期耐寒性顯著強于其他地區(qū)的材料。彭云玲等[10]在6、10、15℃和25℃培養(yǎng)下用發(fā)芽率、胚芽長、胚根長、根數(shù)等綜合評價了44份玉米自交系的耐寒性強弱，并篩選出3份強耐寒性自交系，為今后玉米耐寒種質(zhì)篩選、鑒定與利用提供了可靠的技術(shù)支撐和材料。另外，學(xué)者一直在尋求增強植物耐寒性的簡單、高效方法，而外源調(diào)節(jié)物質(zhì)符合這一要求，主要包括滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[11-12]、植物生長調(diào)節(jié)劑[6,13]、信號分子[6,14-15]、營養(yǎng)元素[16]等，因其具有抗逆性廣、用量小、見效快、效益高等特點，同時又能促進植物的生長發(fā)育，是發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)的一項重要技術(shù)，因此該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到逆境脅迫下多種植物的安全生產(chǎn)實踐中。

甜菜堿(GB)是一類重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物及微生物體內(nèi)。研究表明當植物受到逆境(低溫、高溫、干旱、鹽漬、重金屬離子、水澇等)脅迫時，外源GB可參與植物細胞的滲透調(diào)節(jié)、穩(wěn)定膜和蛋白等亞細胞結(jié)構(gòu)及清除活性氧、進而能夠有效地保護細胞抵御逆境脅迫造成的傷害[17-21]。然而目前外源GB對玉米低溫冷害的緩解效果及其在提高玉米耐寒性的響應(yīng)機理等方面的研究罕見報道，為此，本研究以課題組前期篩選、鑒定的3份寒敏感和3份耐寒性玉米自交系為試材，在10℃低溫脅迫下于萌發(fā)期和苗期添加外源GB后，研究其對低溫脅迫下不同基因型自交系種子萌發(fā)和幼苗的影響，揭示玉米耐寒性響應(yīng)機理，并綜合評價外源GB對不同基因型自交系的調(diào)節(jié)效果，以期為外源GB在改善低溫逆境下玉米生長發(fā)育及生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗于2016年3—10月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)進行。供試材料為本課題組在2014—2015年間篩選、鑒定的3份寒敏感玉米自交系H105W、K22、B68和3份耐寒性自交系ND246、Va35-2、Va102[10]。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子預(yù)處理 選擇飽滿、均勻一致的玉米種子，先用0.5%的NaClO消毒10 min后用雙蒸水沖洗3次，且用滅菌濾紙吸干附著水，再分別以5種不同相應(yīng)濃度的GB溶液及雙蒸水常溫25℃浸種24 h，以備試驗所需。5種GB溶液濃度分別為：T1(10 μmol·L-1)，T2(20 μmol·L-1)，T3(30 μmol·L-1)，T4(40 μmol·L-1)，T5(50 μmol·L-1)。

1.2.2 低溫萌發(fā)試驗 將T1～T5溶液浸種后的3份寒敏感自交系種子各30粒，分別置于消毒發(fā)芽盒中，雙層滅菌濾紙作發(fā)芽床，并加入相應(yīng)濃度的GB溶液，將其置于氣候培養(yǎng)箱中于(10±1)℃和(25±1)℃先后暗培養(yǎng)各7 d，以雙蒸水浸種并用其培養(yǎng)的種子作為對照處理，其中(25±1)℃氣候培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)14 d的種子作為正向?qū)φ誄K(+)，(10±1)℃和(25±1)℃氣候培養(yǎng)箱中先后暗培養(yǎng)各7 d的種子作為負向?qū)φ誄K(-)，各處理3次重復(fù)。氣候培養(yǎng)箱相對濕度60%～80%，培養(yǎng)期間每2 d補一次對應(yīng)濃度溶液各15 mL，待種子暗培養(yǎng)第10 d時統(tǒng)計發(fā)芽勢，第14 d統(tǒng)計發(fā)芽率，并測量其他萌發(fā)性狀。參照趙小強等[12]方法，于萌發(fā)期篩選出外源GB的最佳低溫緩解濃度。再按上述方法分別在CK(+)、CK(-)及最佳低溫緩解濃度外源GB處理下培養(yǎng)6份自交系并測定各萌發(fā)性狀。

1.2.3 幼苗生長試驗 先將滅菌蛭石與雙蒸水按5 g∶1 mL比例均勻混合，再將T1～T5溶液及雙蒸水浸種后的3份寒敏感自交系種子各30粒，分別播于裝有滅菌蛭石的營養(yǎng)缽中。將其置于晝/夜溫度為(25±1)℃/(20±1)℃氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待雙蒸水浸種的種子長至三葉一心時，用雙蒸水快速洗掉幼苗根部蛭石，并用濾紙吸干附著水，再將幼苗分別置于300 mL相應(yīng)濃度的GB溶液中，并置于晝/夜溫度為(10±1)℃/(6±1)℃氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d作為試驗處理。以雙蒸水浸種并用其培養(yǎng)的幼苗作為對照處理，其中以晝/夜溫度為(25±1)℃/(20±1)℃氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d的幼苗作為正向?qū)φ誄K(+)，晝/夜溫度為(10±1)℃/(6±1)℃氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d的幼苗作為負向?qū)φ誄K(-)。幼苗培養(yǎng)期間每天光照12 h，光照強度600 μmol·s-1·m-2，相對濕度60%～80%。3次重復(fù)，每一處理下測定幼苗第3片葉的各生理性狀。參照趙小強等[12]方法，苗期篩選出外源GB的最佳低溫緩解濃度，再按上述方法分別在CK(+)、CK(-)及最佳低溫緩解濃度外源GB處理下培養(yǎng)6份自交系并測定幼苗葉片各生理性狀。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 玉米生長與生理性狀測定 玉米發(fā)芽勢及發(fā)芽率按以下公式計算：

發(fā)芽勢[22]=10 d內(nèi)正常發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

(1)

發(fā)芽率[22]=14 d內(nèi)正常發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

(2)

各處理取長勢一致的種子10粒，測定胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重；苗期各處理取長勢一致的幼苗3株，測定第3片葉的相對電導(dǎo)率(RC)[12]、丙二醛(MDA)含量[12]、脯氨酸(Pro)含量[21]、可溶性糖(SS)含量[22]、超氧化物歧化酶(SOD)活性[21-22]、過氧化物酶(POD)活性[21-22]、過氧化氫酶(CAT)活性[21-22]。

1.3.2 單個性狀的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)低溫緩解指數(shù) 借鑒趙小強等[12]方法計算各性狀的外源GB低溫緩解指數(shù)(ease index，EI)為：

(3)

(4)

式中，EIiTn為第i個性狀第Tn種濃度下的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)低溫緩解指數(shù)；XTn為第Tn種濃度下相應(yīng)性狀測定值；XCK(+)為CK(+)處理下的測定值；XCK(-)為CK(-)處理下的測定值。若測定性狀與耐寒性正相關(guān)，則用(3)式，反之用(4)式。EI為正值表示相應(yīng)濃度的外源GB對低溫脅迫起正向緩解作用，負值表示相應(yīng)濃度外源GB對低溫脅迫起負向緩解作用。

1.3.3 外源調(diào)節(jié)物質(zhì)低溫緩解能力綜合評價 以各測定性狀的EI作為低溫緩解評價指標，采用隸屬函數(shù)法綜合評價外源GB的低溫緩解效果[12]為：

(5)

(6)

式中，UiTn為第i個性狀第Tn種濃度下的外源GB低溫緩解隸屬值，EIimax為第i個性狀第n種濃度下的最大EI，EIimin為第i個性狀第n種濃度下的最小EI。若EI與外源GB的緩解效果正相關(guān)，則用(5)式，反之用(6)式，累加各隸屬值并求均值，均值越大，外源GB的低溫緩解效果越好。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2016進行處理和繪圖，采用IBM SPSS 19.0進行Duncan多重比較方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下外源GB的最佳低溫緩解濃度篩選

以3份寒敏感自交系為試材，萌發(fā)期和苗期分別測定各處理下的6個萌發(fā)性狀及7個幼苗生理性狀，然后計算出各性狀的EI并將其作為外源GB低溫緩解綜合評價指標，再采用隸屬函數(shù)法綜合評價不同外源GB的低溫緩解效果。由表1可知，萌發(fā)期和苗期低溫脅迫下，隨外源GB濃度的增大其低溫緩解效果呈先增后減的趨勢，其中萌發(fā)期外源GB的最佳低溫緩解濃度為T2(20 μmol·L-1)，苗期外源GB的最佳低溫緩解濃度為T1(10 μmol·L-1)。

表1 低溫脅迫下外源GB的低溫緩解效果綜合評價

2.2 外源GB處理下玉米自交系萌發(fā)和幼苗生理相關(guān)性狀的差異分析

表2和表3可知，在CK(+)、CK(-)及最佳低溫緩解濃度外源GB處理下培養(yǎng)了3份寒敏感自交系和3份耐寒性自交系，萌發(fā)及幼苗相關(guān)性狀方差分析顯示，6個萌發(fā)性狀和7個幼苗生理性狀在自交系間、在外源GB濃度間、在其互作間差異均顯著(P<0.01)；且低溫脅迫下外源GB濃度對這13個性狀的影響最大，自交系對這13個性狀的影響次之，其互作間對這13個性狀的影響最小，且F值依次減小。說明萌發(fā)期和苗期低溫脅迫下，不同玉米基因型間、外源GB濃度間及其互作間均能顯著影響玉米種子萌發(fā)和幼苗生理特性，但外源GB對玉米種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響遠遠大于自交系本身及其互作間的影響，因此，較耐寒性玉米而言，生產(chǎn)實踐中施加外源GB能更有效地改善低溫脅迫對玉米種子的萌發(fā)和幼苗的生理傷害。

表3 外源GB處理下玉米自交系幼苗性狀的方差分析(F值)

表2 外源GB處理下玉米自交系種子萌發(fā)性狀的方差分析(F值)

2.3 外源GB處理對玉米自交系種子萌發(fā)相關(guān)性狀的影響

不同基因型自交系種子萌發(fā)對低溫脅迫的敏感程度不同(P<0.05)。CK(-)處理下，6份自交系的6個萌發(fā)性狀都顯著降低，但與耐寒性自交系相比，寒敏感自交系6個萌發(fā)性狀的變化更加明顯(圖1)，說明低溫脅迫能顯著抑制玉米種子萌發(fā)，但低溫脅迫對耐寒性玉米種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)顯著低于寒敏感玉米。低溫脅迫下添加最佳濃度T2(20 μmol·L-1)外源GB將有效地促進玉米種子萌發(fā)(P<0.05)。且3份寒敏感自交系的6個萌發(fā)性狀分別是CK(-)處理的6.3、1.9、2.7、1.3、1.1和2.8倍，而3份耐寒性自交系的6個萌發(fā)性狀分別是CK(-)處理的1.1、1.4、2.4、1.3、2.0和2.2倍(圖1)。說明低溫脅迫下，添加最佳濃度外源GB后玉米6個萌發(fā)特性的改善效果不同，整體而言，寒敏感玉米的6個萌發(fā)性狀比耐寒性玉米的改善效果更強。

注：不同大寫字母表示同一自交系不同處理下P<0.01水平差異顯著。下同。Note: Different capital letters in the same inbred line indicated significant difference at P<0.01 level. The same below.圖1 低溫脅迫下添加最佳濃度外源GB后對玉米自交系種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of the optimal exogenous GB on maize seed germination for inbred lines under low temperature stress

2.4 不同處理對玉米自交系幼苗生理相關(guān)性狀的影響

不同基因型自交系幼苗遭受低溫傷害時，其體內(nèi)一系列生理代謝發(fā)生紊亂，幼苗明顯受到傷害(P<0.05)。CK(-)處理下6份自交系的7個幼苗生理性狀都顯著升高，但與耐寒性自交系相比，寒敏感自交系7個幼苗生理性狀的變化更加明顯(圖2)。說明低溫脅迫時玉米幼苗明顯受到傷害，但耐寒性玉米幼苗受傷害程度明顯小于寒敏感玉米。低溫脅迫下添加最佳濃度T1(10 μmol·L-1)外源GB將有效地改善玉米幼苗受到的生理傷害，但不同自交系間差異顯著(P<0.05)。且3份寒敏感自交系的7個生理性狀分別是CK(-)處理的0.4、0.6、1.2、1.3、1.0、1.3和1.5倍，而3份耐寒性自交系的7個生理性狀分別是CK(-)處理的0.8、0.8、1.2、1.2、1.2、1.3和1.6倍(圖2)。說明低溫脅迫下，添加最佳濃度外源GB后玉米7個幼苗生理特性的改善效果不同，整體而言，寒敏感玉米的7個生理性狀比耐寒性玉米的改善效果更強。

圖2 低溫脅迫下添加最佳濃度外源GB后對玉米自交系幼苗生理性狀的影響Fig.2 Effects of the optimal exogenous GB on maize seedling physiological traits for inbred lines under low temperature stress

2.5 低溫脅迫下添加最佳濃度外源GB后玉米自交系相關(guān)性狀的低溫緩解指數(shù)分析

由表4可知，萌發(fā)期低溫脅迫下，添加最佳濃度T2(20 μmol·L-1)外源GB對不同自交系6個萌發(fā)性狀的緩解方向和大小存在差異，其EI不盡相同(P<0.05)。且低溫脅迫下，添加T2外源GB后6份自交系各萌發(fā)性狀EI的變異系數(shù)介于15.75%～132.25%之間。

表4 低溫脅迫下添加最佳外源GB后不同玉米自交系種子萌發(fā)性狀的低溫緩解指數(shù)(EI)

由表5可知，苗期低溫脅迫處理下，添加最佳濃度T1(10 μmol·L-1)外源GB對不同自交系7個幼苗生理性狀的緩解方向和大小存在差異，其EI不盡相同(P<0.05)。且低溫脅迫下，添加T1外源GB后6份自交系各幼苗生理性狀EI的變異系數(shù)介于14.51%～95.40%之間。

表5 低溫脅迫下添加最佳外源GB后不同玉米自交系幼苗性狀的低溫緩解指數(shù)(EI)

2.6 低溫脅迫下添加最佳濃度外源GB后玉米自交系低溫緩解效果綜合評價

低溫脅迫下，以萌發(fā)、幼苗相關(guān)性狀EI作為外源GB低溫緩解評價指標，采用隸屬函數(shù)法綜合評價6份自交系的外源GB低溫緩解效果。由表6可知，低溫脅迫下，萌發(fā)期T2(20 μmol·L-1)濃度外源GB的平均低溫綜合緩解隸屬值為0.585，變異系數(shù)為44.22%，其在自交系間差異顯著(P<0.05)，且耐寒性自交系ND246的外源GB低溫緩解效果最佳，其隸屬值為0.866；寒敏感自交系K22的外源GB低溫緩解效果最小，其隸屬值為0.175。苗期低溫脅迫下，T1(10 μmol·L-1)濃度外源GB的平均低溫綜合緩解效果其隸屬值為0.454，變異系數(shù)為14.71%，其在自交系間差異顯著(P<0.05)，且耐寒性自交系Va35-2的外源GB低溫緩解效果最佳，其隸屬值為0.523，耐寒性自交系ND246的外源GB低溫緩解效果最小，其隸屬值為0.383。

表6 低溫脅迫下添加最佳外源GB后不同自交系的低溫緩解效果綜合評價

3 討論與結(jié)論

從播種到幼苗形態(tài)建成是玉米最容易遭受低溫冷害的關(guān)鍵時期，萌發(fā)期遭受低溫冷害時玉米種子活力下降，發(fā)芽勢、發(fā)芽率降低，導(dǎo)致出苗差甚至引起爛種等現(xiàn)象，而苗期遭受低溫冷害時，玉米幼苗生理代謝紊亂，長勢變?nèi)跎踔脸霈F(xiàn)死苗現(xiàn)象[3-7]。本試驗研究表明，萌發(fā)期遭受10℃低溫冷害時明顯抑制玉米種子萌發(fā)，因而其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚根鮮重均顯著降低，而苗期遭受10℃低溫冷害時玉米幼苗受到一定傷害，導(dǎo)致葉片的膜脂過氧化程度、細胞滲透調(diào)節(jié)能力及活性氧清除能力均顯著增強，因而其相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD、POD、CAT活性均顯著升高，且與3份寒敏感自交系相比，低溫脅迫下3份耐寒性自交系萌發(fā)較好，幼苗傷害較輕，抗寒性較強。因此，倒春寒和寒潮易發(fā)生的玉米種植區(qū)應(yīng)積極推廣耐寒性較強的玉米品種。

植物遭受逆境脅迫時，外源GB可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與植物細胞的滲透調(diào)節(jié)，亦可作為滲透保護物質(zhì)進而提高植物的抗逆性[17-22]?；谏鲜隹紤]，本試驗在10℃低溫脅迫下，利用3份寒敏感自交系玉米種子在萌發(fā)期和苗期分別篩選出最佳外源GB低溫緩解濃度為20 μmol·L-1和10 μmol·L-1，并在萌發(fā)期和苗期分別探索了最佳濃度外源GB對不同基因型玉米種子萌發(fā)及幼苗生理傷害的緩解機理與效果。結(jié)果表明，低溫脅迫下添加最佳濃度外源GB后會顯著增強玉米種子活力，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽長、胚根長、胚芽鮮重和胚根鮮重顯著升高，而其在不同自交系間的升高程度不同。整體而言，添加最佳濃度外源GB后對寒敏感自交系6個萌發(fā)性狀的緩解效果明顯大于耐寒性自交系。低溫脅迫下添加最佳濃度外源GB后對玉米幼苗的傷害具有顯著的緩解效果，其相對電導(dǎo)率和丙二醛含量顯著降低，而脯氨酸含量、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性和CAT活性顯著升高，而其在不同自交系間的緩解能力不同。整體而言，添加最佳濃度外源GB后對寒敏感自交系7個幼苗生理性狀的緩解效果明顯大于耐寒性自交系。另外，本試驗還表明，低溫脅迫下玉米的6個萌發(fā)性狀及幼苗7個生理性狀在自交系間、在外源GB濃度間、在其互作間差異均顯著，且6個萌發(fā)性狀和7個幼苗生理性狀在外源GB濃度間的差異(F值)遠遠大于自交系間及其互作間的差異。說明生產(chǎn)實踐中，較選育及推廣耐寒性玉米品種相比，通過施加相應(yīng)濃度的外源GB能更有效地改善低溫脅迫下玉米種子萌發(fā)及幼苗生理代謝，進而提高玉米的耐低溫能力。

為了比較低溫脅迫下最佳濃度外源GB對玉米種子萌發(fā)和幼苗的低溫緩解效果，以6個萌發(fā)性狀和7個幼苗生理性狀的外源GB低溫緩解指數(shù)EI為低溫緩解評價指標[12]，采用隸屬函數(shù)法綜合評價了最佳濃度外源GB對不同玉米的低溫緩解效果。結(jié)果表明，低溫脅迫下萌發(fā)期最佳濃度外源GB對玉米的低溫緩解效果(0.585)優(yōu)于苗期(0.454)，這可能與玉米種子在吸脹萌發(fā)時對受損傷的細胞膜結(jié)構(gòu)進行修復(fù)，對種子形成及萌發(fā)過程中產(chǎn)生的活性氧等各種有害物質(zhì)的清除、生長活性物質(zhì)的分解及玉米幼苗本身的逆境抵抗能力有關(guān)。Hoque等[18，23]研究也表明，鹽脅迫下添加外源GB后煙草主要通過提高SOD、CAT等活性進而減輕鹽脅迫對煙草的不利影響。因此，當玉米萌發(fā)期和苗期遭遇低溫冷害時，可選擇相應(yīng)濃度的外源GB來提高玉米的耐寒性，進而減輕低溫冷害對玉米造成的損害。