彭 剛，徐 宇，張 燕，王 靜，黃鴻兵，嚴維輝，許志強

( 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017 )

紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)，屬節(jié)肢動物門，甲殼綱，十足目，擬螯蝦科，光殼蝦屬[1]，體色為褐綠色或綠色，雄性成蝦第一步足大螯的外側(cè)頂端有一鮮紅、柔軟的膜質(zhì)帶[2]，紅螯螯蝦原產(chǎn)澳大利亞北部，個體大，食性雜，耐低氧，養(yǎng)殖當年即可上市，我國于1992年由湖北水產(chǎn)研究所引進該品種進行小規(guī)模試養(yǎng)。隨著人們對其基礎生物學特性不斷研究，養(yǎng)殖技術(shù)不斷完善，紅螯螯蝦在國內(nèi)養(yǎng)殖范圍逐步擴大，在海南、廣東、浙江、江蘇、湖北等地均有養(yǎng)殖成功的案例[3-4]，紅螯螯蝦國內(nèi)引進近30年，許多地區(qū)已建立了自己的繁育基地，實現(xiàn)了保種越冬、自繁自養(yǎng)。

線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因位于線粒體DNA中，是線粒體基因組13種氨基酸編碼序列之一，中度保守，進化速率適中，既能保證足夠的變異又易于擴增，且很少存在插入與缺失，適合種群水平差異的檢測[5-6]。近十年來，COⅠ基因被廣泛應用于物種分類及種內(nèi)種間遺傳分化研究[7-11]。目前國內(nèi)大部分紅螯螯蝦的繁養(yǎng)基地主要依賴于自有群體的養(yǎng)殖繁殖，經(jīng)過多代的自繁自育后其遺傳多樣性如何，國內(nèi)較少見文獻報道，僅謝雁南[12]對3個地區(qū)的紅螯螯蝦開展了群體遺傳學分析。為有效評估國內(nèi)不同地區(qū)繁養(yǎng)基地紅螯螯蝦種質(zhì)資源狀況，分析遺傳多樣性及遺傳分化水平，項目組采集了6個主要繁養(yǎng)區(qū)域的紅螯螯蝦，基于線粒體DNA COⅠ基因序列對不同群體的遺傳多樣性進行初步評估，為后續(xù)開展紅螯螯蝦的培育以及選育工作積累數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用紅螯螯蝦于2018年10—12月采自國內(nèi)6個紅螯螯蝦繁養(yǎng)區(qū)，分別為安徽阜陽、浙江湖州、廣東珠海、江蘇鎮(zhèn)江、海南澄邁、江蘇蘇州，樣本采集量均為100尾以上，每個群體隨機取30尾用于后續(xù)的群體遺傳學分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板制備

取紅螯螯蝦尾部肌肉組織，常規(guī)酚—氯仿法提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，紫外分光光度法檢測樣品DNA含量及純度。

1.2.2 PCR擴增及序列測定

參照紅螯螯蝦COⅠ基因序列(GenBank：HG942364.1)設計引物用于線粒體COⅠ基因擴增和序列測定。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，COⅠ-F: 5′-TTGTGTTCGGAGCCTGAT-3′; COⅠ-R: 5′-AGAAGGTCTTCCTGGTAGG-3′。對每個樣本的線粒體 COⅠ基因序列進行擴增，PCR反應體系為25 μL：模板DNA 25 ng，2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補足體積。反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，經(jīng)30個循環(huán)再72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以標準DL2000 Ladder(TAKARA)估算產(chǎn)物大小。PCR擴增產(chǎn)物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司測序獲取序列信息。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

通過雙向測序獲得紅螯螯蝦線粒體COⅠ序列，經(jīng)SeqManⅡ(DNASTAR Inc)軟件拼接并進行人工核查和校正，所獲序列用Clustal X軟件進行比對，用Mega 6.0軟件中的Kimura雙參數(shù)法計算遺傳距離。用Modeltest 3.16計算位點間堿基替代率的Gamma分布參數(shù)，并以鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。通過單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析當前不同繁養(yǎng)區(qū)紅螯螯蝦群體的遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列變異特征分析

共獲取了6個紅螯螯蝦群體共180個樣品的線粒體COⅠ基因序列，對其進行對比分析，比對長度為831 bp，其中變異位點為56個，變異比率為6.7%，簡約信息位點16個，單核苷酸多態(tài)性位點76個。平均A、T、G、C堿基含量分別為27.840%、32.395%、14.848%、24.917%。紅螯螯蝦線粒體COⅠ基因G+C(%)含量較低39.765%，表現(xiàn)出較為明顯的堿基組成偏倚性。

在6個群體180個樣本中共檢測出 10 種單倍型(表1)。安徽阜陽群體與江蘇蘇州群體、海南澄邁3個群體間有2個共享單倍型 (H1/H3)。單倍型H1出現(xiàn)次數(shù)最多，為浙江湖州以外的5個群體的共享單倍型，單倍型 H2、H5、H7以及H10分別為安徽阜陽、海南澄邁、浙江湖州以及江蘇蘇州群體所特有的單倍型。

表1 紅螯螯蝦6個群體COⅠ基因單倍型(H1～H10)的分布

遺傳多樣性結(jié)果表明，本試驗中所涉及的紅螯螯蝦群體均具有較高的遺傳多樣性(表 2)，其總體單倍型多樣性指數(shù)為0.693，核苷酸多樣性指數(shù)為0.00652。其中，江蘇蘇州群體的單倍型多樣性指數(shù)最高(0.964)，海南澄邁群體最低(0.618)，核苷酸多樣性指數(shù)以浙江湖州群體最高(0.01587)，海南澄邁群體最低(0.01219)。

表2 紅螯螯蝦6個群體遺傳多樣性指數(shù)

2.2 群體結(jié)構(gòu)及分子遺傳變異

6個紅螯螯蝦群體間的遺傳距離為0.00403～0.00969(表3)。其中海南澄邁群體和安徽阜陽群體間的遺傳距離較大，為0.00969，廣東珠海群體和江蘇蘇州群體間的遺傳距離最小，為0.00403。其中安徽阜陽群體與其他5個群體間的遺傳距離均較遠。

表3 紅螯螯蝦6個群體間的遺傳距離

以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系圖顯示，江蘇蘇州群體和浙江湖州群體首先聚為一支，并逐漸與江蘇鎮(zhèn)江、海南澄邁、廣東珠海群體聚集，安徽阜陽群體單獨為一支(圖1)。

圖1 紅螯螯蝦6個群體的聚類分析

3 討 論

3.1 紅螯螯蝦COⅠ基因片段變異及特征分析

紅螯螯蝦原產(chǎn)于澳大利亞北部及昆士蘭西北部地區(qū)，我國最早于1992年由湖北水產(chǎn)研究所引進，1998年浙江湖州突破了紅螯螯蝦規(guī)?；斯し敝臣夹g(shù)，目前江蘇、浙江、廣東、海南等地是我國紅螯螯蝦的主要養(yǎng)殖地區(qū)。多年來，由于群體引進記錄不完善，國內(nèi)不同繁養(yǎng)群體的遺傳特征(特別是不同群體間的親緣關(guān)系)尚未被系統(tǒng)研究，紅螯螯蝦養(yǎng)殖過程中又存在無序留種、單一群體累代繁殖等問題，養(yǎng)殖過程中相繼出現(xiàn)病害頻發(fā)等現(xiàn)象。為解決種群退化問題，國內(nèi)相關(guān)企業(yè)已多次從國外引進紅螯螯蝦對國內(nèi)繁養(yǎng)群體進行種質(zhì)更新。在紅螯螯蝦引種過程中，由于不同批次引進群體的遺傳特征數(shù)據(jù)尚未獲取，無序引種一方面造成了巨大的資金浪費，同時也限制了國內(nèi)已有繁養(yǎng)群體的應用潛力。因此，對國內(nèi)不同繁養(yǎng)基地已有紅螯螯蝦群體進行遺傳特征分析，獲取其遺傳多樣性及不同群體間的親緣關(guān)系數(shù)據(jù)，對于有效利用國內(nèi)已有紅螯螯蝦種質(zhì)資源具有重要的意義。

謝雁南[12]利用微衛(wèi)星分子標記對國內(nèi)廈門、廣州、崇明3個紅螯螯蝦養(yǎng)殖群體進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)3個群體的平均表觀雜合度為0.648～0.679，平均期望雜合度為0.535～0.567，平均多態(tài)信息含量為0.451～0.480，每個點位等位基因數(shù)為2～7，養(yǎng)殖群體尚未出現(xiàn)種質(zhì)退化。線粒體基因組具有結(jié)構(gòu)簡單、分子小、進化快等特征，遵循嚴格的母系遺傳，幾乎不發(fā)生重組，不同區(qū)域的進化速度存在差異，而被廣泛應用于種群遺傳分化及多樣性的研究[13-14]，本試驗遺傳多樣性分析結(jié)果表明，國內(nèi)紅螯螯蝦累代繁育群體均具有較高的遺傳多樣性，這與上述謝雁南[12]得出的養(yǎng)殖群體尚未出現(xiàn)種質(zhì)退化結(jié)論基本相同。究其原因，主要與該品種引入國內(nèi)時間較短，同時部分繁養(yǎng)基地由于前期繁養(yǎng)不成功，會從其他繁養(yǎng)基地或澳大利亞、中國臺灣補充少量種蝦，群體間的基因交流也有效保持了各群體均具有較高的遺傳多樣性。6個群體中海南澄邁群體和廣東珠海群體單倍型多樣性較低，推測或因紅螯螯蝦在該地區(qū)繁養(yǎng)環(huán)境條件較為適宜，養(yǎng)殖經(jīng)驗較為豐富，基本解決“繁養(yǎng)推”一體化，多年的自繁自養(yǎng)等因素導致其遺傳多樣性相對較低。浙江是國內(nèi)較早攻克紅螯螯蝦室內(nèi)人工苗種繁育技術(shù)的地區(qū)，該地區(qū)苗種的供給比較成熟，有相對獨立的親本引繁體系。試驗中發(fā)現(xiàn)，浙江繁養(yǎng)群體缺乏H1單倍型，推測浙江群體與其他群體間的基因交流相對較少，而且該單倍型可能來源于最新從國外引進的紅螯螯蝦群體。

3.2 不同繁育基地紅螯螯蝦遺傳距離及交流情況

Nei[15]認為，群體間的遺傳距離為0.00～0.05。本研究中6個紅螯螯蝦群體間的遺傳距離為0.00403～0.00969，低于李吉濤等[16]測定的脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)渤海灣、萊州灣、膠州灣、海州灣4群體間的遺傳距離(0.0153～0.0345)。由6個群體間遺傳距離結(jié)果來看，由于交流頻繁，廣東珠海群體和江蘇蘇州群體間遺傳距離最小，同時由于地緣關(guān)系江浙一帶群體間遺傳距離也較小，但安徽阜陽群體與其他5個群體間的遺傳距離均較遠，推測與其親本引進渠道及外界交流較少有關(guān)。紅螯螯蝦在江浙等內(nèi)陸地區(qū)不能自然繁殖，無法自然進行種群的擴散繁衍，其種質(zhì)的保存與更新完全依賴人為的干預。

3.3 紅螯螯蝦資源的保護與利用

養(yǎng)殖業(yè)會受到長期近親繁殖帶來的產(chǎn)量下降等一系列影響[17]，本試驗結(jié)果初步表明，目前我國紅螯螯蝦繁養(yǎng)群體遺傳多樣性水平仍然較高，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖行業(yè)的推進，紅螯螯蝦長期自繁自養(yǎng)的弊端可能會逐步凸顯，如何加強對種質(zhì)資源的評估和繁育群體多樣性的保護更新，對推動紅螯螯蝦產(chǎn)業(yè)長期健康穩(wěn)定發(fā)展具有重要的現(xiàn)實指導意義。