劉曉娉，蔡 苗，劉慶慧，萬(wàn)曉媛，黃 倢

( 1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 2.上海海洋大學(xué)，上海 201306 )

白斑綜合征其病原為白斑綜合征病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)，自20世紀(jì)90年代暴發(fā)于我國(guó)后，迅速蔓延至東南亞、南亞、南美洲、北美洲的許多國(guó)家[1-2]。白斑綜合征病毒的宿主范圍十分廣泛，苗種的攜帶是其傳播的重要來(lái)源，并且具有很高的致病性，感染白斑綜合征的病蝦死亡率高達(dá)100%[3-4]。這種廣泛的宿主范圍和高致病力被認(rèn)為是白斑綜合征病毒快速和廣泛傳播的主要原因，給全球范圍內(nèi)的對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。

隨著白斑綜合征的暴發(fā)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從病原學(xué)、傳播途徑、流行病學(xué)等方面對(duì)其展開(kāi)了廣泛的研究[5]。2001年中國(guó)、美國(guó)科學(xué)家完成了其全基因組的測(cè)序工作。迄今為止，在GenBank上共有7種白斑綜合征病毒分離株的基因組全序列，分別為中國(guó)臺(tái)灣株(TW，AF440570，307 287 bp)、中國(guó)株(CN，AF332093，305 107 bp；CN01，KT995472.1，309 286 bp；CN02，KT995470.1，294 261 bp；CN03， KT995471.1，284 148 bp)、韓國(guó)株(KR，JX515788，295 884 bp)和泰國(guó)株(TH，AF369029，292 967 bp)[6]。核苷酸序列的同一性為99%，其中起源于泰國(guó)株的WSSV-TH-96-Ⅱ 具有目前最大的基因組序列，約為312 kb，被假定為祖先株[7]。白斑綜合征病毒全序列的公布，對(duì)進(jìn)一步研究其基因的結(jié)構(gòu)和功能起到了指導(dǎo)作用。白斑綜合征病毒全基因組中可變位點(diǎn)序列的缺失及變異可能影響其病毒的復(fù)制及傳播，產(chǎn)生致病力的差異。目前鑒定出5個(gè)可變基因座，包括2個(gè)具有基因組缺失的區(qū)域(ORF23/24和ORF14/15缺失區(qū))和3個(gè)具有重復(fù)單元變化差異(VNTR)的基因座(ORF75、ORF94和ORF125)[8]，主要應(yīng)用于白斑綜合征病毒分子流行病學(xué)的研究。另一方面，對(duì)于白斑綜合征病毒的衣殼蛋白和囊膜蛋白功能研究也有了一定的了解[9]，如VP26作為白斑綜合征病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，將病毒粒子黏附于宿主細(xì)胞，完成進(jìn)一步的侵染作用[10-11]；VP28的抗血清功能可以中和白斑綜合征病毒對(duì)蝦的感染[12]。而對(duì)于病毒不同分離株其他開(kāi)放閱讀框的基因變異研究相對(duì)較少。

筆者選取2017年2—6月在中國(guó)部分地區(qū)采集的44個(gè)白斑綜合征病毒陽(yáng)性樣本進(jìn)行白斑綜合征病毒DNA聚合酶wsv-pol、wsv313、wsv150這3個(gè)未知功能的基因位點(diǎn)DNA以及蛋白質(zhì)序列的變異情況分析，為進(jìn)一步研究白斑綜合征病毒基因變異位點(diǎn)的功能提供材料。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

44份凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei) 白斑綜合征病毒陽(yáng)性樣本于2017年2—6月分別采自河北、浙江、山東、上海、福建和廣東6個(gè)不同省市，所有樣品采集后當(dāng)日冷藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室于冰箱中-20 ℃冷凍保存。樣本采集信息如編號(hào)、產(chǎn)地、品種見(jiàn)表1。

表1 凡納濱對(duì)蝦樣品采集信息

(續(xù)表1)

1.2 病毒核酸提取

自保存的樣本中約取30 mg鰓組織，按照海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，天根生化科技有限公司)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，將提取的DNA樣本置于-20 ℃冷凍保存待用。

1.3 PCR檢測(cè)

對(duì)白斑綜合征病毒DNA樣本采用GB/T 28630.2—2012《白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第2部分套式PCR檢測(cè)法》為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物通過(guò)用1×TAE電泳緩沖液配制的1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.4 PCR擴(kuò)增

用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出序列的特異性引物，然后將白斑綜合征病毒陽(yáng)性樣本進(jìn)行wsv-pol、wsv313、wsv150基因的擴(kuò)增，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列與反應(yīng)條件見(jiàn)表2。

表2 PCR擴(kuò)增的引物及反應(yīng)條件

PCR擴(kuò)增體系總量為25 μL，分別為：2.5 μL 10×ExTaq Buffer，2 μL dNTP，1 μL正向引物，1 μL反向引物，0.2 μL ExTaq酶，17.3 μL無(wú)菌水，1 μL DNA模板。

1.5 目的基因克隆與序列分析

將PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳結(jié)果中的條帶進(jìn)行回收。純化的目的基因產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布于LB(+Amp)固體培養(yǎng)基上。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，每個(gè)平板挑取至少5個(gè)單菌落接種于LB(+Amp)液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h。取1 μL培養(yǎng)物為模板按1.4中的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)條帶與目的條帶一致的菌液全部送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN 8軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，分別以中國(guó)大陸株(WSSV-CN，AF302293.3)序列作為參照，得出核酸水平上的變異情況；用ORF Finder處理測(cè)序結(jié)果，得到編碼的氨基酸序列，用DNAMAN 8軟件分析，得出氨基酸水平上的變異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 wsv-pol擴(kuò)增結(jié)果

在2017年的44份白斑綜合征病毒陽(yáng)性樣本中，wsv-pol的目的條帶只在福建霞美鎮(zhèn)、廣東湛江、山東東營(yíng)和上海4個(gè)地區(qū)的樣本中出現(xiàn)(圖1)，共有12個(gè)樣本(7、8、9、10、11、13、14、28、29、30、38、43)，檢出率為27%，其余32個(gè)樣本均未擴(kuò)增出該基因片段。

圖1 wsv-pol的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 wsv313擴(kuò)增結(jié)果

在wsv313的擴(kuò)增中，共出現(xiàn)12份陽(yáng)性樣本，分別出現(xiàn)在福建深土鎮(zhèn)(6)、福建霞美鎮(zhèn)(7、8、9、10、12、13)、廣東湛江(28、29、30)、山東濱州(37)和上海(43)，檢出率約為27%(圖2)。

圖2 wsv313的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.3 wsv150擴(kuò)增結(jié)果

在2017年44個(gè)陽(yáng)性樣本的wsv150的PCR擴(kuò)增中，共出現(xiàn)8個(gè)陽(yáng)性樣本，分別出現(xiàn)在福建霞美鎮(zhèn)(7、9、11、14)、廣東湛江(28、29)、山東濱州(37)和山東東營(yíng)(38) 4個(gè)地區(qū)，其檢出率為18%(圖3)。

圖3 wsv150的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.4 序列比對(duì)

2017年的12個(gè)wsv-pol陽(yáng)性樣本中，均在第491～493位缺失GAG 3個(gè)核苷酸，由此產(chǎn)生氨基酸水平上的變化是在第164位缺失1個(gè)甘氨酸(G)，此外8號(hào)樣本核酸在37位T變?yōu)镃，在101位 T 變?yōu)镃，由此導(dǎo)致氨基酸在13位由酪氨酸(Y)變?yōu)榻M氨酸(H)，在34位亮氨酸(L)變?yōu)楦彼?P)。10號(hào)樣本分別在106位賴(lài)氨酸(K)變?yōu)楫惲涟彼?I)，在214位谷氨酰胺(Q)變?yōu)榫彼?R)，在218位賴(lài)氨酸(K)變?yōu)榫彼?R)(表3)。

表3 wsv-pol變異情況

在2017年的wsv313的特異性擴(kuò)增中共出現(xiàn)12個(gè)陽(yáng)性樣本，均在27位核酸G替換為A。除29、30號(hào)樣本外均在822到824位插入核酸TCC，即在280位插入脯氨酸。此外9號(hào)樣本分別在86位氨基酸天冬酰胺(N)變?yōu)榻z氨酸(S)，在94位苯丙氨酸(F)變?yōu)榻z氨酸(S)，在258位精氨酸(R)變?yōu)楦拾彼?G)。而29、30號(hào)樣本，在64位天冬氨酸(D)變?yōu)楦拾彼?G)(表4)。

表4 wsv313變異情況

wsv150氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示，測(cè)序樣本均出現(xiàn)不同程度的缺失或突變。主要存在兩大類(lèi)變異情況。一是106個(gè)氨基酸大片段缺失，發(fā)生在第200個(gè)氨基酸之后(圖4)，分別出現(xiàn)在福建霞美鎮(zhèn)(7、9、11、14)、廣東湛江(28、29)、山東濱州(37)、山東東營(yíng)(38)的樣本中。二是發(fā)生4個(gè)氨基酸的變異也均出現(xiàn)在8個(gè)陽(yáng)性樣本中，即第196位丙氨酸(A)突變?yōu)槔i氨酸(V)，第197位亮氨酸(L)突變?yōu)楸彼?A)，第198位谷氨酰胺(Q)突變?yōu)楦彼?P)，第199位苯丙氨酸(F)變?yōu)槔i氨酸(V)(表5)。

圖4 wsv150 氨基酸片段缺失示意

表5 wsv150變異情況

3 討 論

3.1 白斑綜合征病毒的基因組研究

白斑綜合征病毒是環(huán)狀雙鏈DNA病毒，基因組大小約300 kb，是目前已測(cè)序的最大動(dòng)物病毒之一。白斑綜合征病毒由于地理范圍和宿主類(lèi)別等環(huán)境的不同，導(dǎo)致不同毒株基因存在差異，這種差異往往通過(guò)研究ORF14/15和ORF23/24的缺失，ORF75、ORF94和ORF125的重復(fù)單元數(shù)目以及SNP來(lái)獲得。已有的研究表明，對(duì)蝦鰓組織是白斑綜合征病毒主要靶組織，因此試驗(yàn)中取鰓組織進(jìn)行病毒檢測(cè)[13]。近年的研究表明，除白斑綜合征病毒可變區(qū)外，不同分離株中個(gè)別ORF也存在明顯的變異。Li等[14]分析了不同毒力3株白斑綜合征病毒全基因組序列發(fā)現(xiàn)WSSV-CN01，WSSV-CN02，WSSV-CN03 與WSSV-CN相比具97.32%、97.23%、91.65%的同源性，但也存在一些差異。據(jù)報(bào)道[15]，wsv001在中國(guó)不同地區(qū)的白斑綜合征病毒分離株中存在明顯變異。

3.2 白斑綜合征病毒可變位點(diǎn)的變異分析

DNA聚合酶是參與DNA復(fù)制的重要酶類(lèi)，同時(shí)DNA聚合酶基因也是白斑綜合征病毒復(fù)制過(guò)程中關(guān)鍵作用酶基因的組成部分，屬于白斑綜合征病毒的致病因子之一[5]。完整的病毒DNA聚合酶序列全長(zhǎng)6585 bp，編碼2195個(gè)氨基酸(wsv-pol)。本研究中，wsv-pol是一段高度保守的序列，擴(kuò)增片段氨基酸位于500～950位，其擴(kuò)增片段中包含DNA聚合酶的功能區(qū)。在2017年樣本的擴(kuò)增中，wsv-pol的目的條帶只在福建霞美鎮(zhèn)、廣東湛江、山東東營(yíng)和上海4個(gè)地區(qū)的樣本中出現(xiàn)，共有12個(gè)陽(yáng)性樣本，檢出率為27%。比對(duì)結(jié)果顯示，12個(gè)陽(yáng)性樣本均在第491～493位缺失GAG 3個(gè)核苷酸，由此產(chǎn)生的氨基酸水平上的變化是在第164位缺失1個(gè)甘氨酸。該甘氨酸的缺失對(duì)白斑綜合征病毒 DNA聚合酶功能的影響尚需進(jìn)一步研究。除此之外福建霞美鎮(zhèn)的8、10號(hào)樣品存在不同的個(gè)別氨基酸替換現(xiàn)象，表現(xiàn)出了同一地區(qū)的差異性。研究結(jié)果顯示，wsv-pol未表現(xiàn)出較大程度的變異，但變異情況較為復(fù)雜，分別表現(xiàn)出了地區(qū)的差異性和一致性。

wsv313全長(zhǎng)3543 bp，編碼1180個(gè)氨基酸，其195～483位氨基酸是微管結(jié)合蛋白MIP-T3的功能區(qū)。本研究側(cè)重分析wsv313編碼氨基酸功能區(qū)(195～483位氨基酸)即微管結(jié)合蛋白功能的變異情況。在福建深土鎮(zhèn)及霞美鎮(zhèn)、廣東湛江、山東東營(yíng)和上海4個(gè)地區(qū)也出現(xiàn)12個(gè)wsv313陽(yáng)性樣本，檢出率為27%。對(duì)12個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序分析表明，wsv313均在27位核酸G替換為A，除去29、30、43號(hào)樣品外均在822到824位插入核酸TCC，即在280位插入脯氨酸。脯氨酸是一種環(huán)狀的亞氨基酸，為海洋浮游生物中一種含量居中的氨基酸，一旦進(jìn)入肽鏈后，可發(fā)生羥基化作用，從而形成4-羥脯氨酸，是組成動(dòng)物膠原蛋白的重要成分。有研究表明，脯氨酸可以維持膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，清除活性氧，其累積量與植物的抗逆性呈正相關(guān)[16-17]。此外，蔡苗等[18]在對(duì)白斑綜合征病毒變異情況分析的研究中發(fā)現(xiàn)，wsv006位點(diǎn)氨基酸的主要變異情況也是脯氨酸的插入。推測(cè)白斑綜合征病毒脯氨酸的插入是為了增強(qiáng)自身對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性而發(fā)生的選擇性變異，上述變異是否造成微管結(jié)合蛋白功能的改變還有待進(jìn)一步研究。

wsv150含305個(gè)氨基酸，比對(duì)結(jié)果顯示，測(cè)序樣品均出現(xiàn)不同程度的缺失或突變，主要發(fā)生在福建霞美鎮(zhèn)、廣東湛江、山東濱州、山東東營(yíng)4個(gè)地區(qū)，檢出率約為18%。研究結(jié)果顯示，不同地區(qū)樣本變異情況存在一致性，在8個(gè)陽(yáng)性樣品中均出現(xiàn)大片段缺失及196～199位氨基酸的突變。其大片段的氨基酸缺失可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分子構(gòu)型發(fā)生變化，功能部分或者完全喪失。

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果表明，wsv-pol和wsv313的核酸序列保守性較高，核苷酸序列的變化引起氨基酸變化未出現(xiàn)較大程度的變異，各分離株間的差異也極小，而wsv150的變異程度較大，表現(xiàn)出地區(qū)之間高度一致性。白斑綜合征病毒不同分離株基因變異而致氨基酸變異，這些缺失和變異對(duì)致病力的影響還有待于進(jìn)一步的研究。