程 超，肖 敏，李 菁，毛振方，張翠真，陳志和，朱敏杰，簡(jiǎn)少卿,3，趙大顯,3

( 1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031； 2.江西省吉安市井岡山農(nóng)業(yè)科技園，江西 吉安 343000； 3.江西省水產(chǎn)動(dòng)物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330031 )

中華絨螯蟹(Ericheirsinensis)，俗稱河蟹、毛蟹、大閘蟹等，是我國(guó)重要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，因肉質(zhì)鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求量的不斷擴(kuò)大，其增養(yǎng)殖模式在不斷發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模也在逐步擴(kuò)大。自20世紀(jì)80年代起，人工池塘養(yǎng)殖開始起步，在2000年后，中華絨螯蟹池塘生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)已逐漸成熟，到2016年全國(guó)中華絨螯蟹總產(chǎn)量達(dá)8.23×105t，產(chǎn)值超過(guò)400億元[1]。隨著人工養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，其病害問(wèn)題亦日趨突出，嚴(yán)重影響了中華絨螯蟹的養(yǎng)殖效益。因此，從根源上探明中華絨螯蟹的免疫機(jī)制，有效提高中華絨螯蟹的品質(zhì)和抗病能力就顯得尤為重要。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)作為一種較常見的條件致病菌，在水環(huán)境中廣泛存在，是一種典型的人—獸—魚共患的致病菌，也是魚類發(fā)病的主要病原[2]。目前有關(guān)嗜水氣單胞菌對(duì)經(jīng)濟(jì)類水產(chǎn)品的致病性研究，多集中在硬骨魚類、兩棲類和爬行類，而對(duì)甲殼動(dòng)物如蝦、蟹等的研究則不多[2-3]。余雪明等[4]在對(duì)13種貝類及甲殼類海產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，致病性氣單胞菌檢測(cè)出8種，檢出率高達(dá)61.29%，其中以嗜水氣單胞菌數(shù)量最多；衣啟麟[5]則指出，致病性嗜水氣單胞菌會(huì)導(dǎo)致中華絨鰲蟹的顫抖病和水腫病等多種疾病的發(fā)生，也是蝦蟹類養(yǎng)殖病害中主要細(xì)菌病原之一。

筆者選定嗜水氣單胞菌為感染病原，采用注射方式急性感染中華絨螯蟹，探究其重要免疫器官組織結(jié)構(gòu)變化和免疫相關(guān)基因表達(dá)規(guī)律，有助于從組織和分子水平揭示中華絨螯蟹對(duì)嗜水氣單胞菌的免疫應(yīng)答機(jī)理以及嗜水氣單胞菌對(duì)中華絨螯蟹的致病機(jī)理，為尋找更科學(xué)的蟹病防治措施、提高養(yǎng)殖對(duì)象抗病能力，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

中華絨螯蟹由南昌市墩子塘水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)得，規(guī)格為80～100 g，經(jīng)充分曝氣自來(lái)水(水溫24 ℃，pH 6.8，溶解氧>5.0 mg/L)暫養(yǎng)7 d后，挑選健康、規(guī)格基本一致且肢體健全的蟹用于嗜水氣單胞菌免疫刺激試驗(yàn)。

1.2 嗜水氣單胞菌

嗜水氣單胞菌(ATCC35654標(biāo)準(zhǔn)菌株)自上海復(fù)祥生物科技有限公司購(gòu)得；菌種使用營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基活化，并在營(yíng)養(yǎng)肉汁液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)(30 ℃培養(yǎng)24 h)后，于4 ℃，3240 r/min下離心15 min，棄上清液，沉淀用生理鹽水(0.9%)進(jìn)行洗滌、懸浮，懸浮后菌液密度約為2.8×108cfu/mL。

1.3 嗜水氣單胞菌免疫刺激試驗(yàn)

試驗(yàn)分為感染組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)75 cm×55 cm×45 cm試驗(yàn)桶中放中華絨螯蟹21尾，共計(jì)126尾。試驗(yàn)期間日換水量約1/2～1/3，換水時(shí)清除污物，試驗(yàn)期間不投餌。試驗(yàn)組，使用1 mL的醫(yī)用一次性注射器取1.2中懸浮后菌液0.1 mL，于中華絨螯蟹第三步足基膜處注射進(jìn)腹部肌肉；對(duì)照組注射等體積生理鹽水。試驗(yàn)期間各組中華絨螯蟹均無(wú)死亡，于注射后0、3、6、12、24、48 h和72 h各平行組取2尾中華絨螯蟹分別抽取血淋巴，4 ℃，11 240 r/min離心10 min收集血細(xì)胞[按1∶1加入預(yù)冷抗凝劑后抽取樣蟹血淋巴，離心得到的血細(xì)胞加入適量TRIzol?Reagent (Life Technologies,USA)后置于冰箱-80 ℃凍存]，用于總RNA抽提。隨后對(duì)試驗(yàn)蟹進(jìn)行解剖，小心取出中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺組織(組織塊大小約0.5 cm×1.0 cm)，用生理鹽水浸洗，濾干水分后置于體積比為20∶1的10%甲醛溶液中常溫保存，備用于組織切片觀察。

1.4 組織切片和測(cè)量

采用常規(guī)石蠟切片、蘇木精—伊紅染色對(duì)感染前后中華絨螯蟹鰓和肝胰腺組織進(jìn)行切片制作，并通過(guò)顯微鏡(尼康TI-S)進(jìn)行觀察、測(cè)量和拍照。

1.4.1 鰓絲厚度的測(cè)量

隨機(jī)選擇各時(shí)段切片視圖中5根結(jié)構(gòu)完整的鰓絲，從鰓軸起至鰓絲末端間隨機(jī)選擇10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，求取平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4.2 肝小管管腔比面積的測(cè)量

隨機(jī)挑取各時(shí)段切片視圖中5個(gè)結(jié)構(gòu)完整的肝小管橫截面圖，因肝小管近橢圓形，取橢圓長(zhǎng)軸直徑、短軸直徑進(jìn)行測(cè)量，利用橢圓面積公式粗略計(jì)算肝小管橫截面積；因管腔形狀不規(guī)則，對(duì)環(huán)截面厚度的測(cè)量采用對(duì)環(huán)截面進(jìn)行均勻布點(diǎn)，以多次(8～10次)測(cè)量求取平均值，估算肝小管管腔面積占比，取5次估算值的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4.3 指標(biāo)計(jì)算公式

(1)

(2)

(3)

式中，TL表示中華絨螯蟹的鰓絲平均厚度，n為測(cè)量次數(shù)，T1、T2…Tn為各次測(cè)量的數(shù)值；S0為中華絨螯蟹肝小管的橫截面積，a、b表示肝小管長(zhǎng)軸、短軸直徑；φ為估算的肝小管管腔面積占比，t表示肝小管厚度。

1.5 免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析

1.5.1 總RNA提取與cDNA模板獲得

取上述1.3中凍存血細(xì)胞樣品，采用Trizol法提取總RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，cDNA合成后于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)分析

使用熒光定量PCR儀Bio-Rad CFX Manager 3.1進(jìn)行qPCR檢測(cè)分析。PCR反應(yīng)體系(20 μL)參照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)進(jìn)行，組分為：SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (2×) 10 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL，Template (<100 ng) 2 μL，dH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件如下：

步驟1：95 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)；步驟2：95 ℃變性30 s；步驟3：58～60 ℃退火30 s；步驟4：72 ℃延伸30 s，共39個(gè)循環(huán)；步驟5：溶解曲線分析，95 ℃ 5 s (變溫速率4.4 ℃/s)，60 ℃ 1 min (變溫速率2.2 ℃/s)，95 ℃(變溫速率0.11 ℃/s，采集方式:連續(xù)采集，每1 ℃ 5次)1個(gè)循環(huán)；步驟6：結(jié)束。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。引物使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，具體序列見表1，其中β-actin為內(nèi)參基因，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)引物

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)使用2-△△Ct法(Livak法[6])進(jìn)行分析計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平數(shù)值；使用Excel、OriginPro 8軟件完成相關(guān)制表、制圖等；使用SPSS 21軟件分析數(shù)據(jù)顯著性差異，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié) 果

本試驗(yàn)中，對(duì)照組蟹在注射生理鹽水后無(wú)異常反應(yīng)，活力正常；試驗(yàn)組蟹在嗜水氣單胞菌(菌液密度約2.8×108cfu/mL)注射感染后，活力明顯下降，但未出現(xiàn)死亡，并在24 h后活動(dòng)能力有逐步恢復(fù)的趨勢(shì)。

2.1 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹鰓、肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 對(duì)鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)嗜水氣單胞菌免疫刺激前后中華絨螯蟹鰓絲厚度進(jìn)行測(cè)量發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中華絨螯蟹鰓絲厚度無(wú)顯著差異變化(P>0.05)，試驗(yàn)組中鰓絲厚度在3 h時(shí)極顯著降低(P<0.01)，在6～72 h時(shí)鰓絲厚度有不同程度的增厚(表2)。進(jìn)一步通過(guò)鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(圖1a)和感染組0 h(圖1b)相比，中華絨螯蟹在感染嗜水氣單胞菌3 h后鰓絲腔中上皮細(xì)胞形成的腔隔膜結(jié)構(gòu)被破壞，致鰓絲厚度急劇減小，且鰓絲末端有血細(xì)胞積聚，但角質(zhì)層及基膜結(jié)構(gòu)完整(圖1c)；6、12 h時(shí)角質(zhì)層顯著增厚(P<0.05)，并有波狀突起，部分角質(zhì)層與基膜分離，且鰓絲腔增大，鰓絲末端破裂，相比近鰓軸處，鰓絲中后段血細(xì)胞數(shù)量較少(圖1d～e)；24 h時(shí)鰓絲厚度達(dá)最大，血細(xì)胞數(shù)量異常增多，角質(zhì)層增厚且波狀突起多與基膜脫離并呈碎裂狀，鰓絲末端結(jié)構(gòu)破壞加劇(圖1f)；48 h時(shí)鰓絲厚度相比24 h時(shí)有減小，且鰓絲近末端結(jié)構(gòu)損傷處出現(xiàn)血細(xì)胞積聚現(xiàn)象(圖1g)；72 h時(shí)觀察到鰓絲不同區(qū)段有血細(xì)胞積聚現(xiàn)象(圖1h)。試驗(yàn)結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹鰓組織結(jié)構(gòu)造成了顯著影響。

圖1 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

表2 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹鰓絲厚度的影響 μm

2.1.2 對(duì)肝胰腺組織的影響

對(duì)中華絨鰲蟹肝胰腺中肝小管進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算肝小管中管腔面積占肝小管橫截面面積的百分比(后簡(jiǎn)稱肝小管管腔面積比，φ)。結(jié)果顯示，在注射生理鹽水和嗜水氣單胞菌后，均會(huì)使肝小管管腔面積比均值增大，即使肝小管管腔面積增大，但對(duì)照組在6 h后面積比均值恢復(fù)至近0 h水平，試驗(yàn)組則在6 h時(shí)面積比均值有最大值，隨后呈下降趨勢(shì)，但與0 h面積比均值相比仍較大。且對(duì)照組和試驗(yàn)組在3 h時(shí)肝小管管腔面積比均值之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；6 h時(shí)面積比均值均有較高水平，且標(biāo)準(zhǔn)差較小；12 h時(shí)面積比均值較6 h時(shí)減小，且標(biāo)準(zhǔn)差值較大；24、48 h時(shí)面積比均值進(jìn)一步減小，但標(biāo)準(zhǔn)差值仍較大；72 h時(shí)對(duì)照組肝小管面積比均值異常增大(表3)。

表3 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹肝小管管腔面積比的影響 %

通過(guò)對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺組織切片結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組0 h(圖2a)和試驗(yàn)組0 h(圖2b)肝小管結(jié)構(gòu)清晰，基膜完整，細(xì)胞核整齊排列于近基膜側(cè)，主要為纖維細(xì)胞與吸收細(xì)胞。嗜水氣單胞菌免疫刺激3 h時(shí)，肝小管部分細(xì)胞水腫，吸收細(xì)胞結(jié)構(gòu)有變形，分泌細(xì)胞及胚細(xì)胞增生(圖2c)；6 h時(shí)肝小管大部分細(xì)胞水腫，細(xì)胞排列紊亂，部分核固縮壞死，肝小管中，基膜與吸收細(xì)胞連接處碎裂、分離(圖2d)；12 h時(shí)肝小管上皮增生，細(xì)胞排列層次增多，核大小不一，部分細(xì)胞水腫變形(圖2e)；24 h時(shí)肝小管中細(xì)胞發(fā)生水樣變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊、排列紊亂，血細(xì)胞數(shù)量增多，出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)，但基膜結(jié)構(gòu)仍完整(圖2f)；48 h時(shí)肝小管中細(xì)胞核分布靠近基膜側(cè)，纖維細(xì)胞數(shù)量增多，吸收細(xì)胞與分泌細(xì)胞錯(cuò)落分布，空泡狀結(jié)構(gòu)減少(圖2g)；72 h時(shí)肝小管中，基膜明顯增厚，分泌細(xì)胞位于近基膜處，吸收細(xì)胞結(jié)構(gòu)為清晰柱狀且數(shù)量較多，偶見空泡狀結(jié)構(gòu)(圖2h)。結(jié)果表明，注射生理鹽水和嗜水氣單胞菌均可能引起中華絨螯蟹的免疫反應(yīng)，但生理鹽水無(wú)明顯毒性作用，而嗜水氣單胞菌免疫刺激會(huì)對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺組織造成顯著影響。

圖2 嗜水氣單胞菌免疫刺激條件下中華絨螯蟹肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

2.2 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹血淋巴中免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

2.2.1 對(duì)免疫模式識(shí)別相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中脂多糖和β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)mRNA的相對(duì)表達(dá)量在3、6 h略有上調(diào)，12 h下調(diào)，且為最小值，24、48 h時(shí)與0 h相近，72 h上調(diào)；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中LGBP基因在6 h下調(diào)表達(dá)，在12 h時(shí)表達(dá)上調(diào)，24、48、72 h與0 h的相對(duì)表達(dá)量相近；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在6、72 h有顯著低表達(dá)(P<0.05)，在12 h有極顯著高表達(dá)(P<0.01)(圖3)。

圖3 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫LGBP基因表達(dá)的影響

2.2.2 免疫信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中免疫信號(hào)傳導(dǎo)Toll通路重要組件Tube基因的相對(duì)表達(dá)量水平在72 h內(nèi)差異不大；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中Tube基因在3、6 h逐級(jí)下調(diào)表達(dá)，在12、24、72 h上調(diào)表達(dá)，且在12 h有最大值；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組在3、6 h有顯著低表達(dá)(P<0.05)，在12 h有顯著高表達(dá)(P<0.05)(圖4)。

圖4 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫Tube基因表達(dá)的影響

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中免疫信號(hào)傳導(dǎo)Toll通路重要組件Dorsal基因在6、72 h有上調(diào)表達(dá)，3、12、24、48 h相對(duì)表達(dá)量與0 h相近；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中Dorsal基因在3 h上調(diào)表達(dá)，隨后呈逐漸下調(diào)趨勢(shì)；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組Dorsal基因在3 h有顯著高表達(dá)(P<0.05)，在24、72 h有顯著低表達(dá)(P<0.05)(圖5)。

圖5 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫Dorsal基因表達(dá)的影響

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中整合素(Integrin)基因在3 h有下調(diào)，72 h上調(diào)，相對(duì)表達(dá)量在72 h內(nèi)差異不大；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中Integrin基因在3、6、12 h均上調(diào)表達(dá)，24、72 h均下調(diào)表達(dá)；相比對(duì)照組，試驗(yàn)組Integrin基因在3、6 h顯著高表達(dá)(P<0.05)，在12 h有極顯著高表達(dá)(P<0.01)，在24、72 h時(shí)有顯著低表達(dá)(P<0.05)(圖6)。

圖6 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫Integrin基因表達(dá)的影響

2.2.3 免疫效應(yīng)相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中酚氧化酶原激活酶(PPAF)基因在3 h上調(diào)表達(dá)，在6 h時(shí)下調(diào)表達(dá)，12、24、48 h時(shí)有下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，12 h與0 h無(wú)明顯差異，72 h時(shí)上調(diào)表達(dá)；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中PPAF基因在感染嗜水氣單胞菌72 h的相對(duì)表達(dá)量均明顯下調(diào)，在12 h有最小值；相比對(duì)照組，3、24 h有顯著低值(P<0.05)，12、72 h有極顯著低值(P<0.01)(圖7)。

圖7 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫PPAF基因表達(dá)的影響

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中細(xì)胞黏附蛋白(PXN)基因在3、6、12 h逐級(jí)下調(diào)表達(dá)，6 h有最小值，24、72 h上調(diào)表達(dá)，48 h下調(diào)表達(dá)，有最低值，72 h有最高值；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中PXN基因在12 h內(nèi)逐級(jí)下調(diào)表達(dá)，12 h有最低值，24、48 h和72 h相對(duì)表達(dá)量有升高，但較0 h仍為下調(diào)表達(dá)；與對(duì)照組比較，6、72 h有顯著(P<0.01)低值，12 h有極顯著低值(P<0.01)(圖8)。

圖8 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫PXN基因表達(dá)的影響

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)基因在3 h上調(diào)表達(dá)，隨后下調(diào)，48 h內(nèi)與0 h時(shí)差異不大，72 h上調(diào)表達(dá)；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中GST基因在12 h內(nèi)逐級(jí)下調(diào)，12 h有最低值，24 h上調(diào)表達(dá)，48、72 h相對(duì)表達(dá)量與0 h相近；相比對(duì)照組，3、6、12 h和72 h均有顯著低值(P<0.05)(圖9)。

圖9 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫GST基因表達(dá)的影響

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)基因在3 h下調(diào)，隨后上調(diào)，趨于0 h水平，72 h上調(diào)；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中GPx基因在24 h內(nèi)均下調(diào)表達(dá)，48 h上調(diào)表達(dá)，72 h下調(diào)表達(dá)，6 h有最低值；相比對(duì)照組，6、24、72 h時(shí)有顯著低值(P<0.05)，48 h時(shí)有顯著高值(P<0.05)(圖10)。

圖10 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫GPx基因表達(dá)的影響

對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴中超氧化物歧化酶(SOD)基因僅在24 h時(shí)下調(diào)表達(dá)，其余時(shí)段無(wú)顯著差異；試驗(yàn)組中華絨螯蟹血淋巴中SOD基因在3 h上調(diào)，6、24 h下調(diào)，其余時(shí)段與0 h無(wú)顯著差異；相比對(duì)照組，6 h有顯著低值(P<0.05)(圖11)。

圖11 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹免疫SOD基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 嗜水氣單胞菌

嗜水氣單胞菌屬弧菌科、氣單胞菌屬，是嗜溫、有動(dòng)力的氣單胞菌群，廣泛存在于淡水、污水及土壤中，是水生動(dòng)物尤其魚類最常見的致病菌[2]。嗜水氣單胞菌已在淡海水魚類[7]、淡水蝦類[8-9]、淡水蟹類[10]和蛙類[11-12]體內(nèi)分離到。嗜水氣單胞菌感染后，不同對(duì)象表現(xiàn)出不同的臨床癥狀而有不同名稱，如蛙類[12]和大口黑鱸(Micropterussalmoides)[13]的“紅通病”，鯽魚(Carassiusauratus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)[14]的“暴發(fā)病”，胡子鲇(Clariasgariepinus)[15]和白斑狗魚(Esoxlucius)[16]的“紅嘴病”、“壞死病”等。在蝦蟹類中，有日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)[8]的“紅鰓病”，中華絨螯蟹[10]的“腹水病”、“抖抖病”等。姜艷麗等[2]研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌能產(chǎn)生多種外毒素(如氣溶素、溶血素、細(xì)胞毒素和腸毒素等)、胞外蛋白酶和黏附因子等毒力因子，使蝦蟹類血淋巴失去功能或?qū)е缕渌M織器官被侵染，發(fā)生病變，最終喪失功能，引發(fā)死亡。所以，在本試驗(yàn)中選取嗜水氣單胞菌作為病原，分析其對(duì)中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)的影響。

3.2 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹鰓、肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響

鰓組織作為中華絨螯蟹重要的呼吸器官，是抵御水環(huán)境中病害侵蝕的第一道屏障，同時(shí)還承擔(dān)調(diào)節(jié)滲透壓和調(diào)節(jié)離子平衡等重要作用[17]。據(jù)顧志峰等[18-19]報(bào)道，中華絨鰲蟹鰓組織結(jié)構(gòu)中鰓腔內(nèi)的膨大細(xì)胞是由上皮細(xì)胞向鰓腔內(nèi)分裂形成突起，生長(zhǎng)膨大而成，且每個(gè)上皮細(xì)胞處于不斷的生長(zhǎng)和分裂狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌免疫刺激后，試驗(yàn)組中華絨螯蟹行動(dòng)力明顯減弱，同時(shí)鰓組織結(jié)構(gòu)有明顯的病理變化，具體表現(xiàn)為鰓絲中上皮細(xì)胞破壞崩解、鰓絲先銳減后增厚、鰓腔增大、鰓絲中血細(xì)胞數(shù)量先減后增及鰓絲末端結(jié)構(gòu)逐漸破壞解體和血細(xì)胞積聚現(xiàn)象等。感染初期鰓絲厚度減小，可能是因?yàn)槭人畾鈫伟S血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入鰓組織后，破壞了由上皮細(xì)胞形成的鰓腔隔，導(dǎo)致鰓絲失去支撐而厚度減?。欢篥w腔中血細(xì)胞數(shù)量減少，可能是受嗜水氣單胞菌分泌的溶血素等毒力因子影響而引起的敗血癥狀；但在感染后期，由于機(jī)體大量合成血細(xì)胞，在清除病原菌的同時(shí)也在鰓絲末端積聚，從而起到一定的損傷修復(fù)。

甲殼動(dòng)物的肝胰腺承擔(dān)肝臟和胰臟的雙重功能，對(duì)外界影響因素極為敏感[17]。中華絨螯蟹肝胰腺作為重要的免疫器官，其組織結(jié)構(gòu)的變化在一定程度上也可反映出機(jī)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性改變[21]。張瑤等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，致病菌檸檬酸桿菌(Citrobacter)感染中華絨螯蟹后會(huì)引起其敗血癥，造成其肝胰腺對(duì)物質(zhì)合成、消化吸收及能量代謝功能的紊亂或喪失，進(jìn)而破壞整個(gè)機(jī)體的新陳代謝作用，同時(shí)會(huì)使鰓組織大面積腫脹、壞死，致病蟹呼吸困難甚至窒息，最終導(dǎo)致病蟹死亡。洪美玲等[22]研究指出，氨氮脅迫15 d后，中華絨螯蟹肝胰腺組織中分泌細(xì)胞數(shù)量均減少，轉(zhuǎn)運(yùn)泡體積明顯增大，細(xì)胞核增大且數(shù)量增多；在高含量試驗(yàn)組中，部分肝小管的基膜破裂、細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，少量細(xì)胞核解體。在本試驗(yàn)中，觀察到試驗(yàn)組肝胰腺肝小管管腔面積比相比對(duì)照組有明顯增大，但感染期間基膜基本結(jié)構(gòu)完整，結(jié)構(gòu)和數(shù)量具有明顯變化的主要是分泌細(xì)胞和吸收細(xì)胞，也出現(xiàn)細(xì)胞水腫、排列紊亂及變形水解等現(xiàn)象。該現(xiàn)象與洪美玲等[22-23]研究結(jié)果類似，說(shuō)明嗜水氣單胞菌免疫刺激與氨氮、重金屬脅迫對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響可能存在一定的共性。

以上結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨鰲蟹產(chǎn)生了明顯的毒性作用，且對(duì)其鰓組織、血淋巴組織及肝胰腺組織均造成了一定的損傷，同時(shí)機(jī)體對(duì)病原菌也可能存在一定的免疫調(diào)節(jié)能力。

3.3 嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹血淋巴中免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響

中華絨螯蟹為典型的無(wú)脊椎甲殼類動(dòng)物，其免疫主要依靠先天性免疫系統(tǒng)[24]。先天免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫，它們?cè)诿庖叽碳は卤患せ?。其中甲殼?dòng)物細(xì)胞免疫主要是由血細(xì)胞來(lái)承擔(dān)的，主要包括吞噬作用、節(jié)結(jié)形成和包裹作用等；體液免疫主要是機(jī)體在外源刺激和誘導(dǎo)下合成和分泌的一些免疫因子，如抗菌肽，具有殺菌活性和免疫相關(guān)酶活性的凝集素、溶菌酶、酚氧化酶酶原和酚氧化酶、超氧化物歧化酶等[25]。

3.3.1 對(duì)免疫模式識(shí)別相關(guān)基因LGBP表達(dá)的影響

和其他無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，中華絨螯蟹的免疫反應(yīng)主要由一些模式識(shí)別蛋白發(fā)起[26]。在節(jié)肢動(dòng)物中，主要的模式識(shí)別蛋白包括β-葡聚糖結(jié)合或識(shí)別蛋白(βGBP)、脂多糖結(jié)合或識(shí)別蛋白(LBP)、肽聚糖結(jié)合或識(shí)別蛋白(PGRP)和脂多糖及β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)。其中LGBP已經(jīng)在中華絨螯蟹中被克隆出全長(zhǎng)，并指出其在防御細(xì)菌侵染方面起非常重要的作用[25]。本試驗(yàn)中也分析了中華絨螯蟹血淋巴中免疫模式識(shí)別蛋白相關(guān)基因LGBP在嗜水氣單胞菌免疫刺激后的相對(duì)表達(dá)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在菌液注射感染6 h時(shí)檢測(cè)到LGBP基因顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)，在12 h時(shí)有極顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.01)，隨后趨于0 h水平。說(shuō)明在嗜水氣單胞菌免疫刺激后，LGBP基因參與了中華絨螯蟹清除病原菌的免疫反應(yīng)。與Zhao等[27]研究結(jié)果對(duì)比，LGBP基因的極顯著上調(diào)應(yīng)答時(shí)間是在細(xì)菌感染1.5 h，應(yīng)答時(shí)間較本試驗(yàn)結(jié)果明顯提前，但本試驗(yàn)中12 h時(shí)LGBP的相對(duì)表達(dá)量水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.5 h時(shí)檢測(cè)水平。推測(cè)中華絨螯蟹機(jī)體在清除病原菌時(shí)可能存在多次免疫反應(yīng)過(guò)程。

3.3.2 對(duì)免疫信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因Tube、Dorsal和Integrin表達(dá)的影響

Toll信號(hào)通路是無(wú)脊椎動(dòng)物中主要的先天免疫信號(hào)通路之一，而Tube、Dorsal基因均為Toll信號(hào)通路中的重要組件，在先天免疫系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，且均已在中華絨螯蟹中克隆出cDNA全長(zhǎng)[28-29]。本試驗(yàn)中，檢測(cè)到Tube基因表達(dá)量在3、6 h顯著下調(diào)(P<0.05)，12 h顯著上調(diào)(P<0.05)；Dorsal基因表達(dá)量在3 h有顯著上調(diào)(P<0.05)，隨后下調(diào)。說(shuō)明Tube、Dorsal基因能被嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)表達(dá)，且可能存在一定的應(yīng)答次序。

整合素(Integrin)是一種介導(dǎo)細(xì)胞和其外環(huán)境之間的連接的跨膜受體，在細(xì)胞遷移、分化和存活中起關(guān)鍵作用。Huang等[30]在中華絨螯蟹中克隆出β亞型整合素，并提出作為細(xì)胞受體，中華絨螯蟹整合素蛋白能結(jié)合多種細(xì)菌，對(duì)抗菌免疫具有重要作用；且在被脂多糖、肽聚糖、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)或副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)脅迫時(shí)，Integrin基因表達(dá)量會(huì)顯著上調(diào)[30]。本試驗(yàn)中也觀察到，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中Integrin基因在3、6、12 h時(shí)均表現(xiàn)為顯著(P<0.05)或極顯著上調(diào)(P<0.01)，說(shuō)明Integrin基因在中華絨螯蟹先天免疫反應(yīng)中擁有重要功能。

3.3.3 對(duì)免疫效應(yīng)相關(guān)基因PPAF、PXN、GST、GPx和SOD的表達(dá)影響

酚氧化酶原激活酶(PPAF)為一類催化酚氧化酶酶原成為酚氧化酶的酶類，是酚氧化酶原系統(tǒng)中的重要組成成員，可通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終激活酚氧化酶系統(tǒng)[31]。研究表明，在嗜水氣單胞菌免疫刺激后，血細(xì)胞中PPAF基因會(huì)立刻啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄相應(yīng)mRNA，合成蛋白行使功能[25]。本試驗(yàn)中，對(duì)照組PPAF基因在3 h上調(diào)表達(dá)，隨后下調(diào)表達(dá)，趨于0 h水平；而試驗(yàn)組PPAF基因則在受菌免疫刺激后，處于持續(xù)下調(diào)表達(dá)，在12 h達(dá)最小值；且與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中PPAF基因的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)合鰓組織切片結(jié)果分析，在菌免疫刺激后，鰓腔中血細(xì)胞數(shù)量有先降后升的趨勢(shì)，12 h時(shí)鰓腔中血細(xì)胞數(shù)量最少，且由于PPAF基因在肝胰腺組織表達(dá)最高，在血細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較少[25]，由此推測(cè)，嗜水氣單胞菌免疫刺激后，中華絨螯蟹血細(xì)胞數(shù)量的減少和PPAF主要在肝胰腺中表達(dá)的特點(diǎn)可能是導(dǎo)致該基因持續(xù)下調(diào)表達(dá)的原因。

細(xì)胞黏附蛋白(PXN)是甲殼動(dòng)物中最早鑒定出的細(xì)胞黏附分子[32]，和人的髓過(guò)氧化物酶具有類似的結(jié)構(gòu)，是一類具有細(xì)胞黏附特性和過(guò)氧化物酶活性的免疫分子，能與整合素結(jié)合，并與胞外的超氧化物歧化酶協(xié)同作用發(fā)揮免疫效應(yīng)，同時(shí)也與酚氧化酶原系統(tǒng)的激活有關(guān)，參與多種病原體的清除過(guò)程[33]。本試驗(yàn)中檢測(cè)到PXN基因在菌免疫刺激后表達(dá)量降低，且在12 h有最低值，原因可能與PPAF表達(dá)量持續(xù)降低類似。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)基因均為中華絨螯蟹抗氧化系統(tǒng)中的主要抗氧化酶類基因[34-36]。在甲殼動(dòng)物血細(xì)胞吞噬作用過(guò)程中，會(huì)導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，這些活性氧能有效殺死外源入侵者，但過(guò)多積累也會(huì)導(dǎo)致自身細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。而谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶通過(guò)與還原型谷胱甘肽的巰基(-SH)結(jié)合，催化氧化應(yīng)激產(chǎn)生的各種毒性代謝物等，使這些親電性的疏水化合物變成親水性的物質(zhì)，可減少其毒性，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)量活性氧的損傷[34]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶可以消除機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫及脂質(zhì)過(guò)氧化物，阻斷活性氧自由基對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷，是生物體內(nèi)重要的活性氧自由基清除劑。它與體內(nèi)的超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶一起構(gòu)成了機(jī)體的抗氧化防御體系。超氧化物歧化酶是一種能夠催化超氧化物通過(guò)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫的酶，廣泛存在于各類動(dòng)物、植物和微生物中，是一種重要的抗氧化劑[36]。目前，β型GST、不含硒型GPx和錳型SOD基因均在中華絨螯蟹中得到克隆，且被證實(shí)在應(yīng)對(duì)菌免疫刺激均有免疫應(yīng)答反應(yīng)[25,34,37-38]。本試驗(yàn)中，嗜水氣單胞菌免疫刺激后，GST、GPx和SOD基因在不同時(shí)段有一定的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明對(duì)菌免疫刺激均有應(yīng)答。其中GST、GPx基因表達(dá)量在12 h均呈下調(diào)；而SOD基因表達(dá)量在3 h上調(diào)，在6 h顯著下調(diào)(P<0.05)。推測(cè)各基因之間可能存在一定的應(yīng)答次序。

上述結(jié)果表明，在嗜水氣單胞菌免疫刺激下，中華絨螯蟹血淋巴組織中各免疫相關(guān)基因均有一定的應(yīng)答反應(yīng)，且各基因之間可能存在一定的應(yīng)答次序或級(jí)聯(lián)關(guān)系。

綜上，嗜水氣單胞菌免疫刺激對(duì)中華絨螯蟹有明顯的毒性作用，可對(duì)其鰓、肝胰腺組織正常結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞作用，也會(huì)顯著影響其血淋巴組織中各免疫相關(guān)基因的表達(dá)；同時(shí)在一定程度上，機(jī)體對(duì)病原菌也有一定的免疫調(diào)節(jié)能力及自我修復(fù)能力。