劉正洋,王若斐,喬策策,張楠,沈宗專,李榮,沈其榮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省有機(jī)固體廢棄物協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部資源節(jié)約型肥料工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京210095)

土壤微生物在土壤生產(chǎn)力形成的生物進(jìn)程中起著關(guān)鍵性作用[1],是土壤生態(tài)系統(tǒng)功能持續(xù)發(fā)揮的重要媒介[2]。在土壤微生態(tài)系統(tǒng)中,微生物的活躍程度反映土壤肥力的狀況[3]。因此,通過土壤微生物區(qū)系調(diào)控,提高土壤生產(chǎn)力成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。研究證實(shí)土壤中施入不同的肥料可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[4]。相比于化肥,長期連續(xù)施用有機(jī)肥和生物有機(jī)肥能增加土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能多樣性[5],提高土壤促生和抑制土傳病害的能力[6]。目前,關(guān)于生物有機(jī)肥的研究主要集中在芽胞桿菌生物有機(jī)肥上[7],對于其他微生物有機(jī)肥尤其是真菌類生物有機(jī)肥對土壤微生物區(qū)系調(diào)控的研究還不夠深入。

木霉是土壤中重要的促生真菌,能通過礦化有機(jī)物等多種機(jī)制促進(jìn)作物的生長和發(fā)育[8-9],通過產(chǎn)生如抗菌肽類等抗生素類物質(zhì)抑制病原菌生長,防控植物土傳病害[10]。研究表明,木霉通過增加植株中生長素(IAA)的產(chǎn)生量增強(qiáng)植物對鹽脅迫的耐受性[11],通過有效控制玉米莖腐病的發(fā)生顯著提高玉米產(chǎn)量[12]。同時(shí),有研究利用盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),木霉生物有機(jī)肥能通過改變土壤理化狀況和根際微生物群落組成提高作物產(chǎn)量[13]。然而,田間木霉生物有機(jī)肥是如何通過改變土壤理化性質(zhì)和微生物區(qū)系,從而增強(qiáng)作物產(chǎn)量的微生物生態(tài)學(xué)機(jī)制研究仍然不夠。

本研究在白菜-甘藍(lán)輪作體系下,通過連續(xù)兩季生物有機(jī)肥的施用,評估用貴州木霉NJAU4742研制的生物有機(jī)肥對輪作體系作物產(chǎn)量和土壤理化性狀的影響,并進(jìn)一步通過比較生物有機(jī)肥和普通有機(jī)肥對土壤微生物區(qū)系的影響,探究木霉生物有機(jī)肥提高作物產(chǎn)量的土壤微生物生態(tài)學(xué)機(jī)制,以期為設(shè)施蔬菜高產(chǎn)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

作物分別為白菜‘改良青雜3號’和甘藍(lán)‘H60’。豬糞有機(jī)肥由江蘇峻德生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供,有機(jī)質(zhì)含量457.1 g·kg-1,全氮含量14.8 g·kg-1,全磷含量25.2 g·kg-1,全鉀含量20.1 g·kg-1。生物有機(jī)肥則為有機(jī)肥中添加5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))固體木霉菌種(TrichodermaguizhouenseNJAU4742,功能菌數(shù)量≥1.0×109CFU·g-1)。供試菌株為貴州木霉NJAU4742[14],由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)點(diǎn)位于江蘇省南京市蔬菜科學(xué)研究所科技園(31°43′N,118°46′E),年平均氣溫15.4 ℃,平均降雨量為1 106 mm。供試土壤為黃壤土,pH 7.13,有機(jī)質(zhì)含量22.65 g·kg-1,全氮含量4.05 g·kg-1,全磷含量3.58 g·kg-1,全鉀含量3.26 g·kg-1,速效磷含量280.3 mg·kg-1,速效鉀含量251 mg·kg-1。田間試驗(yàn)于2015年9月至2016年6月,在白菜-甘藍(lán)輪作體系下連續(xù)種植2季。設(shè)置施有機(jī)肥(OF)和木霉生物有機(jī)肥(BIO)處理。每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)重復(fù),每個(gè)小區(qū)面積為5.4 m2(2.7 m×2 m),小區(qū)間隔0.6 m。每季大田OF和BIO處理按照等養(yǎng)分施肥,全氮(TN)含量為222 kg·hm-2,全磷(P2O5)含量為150 kg·hm-2,全鉀(K2O)含量為180 kg·hm-2,有機(jī)肥施用量為6 000 kg·hm-2,其余養(yǎng)分用尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀按總養(yǎng)分補(bǔ)齊;肥料分2次施用,種苗前施入總養(yǎng)分的2/3作為基肥(包括有機(jī)肥或生物有機(jī)肥及相應(yīng)養(yǎng)分的化肥),剩余的1/3養(yǎng)分于初果期追肥施用。

1.3 土壤樣品采集

于每季白菜和甘藍(lán)收獲期,在各小區(qū)分別采集8棵長勢健康的白菜和甘藍(lán),連根帶土挖出,裝入無菌自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室,用手輕抖根系,將抖下來的土壤定義為土體土壤。土體土壤一部分自然風(fēng)干后過篩用于理化性質(zhì)的測定,另一部分-80 ℃保存待用。

1.4 測定方法

1.4.1 土壤理化測定參照文獻(xiàn)[15],分別采用玻璃電極酸度計(jì)和電導(dǎo)儀測定土壤pH和EC值;采用醋酸銨浸提-火焰光度計(jì)法測定土壤速效鉀含量;采用碳酸氫鈉浸提-鉬藍(lán)比色法測定土壤速效磷含量;采用氯化鈣浸提-流動分析儀法測定土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量。

1.4.2 土壤DNA的提取稱取0.25 g土壤樣品,根據(jù)DNA提取試劑盒(Mo Bio Laboratories,USA)操作說明提取土壤DNA。以核酸定量儀(NanoDrop 2000,USA)測定土壤DNA濃度,稀釋至20 ng·μL-1待測序。

1.4.3 PCR反應(yīng)和MiSeq高通量測序參照Li等[16]的方法,細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增引物為 520F(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和 802R(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′),真菌ITS的擴(kuò)增引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和 ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系25 μL:滅菌超純水9.0 μL,反應(yīng)緩沖液(5×)5.0 μL,PCR增強(qiáng)添加劑(GC high enhancer)(5×)5.0 μL,dNTP(2.5 mmol·L-1)2.0 μL,模板DNA 2.0 μL,引物F(10 μmol·L-1)1.0 μL,引物R(10 μmol·L-1)1.0 μL,TaKaRa聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL。PCR擴(kuò)增、文庫準(zhǔn)備及上機(jī)測序程序均委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4.4 MiSeq測序的序列處理與分析利用Mothur Version 1.25.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,流程為:1)對每個(gè)樣品的正、反向序列進(jìn)行拼接,并分配樣品名稱;2)去除q值大于0.5的序列、長度小于200 bp的序列、重復(fù)序列、單序列等劣質(zhì)序列;3)生成操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU),選取的閾值水平為97%;4)去除嵌合體;5)生成OTU表格,得到OTU的代表序列和Read數(shù);6)將16S rDNA基因和ITS序列的每個(gè)OTU對應(yīng)的序列通過RDP數(shù)據(jù)庫比對,確定每個(gè)OTU的分類地位,細(xì)菌選用數(shù)據(jù)庫為RDP 16S rDNA Gene Database,真菌選用數(shù)據(jù)庫為UNITE Fungal ITS Trainset。

將OTU表格轉(zhuǎn)換成Mothur軟件能夠識別的Shared格式文件,對樣品均一化處理后,計(jì)算測序樣品各處理的α多樣性,比較樣品之間的豐富度(Chao指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù))差異。利用Mothur軟件對所有樣品在OTU水平下基于Bray-curtis距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis,PCoA)。利用R version 3.5.1軟件對測序樣品進(jìn)行方差分解分析(variance partitioning analysis,VPA),研究驅(qū)動群落變化的因子。利用冗余分析(redundancy analysis,RDA)探究不同處理、環(huán)境因子與微生物群落組成之間的關(guān)系。利用線性判別分析效應(yīng)大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe),分析不同處理屬水平下相對豐度具有顯著性差異的微生物。利用皮爾遜(Pearson)相關(guān)分析找出與產(chǎn)量顯著相關(guān)的屬。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2010 和SPSS 20.0軟件。數(shù)據(jù)間的多重比較選取單因素方差分析(One-way ANOVA),用R version 3.5.1軟件進(jìn)行微生物群落多樣性分析,顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對白菜-甘藍(lán)輪作體系產(chǎn)量的影響

由表1可知:第1季(白菜季)BIO處理相比OF處理白菜產(chǎn)量雖無顯著性差異,但增產(chǎn)4 725 kg·hm-2,增幅達(dá)4.25%。第2季(甘藍(lán)季)BIO與OF處理產(chǎn)量差異顯著,相比OF處理,BIO處理甘藍(lán)產(chǎn)量增加9 830 kg·hm-2,增幅達(dá)8.85%。

表1 不同施肥處理白菜和甘藍(lán)的產(chǎn)量Table 1 The Chinese cabbage and cabbage yields of different fertilization treatments

2.2 不同施肥處理對白菜-甘藍(lán)輪作體系土壤理化性質(zhì)的影響

由表2可知:第1季BIO處理相比OF顯著提高土壤EC值和速效鉀含量,顯著降低土壤硝態(tài)氮含量。第2季BIO處理相比OF顯著增加速效鉀和硝態(tài)氮含量,顯著降低pH值。在2季中,BIO處理相比OF處理提高土壤EC值、速效鉀和速效磷含量,降低pH值。

表2 不同施肥處理的土壤理化性質(zhì)Table 2 Soil properties of different fertilization treatments

2.3 不同施肥處理對土壤微生物群落α多樣性的影響

由表3可知:在施肥處理方面,除第2季中細(xì)菌群落的Chao指數(shù)外,BIO處理微生物群落的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均大于OF處理,但各處理間無顯著性差異;在種植季方面,BIO處理第2季細(xì)菌的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均大于第1季,第2季真菌的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均小于第1季,OF與BIO處理有相同趨勢。

表3 不同施肥處理細(xì)菌和真菌的Chao和Shannon指數(shù)Table 3 Bacteria and fungi Chao and Shannon indexes of different fertilization treatments

2.4 不同施肥處理對土壤微生物群落β多樣性的影響

由圖1可知:PCoA1和PCoA2分別解釋細(xì)菌群落變化的30.02%和18.56%,真菌群落變化的27.09%和17.99%,其中細(xì)菌群落第1季與第2季沿PCoA1區(qū)分,BIO和OF處理沿PCoA2區(qū)分。真菌群落第1季與第2季沿PCoA1區(qū)分,BIO和OF處理沿PCoA2區(qū)分。

2.5 不同施肥處理土壤微生物群落方差分解分析

方差分解分析(VPA)結(jié)果顯示,土壤理化性質(zhì)(速效鉀含量、速效磷含量、硝態(tài)氮含量和銨態(tài)氮含量)、種植季(第1季和第2季)、功能微生物(貴州木霉NJAU4742)及其交互作用分別解釋了總變異的32.98%(細(xì)菌)和35.61%(真菌)(圖2)。解釋度最高的因子是功能微生物,分別占細(xì)菌和真菌總變異的8.41%和5.21%,而細(xì)菌和真菌總變異的7.34%和4.10%歸因于土壤理化性質(zhì)。種植季對細(xì)菌和真菌群落組成的影響較小。未解釋的細(xì)菌和真菌群落分別為67.02%和64.39%。

2.6 不同施肥處理對土壤微生物群落組成的影響

通過線性判別分析的效應(yīng)大小對不同處理屬水平下相對豐度具顯著性差異的微生物分析(圖3)可知:BIO處理的2季土壤中伯克氏菌屬(Burkholderia)和Bhargavaea屬的相對豐度均顯著高于OF處理(圖3-A、C);木霉屬(Trichoderma)和紅酵母屬(Rhodotorula)的相對豐度均顯著高于OF處理(圖3-B、D)。

2.7 微生物相對豐度與產(chǎn)量的關(guān)系

屬水平上,產(chǎn)量與微生物的相關(guān)性如表4所示。BIO處理土體土壤中伯克氏菌屬(Burkholderia)和Bhargavaea屬的相對豐度與產(chǎn)量顯著正相關(guān)(P<0.05);BIO處理土體土壤中木霉屬(Trichoderma)和紅酵母屬(Rhodotorula)的相對豐度與產(chǎn)量顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表4 產(chǎn)量與微生物的相關(guān)性Table 4 Correlations between yield and microbial community

2.8 不同施肥處理土壤微生物群落冗余分析

細(xì)菌群落冗余分析(圖4)結(jié)果顯示:RDA1和RDA2共解釋了81.42%的細(xì)菌群落變化;真菌群落的RDA1和RDA2解釋的比例為93.62%。RDA1將OF和BIO處理微生物群落明顯分開,RDA2將各處理第1季和第2季微生物群落明顯分開。BIO處理第1季細(xì)菌和真菌群落均與產(chǎn)量、功能微生物、EC、速效鉀含量和速效磷含量呈正相關(guān);第2季都與產(chǎn)量、功能微生物、EC、速效鉀含量、速效磷含量、銨態(tài)氮含量和硝態(tài)氮含量呈正相關(guān)。BIO處理細(xì)菌群落主要與伯克氏菌屬(Burkholderia)和Bhargavaea屬聚合在一起;BIO處理真菌群落主要與木霉屬(Trichoderma)和紅酵母屬(Rhodotorula)聚合在一起。

3 討論

連續(xù)2季田間試驗(yàn)結(jié)果表明,相比于有機(jī)肥,生物有機(jī)肥有效增加白菜-甘藍(lán)輪作體系產(chǎn)量,推斷是由于生物有機(jī)肥中含有大量的功能菌——貴州木霉NJAU4742(TrichodermaguizhouenseNJAU4742)[17]。已有研究報(bào)道貴州木霉NJAU4742能產(chǎn)生多種促進(jìn)作物生長的活性物質(zhì)[18]。Cai等[19]利用盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用貴州木霉NJAU4742研制的生物有機(jī)肥能有效促進(jìn)番茄生長。哈茨木霉能在作物根際定殖并顯著增加根系表面積,在養(yǎng)分脅迫的條件下,提高作物對土壤中磷和其他養(yǎng)分的吸收能力,促進(jìn)作物生長[20]。本研究利用田間試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)木霉生物有機(jī)肥的田間增產(chǎn)效果。同時(shí),還發(fā)現(xiàn)木霉生物有機(jī)肥能夠提高土壤中速效養(yǎng)分的含量,木霉能促進(jìn)番茄產(chǎn)生大量的根系分泌物,增加根際微生物的種群和活性,釋放土壤中緩效氮和磷養(yǎng)分,促進(jìn)番茄生長[21]。高通量測序已經(jīng)成為研究微生物群落的主要方法之一[22]。本研究應(yīng)用MiSeq測序技術(shù)對白菜-甘藍(lán)輪作體系不同施肥處理和種植季土壤細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行分析,結(jié)果表明生物有機(jī)肥能提高微生物群落的多樣性。Qiu等[23]研究發(fā)現(xiàn)施用生物有機(jī)肥能提高土壤中細(xì)菌和真菌群落的多樣性,降低土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量,提高黃瓜產(chǎn)量。Shen等[24]研究發(fā)現(xiàn)施用生物有機(jī)肥能通過提高土壤細(xì)菌群落多樣性的方式防控香蕉枯萎病并提高產(chǎn)量。因此,推測增產(chǎn)效果與微生物群落多樣性的提高有關(guān),這與徐麗霞[25]的研究結(jié)果類似。

基于PCoA分析發(fā)現(xiàn),相對于有機(jī)肥處理,生物有機(jī)肥處理的土壤微生物群落組成差異顯著。已有研究表明施用不同種類的有機(jī)肥能影響土壤微生物群落的組成[26]。Zhao等[27]發(fā)現(xiàn)施肥方式是改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子;Zhang等[28]也報(bào)道生物有機(jī)肥顯著改變黃瓜根際土壤真菌群落組成,與本研究相一致。本研究通過方差分解分析發(fā)現(xiàn)在白菜-甘藍(lán)輪作體系中,功能微生物是改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子。在兩季的種植過程中,伯克氏菌屬(Burkholderia)、Bhargavaea屬、木霉屬(Trichoderma)和紅酵母屬(Rhodotorula)的相對豐度在生物有機(jī)肥處理中顯著高于有機(jī)肥處理,且與產(chǎn)量顯著正相關(guān)。其中,伯克氏菌屬(Burkholderia)具有溶磷作用,從而釋放土壤養(yǎng)分[29],而細(xì)菌Bhargavaea屬對產(chǎn)量的促進(jìn)作用可能與其能夠抵抗鹽分脅迫有關(guān)[30]。有研究表明紅酵母屬(Rhodotorula)真菌能夠保護(hù)甜菜免受絲核菌的侵害[31]。另外,木霉屬微生物具有促生作用[32-33]。因此,木霉生物有機(jī)肥除木霉的促生作用外,推測其激發(fā)的其他土著功能微生物同樣也起到促生作用。因此,連續(xù)施用木霉生物有機(jī)肥能調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成,提高白菜-甘藍(lán)輪作體系產(chǎn)量。