張 偉，周青平，孫萬斌，王 平，陳有軍

(1.西南民族大學青藏高原研究院，四川成都 610041；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅蘭州 730070)

青藏高原素有世界屋脊之稱，是我國重要的生態(tài)屏障，也是全球海拔最高、氣候條件獨特的地理單元[1].隨著社會的發(fā)展，受放牧、氣候等綜合因素的影響，青藏高原高寒草地沙化狀況日趨嚴重，在沙化生境條件下，植物長時間遭受高溫、高寒、高旱、鹽堿等逆境脅迫，迫使植物的光合作用、生理酶活性和滲透調節(jié)物質積累發(fā)生改變，導致光合有效積累物質降低，很容易使植物在短期內(nèi)喪失繁殖潛能，甚至死亡，最終導致草地多樣性的減少[2-4].

葉片是植物形態(tài)結構的重要組成部分，從自然界獲取能量的組織結構，其形態(tài)對環(huán)境的響應特征直接影響著植物的物質和能量交換[5-6]，葉片對環(huán)境變化也有極強的敏感性[7-8]，長期以來，植物生理學家和植物生態(tài)學研究人員對逆境條件下植物葉片的適應性研究保持著高度的關注[9-10]，我國的一些研究者從葉片的生理性狀特征等角度對葉片形態(tài)變化及其適應特征做了很多研究，發(fā)現(xiàn)植物葉片適應性的形成是環(huán)境長期作用的結果，保證了植物自身完成生活史周期，也是適應環(huán)境的重要生理生態(tài)特性[11-16].植物通過調整葉片的光合特征、抗氧化酶保護系統(tǒng)的啟動、滲透調節(jié)劑的積累等途徑來影響自身的生長動態(tài)，重新構建代謝平衡[17-18].

受到高溫逆境條件的影響，葉片的光合系統(tǒng)、細胞膜系統(tǒng)、葉綠體超微結構、保護酶系統(tǒng)都受到了不同程度的破壞[19-20]，沙化逆境下植物的生長狀況是對環(huán)境因素高溫、高寒、高旱、鹽堿等脅迫的綜合表現(xiàn)[21-22]，在這種條件下，以單一的生理指標評估來自不同植物適應逆境的能力會出現(xiàn)較大的誤差，因此，通過比較葉片的光合特性、光響應曲線、生理酶活性等變化，可以綜合說明其對沙化生境的適應性.

目前，人工修復是沙化草地治理的重要措施之一，近些年來，我們在開展高寒地區(qū)沙化草地治理工作中發(fā)現(xiàn)，以禮草(Koegneria hirsute)和賴草(Leymussecalinus)是該生境條件下的先鋒牧草，對沙化生境有著很強的適應性，垂穗披堿草(Elymusnutans)是高寒草地上的主要建群種和優(yōu)勢種之一，是被常用來恢復高寒沙化草地的主要草種之一[23]. 本試驗以沙化草地采用人工種植以禮草、賴草和垂穗披堿草為研究對象，測定葉片光合指標、光合曲線、生理酶活性等，比較分析了葉片的生理特征，旨在進一步比較三種牧草在沙化逆境條件下的適應性，為沙化草地恢復中的引種栽培、遺傳改良和新品種選育提供科學依據(jù)，也為高原地區(qū)生態(tài)治理、退化草地恢復牧草的選擇提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為保證取樣地點的外界生長條件和樣本的一致性，首先在試驗地選取2017 年人工種植的以禮草、賴草和垂穗披堿草，隨機設置12 個1 m ×1 m 的樣方，在樣方內(nèi)選擇花期的樣本定株取樣，4 個重復(表1).

表1 三種牧草基本情況Table 1 The basic information of three forages

1.2 試驗地概況

試驗地位于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣瓦切鄉(xiāng)(N：31°51′～33°19′，E：101°51′～103°23′)，海拔3 210 ～4 857 m，屬大陸性高原寒溫帶季風氣候，春秋短促、長冬無夏.年均降雨量791.95 mm，降雨主要集中在5 ～9 月，年均氣溫為1.1 ℃，最冷月平均氣溫10.3 ℃，最熱月平均氣溫10.9 ℃，極端最低氣溫-36 ℃，年均積雪期為76 d，無絕對的無霜期. 日照充分，太陽輻射強，年均日照時間2 158.7 h，太陽輻射年總量為6 194 MJ·m-2.

1.3 試驗方法

1.3.1 光合特性

(1)光合指標的測定

開花期選晴天早上10：00 -11：30，使用Li-6400便攜式植物光合作用測定儀，測定樣本的光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、水分利用率(WUE)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci).每個種選取4 株大小相近、生長良好的測定樣本，測定時選擇旗葉測定.4 次重復，取平均值[24].

(2)光響應曲線

完成光合指標的測定后，用Li -6400 便攜式光合作用測定系統(tǒng)(Li -Cor，lincoln，USA)測定光合響應曲線.測定時，使用2 cm ×3 cm 的紅藍光源葉室，設置光照強度梯度為 0、70、150、250、400、600、1000、1500、2000 μ mol·m-2·s-1，測定不同光照強度下三種牧草相應的凈光合速率.

參照二氧化碳濃度設定為400 μ mol·mol-1，沙化草地的地表溫度較高，試驗控制溫度選為30℃. 每種牧草取3 株作為重復，選取旗葉測定，取其平均值.光響應曲線的相關參數(shù)利用Walker 所提出的相關模型及凈光合速率與光合有效輻射擬合的二次方程進行求導計算，其模型函數(shù)表達式為(1)：

公式(1)中，A 為凈光合速率(μ mol·m-2·s-1)；Q 為表觀量子效率(mol·mol-1)；Amax 為最大光合速率(μ mol·m-2·s-1)；Rd 為暗呼吸速率(μ mol·m-2·s-1)；Par 為光合有效輻射(μ mol·m-2·s-1)；K 為曲角. 對模型中各個相關參數(shù)選用SPSS統(tǒng)計分析軟件中的非線性回歸方法估計，并對光響應曲線的初始部分Par 進行線性回歸，光補償點(LCP，μ mol·m-2·s-1)即為它與X 軸的交點；光飽和點(LSP，μ mol·m-2·s-1)的計算則利用 A 與 PAR 擬合的二次方程求導得到[25-27].

1.3.2 生理指標的測定

在劃定的樣方中，選取長勢均一的三種牧草旗葉，采集的樣品放入封口的塑料袋內(nèi)，并將其儲藏在黑暗的保溫箱內(nèi)(有冰袋，內(nèi)部溫度＜4℃)，樣品設3個重復；將其帶回實驗室并快速進行相關指標測定，其它生理指標的樣品采用用錫紙包裝，并將樣品裝于紗布袋中儲存在液氮罐中，帶回實驗室儲存于-80℃超低溫冰箱中待測[28].測定內(nèi)容包括：丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、可溶性蛋白(Soluble protein，SP)、超氧化物歧化酶活性(Superoxide Dismutase)、過氧化氫酶(Catalase Test，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbateperoxidase，APX)、過氧化物酶活性(Peroxidase，POD)，葉片的上述生理指標分別采用試劑盒測定[29].

1.4 葉片抗性綜合評價方法

采用Fuzzy 數(shù)學中隸屬函數(shù)法對供試材料的6 個生理生化指標進行適應性綜合評判[30-31]，計算公式如下：

可溶性蛋白、超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、過氧化物酶活性與適應性呈正相關，用公式(2)計算：

MDA 與適應性呈負相關，用公式(3)計算：

上述(2)和(3)式中：Xi 為指標測定值. Xmax 為參試材料某一指標的最大值，Xmin 為參試材料某一指標的最小值.用供試材料的各項測定指標的隸屬度平均值來作為供試材料對沙化生境條件下的綜合評判標準.

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗中的數(shù)據(jù)用Spss 22.0(Statistical Product and Service Solutions)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用Origin2017 繪圖.

2 結果與分析

2.1 光合特性分析

由表2 可知，以禮草光合速率Pn 值為31.55 μ mol·m-2·s-1，顯著高于賴草和垂穗披堿草(P＜0.05)；垂穗披堿草蒸騰速率值最高，其次是以禮草、賴草，三者差異顯著(P＜0.05).賴草葉片的水分利用率為3.74 μ mol·mol-1，顯著高于以禮草和垂穗披堿草，且三者差異顯著(P＜0.05).三種牧草的氣孔導度值介于0.55～0.63m mol·m-2·s-1之間，無顯著性差異.賴草的胞間CO2濃度顯著高于以禮草和垂穗披堿草，差異顯著(P＜0.05)，達到了 248.95 μmol·mol-1，其次是以禮草，為226.65 μmol·mol-1，垂穗披堿草最低，兩者之間差異不顯著(P＞0.05).

表2 三種牧草的光合指標比較Table 2 Comparison of photosynthetic indexes among three forages

2.2 光響應曲線分析

設置外源光照強度(Par)梯度為 0、70、150、250、400、600、1 000、1 500、2 000 μmol·m-2·s-1條件下，測定最大光合速率(Pn)；對Par、和Pn 進行非直角雙曲線模型了模擬，模擬結果看出，三個方程的決定系數(shù)均在0.85 以上，結果能較好的反映3 種植物葉片光合對光照的響應過程.

隨著Par 值由小到大的梯度變化，3 種牧草的凈光合速率呈拋物線形變化，凈光合速率隨著光合有效輻射的增大均表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，峰值大小不同. 以禮草的峰值較大，出現(xiàn)在光合有效輻射為1 560.38 μmol·m-2·s-1的時候，垂穗披堿草最小，出現(xiàn)在1 664.25 μmol·m-2·s-1，1 854.93 μmol·m-2·s-1 的時候. 當 Par 值 ＞ 900 μmol·m-2·s-1時，三種牧草的凈光合速率最大值分別為：以禮草＞賴草＞垂穗披堿草(圖1).

圖1 三種牧草的光響應曲線Fig.1 Light response curve of three forages

比較光響應參數(shù)可以看出(表3)，以禮草的最大光合速率顯著高于賴草和披堿草，達到了31.85 μmol·m-2·s-1；其次是賴草，垂穗披堿草最低，僅為19.17 μmol·m-2·s-1，三者之間差異顯著(P＜0.05).光合曲角和表觀量子效率三者之間無顯著差異(P＞0.05).以禮草的暗呼吸顯著低于賴草和垂穗披堿草(P＜0.05)，僅為 1.25 μmol·m-2·s-1；賴草和垂穗披堿草之間，差異不顯著(P＞0.05). 以禮草的光飽和點最高，為 1 307.56 μmol·m-2·s-1，其次是賴草為934.88 μmol·m-2·s-1，垂穗披堿草最低，僅有582.48 μmol·m-2·s-1，三者之間差異顯著(P＜0.05). 賴草和垂穗披堿草的光照補償點分別為33.39 μmol·m-2·s-1、39.94 μmol·m-2·s-1，無顯著差異，但是兩者數(shù)值顯著高于以禮草(P＞0.05).

表3 三種牧草光響應參數(shù)比較Table 3 Comparison of the light response model parameters of three forages

2.3 抗逆生理指標分析

2.3.1 生理指標測定

以禮草的MDA 含量顯著低于賴草和垂穗披堿草(P＜0.01)，為 21.0 m mol·g-1，賴草和垂穗披堿草之間無顯著差異(P＞0.05). 賴草、以禮草的可溶性蛋白含量分別為 52.6 mg·g-1、58.3 mg·g-1，均顯著高于垂穗披堿草. 賴草的SOD 值為42.3 μ·g-1，顯著高于以禮草和垂穗披堿草(P＜0.05)，垂穗披堿草的含量最低(P＜0.05).三種牧草的CAT 活性無顯著差異，保持在0.4 ～0.6 μ·g-1之間.以禮草的APX值為4.7 μ·g-1，顯著高于賴草和垂穗披堿草(P＜0.05).比較POD 的含量發(fā)現(xiàn)，賴草的值為307.3 μ·(min·mg)-1 顯著高于以禮草和垂穗披堿草(P＜0.05). 以禮草和垂穗披堿草之間無顯著差異(P＞0.05)(圖2).

2.3.2 葉片抗性綜合評價

用隸屬函數(shù)法，比較兩個沙化草地先鋒牧草的抗性強弱.三種牧草測定指標參數(shù)的隸屬函數(shù)值由上述公式(1)和(2)可以求出，將各項指標的隸屬函數(shù)值相加，求平均值，得出抗性綜合評價值.供試材料的綜合評價值越大，抗性越強，反之則越弱.綜合評判分析發(fā)現(xiàn)，在沙化生境條件下，三者抗性綜合表現(xiàn)順序依次為：以禮草＞賴草＞垂穗披堿草(表4).

圖2 三種牧草葉片的生理指標比較Fig.2 Comparison of physiological indexes of three forage leaves

表4 三種牧草葉片抗性綜合評判Table 4 Evaluation of leaf resistance between three forage species

2.4 光合指標和酶活性相關性分析

分析了三種牧草葉片最大光合速率、光合補償點、光合飽和點與抗性相關的酶活性、滲透調節(jié)物質之間的相關性.表5 可以看出，植物的最大光合速率與 MDA、CAT 含量呈負相關，差異不顯著(P＞0.05)；與 SOD、蛋白含量、CAT、APX、POD 呈正相關，其中與SOD 差異極顯著(P＜0. 01). 光的飽和點和 MDA、SOD、可溶性蛋白含量、APX、POD 的相關性呈正相關，其中與 SOD 差異極顯著(P＜0.01)；與 CAT 呈負相關，差異不顯著(P＞0.05). 光的補償點與MDA、SOD、APX、POD 呈負相關，其中與 SOD 差異極顯著(P＜0.01)，；與蛋白含量、CAT 含量呈正相關，其中，CAT 差異顯著(P＜0.05).

表5 葉片光合指標和生理酶活性的相關性比較Table 5 Correlation between leaf photosynthetic index and physiological enzyme activity

3 討論

3.1 三種牧草的光合指標比較

沙化草地具有高寒、干旱、高溫等特殊的交叉脅迫影響著植物的正常生長，沙化地植物通過葉片的光合酶系統(tǒng)及生理調節(jié)適應這種特殊的生境[32]. 先鋒牧草的以禮草凈光合速率值最高，凈光合產(chǎn)物積累能力強，王云賀等人研究結論也證明了野生植物凈光合速率高于栽培種[33]. 賴草葉片的水分利用率、胞間CO2濃度、氣孔導度值表現(xiàn)最大，在該生境下具有更好的CO2和水分的捕捉能力，保持了植株高大、單株鮮重大等特性，李瑩等人的研究驗證賴草的這一特性[34].作為高原地區(qū)常見的栽培種，垂穗披堿草葉片的蒸騰速率最大，葉片更多的通過蒸騰作用去適應這種環(huán)境，Burgess 等人的研究結論也表明，受到環(huán)境的變化影響，植物通過改變?nèi)~片的內(nèi)外蒸氣壓，加快蒸騰速率，造成的水勢梯度來吸收和運輸水分，促進植物的生長發(fā)育[35].

光合光響應曲線可以反映植物在生長環(huán)境條件下對光的利用方式和對環(huán)境的響應[36].以禮草的Pn、Pnmax、LSP 顯著高于賴草和垂穗披堿草，Rd、LCD 顯著低于賴草和垂穗披堿草，有學者研究發(fā)現(xiàn)，紫葉小檗(Berberisthunbergii)的Pnmax 值最大，其葉片在光照有限的條件下進行光合作用能力最強，促進了有機物質的積累[37-38]. 研究小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)和千穗谷(Amaranthushypochondriacus)發(fā)現(xiàn)，Rd 值低有利于光合產(chǎn)物的積累[39]，植物利用弱光的能力可以用光補償點(LCP)進行反映，其數(shù)值越低表明植物利用弱光的能力越強；植物利用強光的能力可以用光合飽和點(LSP)來反映，其值越大表明利用強光進行光合作用能力強[40-41]，進一步證明了以禮草對光環(huán)境的適應范圍較廣，對強光和弱光均有很好的利用能力，保持葉片自身的最大光合能力來適應生境條件，賴草高大，葉片較高的LSP 和Pnmax 是其適應這種生境的生理特性.三種牧草的光合特性差異大，這可能是植物不同適應環(huán)境的方式不同[41].

3.2 三種牧草的生理活性指標比較

以禮草和賴草的葉片MDA 含量較垂穗披堿草低，徐萍等研究干旱脅迫對銀沙槐(Ammodendronargenteum)幼苗發(fā)現(xiàn)，植物受到輕度脅迫時，自身葉片細胞膜穩(wěn)定性增強，隨著脅迫的程度增加，細胞膜發(fā)生膜脂過氧化，MDA 含增加，導致膜的穩(wěn)定性降低，膜透性增大[42]，以禮草和賴草的葉片細胞膜穩(wěn)定性較強.匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)在干旱脅迫條件下，通過提高自身葉片細胞的滲透調節(jié)物質的含量來適應脅迫，高含量的可溶性蛋白等滲透調節(jié)物質使植物細胞的滲透勢維持在較低的水平下，進而可以抵御水分脅迫對植物帶來的傷害[43]，以禮草和賴草的葉片細胞可溶性蛋白含量高，其葉片通過提高滲透調節(jié)物質的含量使其自身細胞維持在一個較低的滲透勢，減少逆境造成的傷害[44].

植物受到逆境脅迫信號后，通過調節(jié)SOD、CAT、POD 和APX 等抗氧化酶維持自身活性氧代謝的平衡，減緩細胞內(nèi)活性氧自由基積累傷害[45].SOD 催化超氧陰離子自由基的歧化反應，CAT、POD 和 APX 主要清除H2O2[46].SOD、POD、CAT 等酶活性與植物抗逆性呈正相關或負相關存在一定爭議[47].

本研究中通過隸屬函數(shù)綜合比較抗逆性的結果來看，作為先鋒植物，以禮草葉片在沙化生境中葉片細胞膜穩(wěn)定性、滲透勢水平和抗氧化酶維持自身活性氧代謝的平衡等綜合能力最強，這與在花椒(Zanthoxylumbungeanum)[48]、野生大豆[49]、葎草(Humulusscandens)[50]和小麥[51]中的結論類似，證實了SOD、POD、CAT 的活性增強有助提高植株的抗逆性.

3.3 三種牧草的光合指標和酶活性相關性比較

對牧草葉片的光合指標和酶活性相關性比較發(fā)現(xiàn)：光的飽和點和葉片的SOD 酶活性呈極顯著正相關，光的補償點與SOD 酶活性差異極顯著負相關，與CAT 酶活性差異顯著正相關.這與西瓜(Citrulluslanatus)幼苗[52]的研究結果一致，與煙草(Nicotianatabacum)的研究結論不一致，主要原因可能是植物生長環(huán)境和植物自身遺傳差異導致了不同生境條件葉片光合路徑的變化和葉片生理調節(jié)的差異[53].

4 結論

以禮草和賴草的葉片具有較強的光合特性，以禮草葉片生理指標綜合適應性最強，具有較大的LSP 、Pnmax 和較小的LCP、Rd，對光的適應范圍廣.三種牧草葉片的SOD 活性顯著影響葉片的LSP 和LCP，證實了先鋒牧草葉片生理特性對其在沙化生境適應性方面的重要作用.本文僅對沙化草地三種牧草葉片的生理酶活性和光合特性的強弱進行了測定和比較，為下一步開展沙化草地生境條件下葉片的光合特性和相關酶活性生理應答機制方面的研究奠定了基礎.今后利用分子手段探究和挖掘以禮草葉片光適應范圍廣的性狀，可以為沙化草地治理培育抗逆牧草新品種發(fā)揮重要作用.