白玉芬 徐洪濤 尹太勇 丁冬勝 李琳 聶國明 鄒敏書

摘要：目的? 研究維生素D（VitD）在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）治療中的作用機制。方法? 將6只C57/B6小鼠隨機分為兩組（組1、2），12只MRL/lpr小鼠隨機分為四組（組3～6），每組3只，其中組1、6不做處理，組2：C57/B6小鼠+VitD[10 ng/（kg·d）];組3：MRL/lpr小鼠+VitD[10 ng/（kg·d）];組4：MRL/lpr小鼠+VitD[30 ng/（kg·d）];組5：MRL/lpr小鼠+VitD[10 ng/（kg·d）]+PA （0.8 μg/kg，3/W）。灌胃6周后處死小鼠，收集Peyer小結(jié)，流式細胞儀測定活化及凋亡的Tfh細胞百分率，B淋巴細胞及漿細胞百分率，趨化因子CCL12、CXCL13、CCL19、CCL21的表達;Real-Time PCR測定IL-21、IL-4mRNA的表達;Western Blot測定IL-21、IL-4、Bcl-6、Blimp-1、XBP-1、Pax-5、BAFF蛋白的表達。結(jié)果? 與SLE鼠組相比，給予VitD可以降低Tfh細胞百分率但不能明顯改變Tfh細胞的活化，減少細胞凋亡，降低B淋巴細胞和漿細胞百分率。同時可以下調(diào)IL-21、IL-4、Blimp-1、XBP-1、BAFF蛋白，細胞因子IL-21、IL-4mRNA和趨化因子CCL12、CXCL13、CCL19、CCL21的表達，上調(diào)Bcl-6、Pax-5蛋白的表達，且呈劑量依賴性，與PA聯(lián)用效果更佳。結(jié)論? VitD與其受體結(jié)合可能通過抑制Tfh細胞、相關(guān)因子及微環(huán)境、抑制自身免疫抗體的生成，從而對SLE產(chǎn)生治療作用。

關(guān)鍵詞：維生素D;SLE;濾泡輔助性T細胞;Peyer小結(jié)

中圖分類號：R692.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.13.014

文章編號：1006-1959（2020）13-0049-05

The Effect of Vitamin D on the Microenvironment of Tfh Cells

in Peyer's Nodules of Systemic Lupus Erythematosus

BAI Yu-fen，XU Hong-tao，YIN Tai-yong，DING Dong-sheng，LI Lin，NIE Guo-ming，ZOU Min-shu

（Department of Pediatrics，Central War Theater General Hospital，Wuhan 430070，Hubei，China）

Abstract：Objective? To study the mechanism of vitamin D （VitD） in the treatment of systemic lupus erythematosus （SLE）.Methods? Six C57/B6 mice were randomly divided into two groups （groups 1 and 2）， and 12 MRL/lpr mice were randomly divided into four groups （groups 3 to 6）， with 3 mice in each group， of which groups 1 and 6 without treatment， Group 2： C57/B6 mice + VitD[10 ng/（kg·d）]; Group 3： MRL/lpr mice+VitD[10 ng/（kg·d）]; Group 4： MRL /lpr mice+VitD[30 ng/（kg·d）]; Group 5： MRL/lpr mice+VitD[10 ng/（kg·d）]+PA （0.8 μg/kg， 3/W）. After 6 weeks of gavage， the mice were sacrificed， Peyer nodules were collected， flow cytometry was used to determine the percentage of activated and apoptotic Tfh cells， B lymphocytes and plasma cells， and the expression of chemokines CCL12， CXCL13， CCL19， CCL21; Real-Time PCR measured the expression of IL-21 and IL-4 mRNA; Western Blot measured the expression of IL-21， IL-4， Bcl-6， Blimp-1， XBP-1， Pax-5 and BAFF protein.Results? Compared with the SLE mice group， the administration of VitD can reduce the percentage of Tfh cells but can not significantly change the activation of Tfh cells， reduce apoptosis， and reduce the percentage of B lymphocytes and plasma cells. At the same time， it can down-regulate the expression of IL-21， IL-4， Blimp-1， XBP-1， BAFF protein， cytokines IL-21， IL-4mRNA and chemokines CCL12， CXCL13， CCL19， CCL21， and up-regulate Bcl-6，the expression of Pax-5 protein is dose-dependent， and it is more effective in combination with PA.Conclusion? The binding of VitD to its receptor may have a therapeutic effect on SLE by inhibiting Tfh cells， related factors and microenvironment， and inhibiting the production of autoimmune antibodies.

Key words：Vitamin D;SLE;Follicular helper T cells;Peyer's summary

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要是自身抗體產(chǎn)生、補體活化和免疫復(fù)合物沉積，對青中年婦女影響最大[1]。近年來，隨著SLE診斷和治療方法的改善，其發(fā)病率和死亡率有所下降，但仍高于一般人群。有流行病學(xué)表明[2]，遺傳因素與環(huán)境的相互作用，會增加患SLE的風(fēng)險，例如暴露于晶體二氧化硅、吸煙、使用口服避孕藥等，但飲酒反而會降低患病幾率。同時也有研究表明[3，4]，SLE風(fēng)險與接觸農(nóng)業(yè)殺蟲劑、重金屬、空氣污染、紫外線、某些感染和疫苗接種也有關(guān)聯(lián)。濾泡輔助性T細胞（Tfh）是一種定位于淋巴濾泡、CD4+T細胞亞型，能夠?qū)細胞增殖及分化起輔助作用[5-7]。其對免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換的作用能夠調(diào)控體液免疫應(yīng)答，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）及SLE等自身免疫性疾病發(fā)病機制中有重大影響[8，9]。維生素D（VitD）是一種主要由人體皮膚在紫外線照射下合成的激素，能夠調(diào)節(jié)鈣和磷酸鹽水平的循環(huán)，從而影響骨骼代謝[10-12]。除了可以在骨代謝中的起作用外，VitD還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，增強單核巨噬細胞的殺菌能力和下調(diào)T淋巴細胞產(chǎn)生的炎癥細胞因子。當(dāng)VitD缺乏會導(dǎo)致許多健康問題，包括免疫介導(dǎo)的疾病，如自身免疫性疾病[13-15]。研究表明[16]，VitD不足往往與免疫紊亂和傳染病有關(guān)，而越來越多的證據(jù)表明，全球人口的VitD狀況不佳。迄今為止，大多數(shù)關(guān)于補充維生素D的人類炎癥和免疫疾病的干預(yù)研究結(jié)論尚存在爭議[17]。本研究觀察了VitD對SLE鼠Peyer小結(jié)Tfh細胞及其相關(guān)因子的影響，探討VitD治療SLE的作用機制，以期為今后科學(xué)合理的治療SLE提供了新的方向。

1材料與方法

1.1材料? SPF級16周 C57/B6及MRL/lpr小鼠，由武漢華聯(lián)科生物科技公司提供。在溫度22℃～24℃、濕度60%～70%屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。本實驗通過解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會通過[武總動（福）第2014012號]。

1.2方法? 將C57/B6小鼠隨機分為兩組，每組3只。組1：C57/B6小鼠組，每天給予100 μl丙二醇溶液灌胃;組2：C57/B6小鼠+ViD組：給予1，25（OH）2D溶于100 μl丙二醇溶液中，按10 ng/（kg·d）灌胃。將MRL/lpr小鼠隨機分為四組，每組3只。隨機分組如下：組3：1，25（OH）2D溶于100 μl丙二醇溶液中，按10 ng/（kg·d）灌胃;組4：1，25（OH）2D溶于100 μl丙二醇溶液中，按30 ng/（kg·d）灌胃;組5：1，25（OH）2D溶于100 μl丙二醇溶液中，按30 ng/（kg·d）+帕立骨化醇（PA）（0.8 μg/kg，3/W）灌胃;組6：MRL/lpr小鼠;每天給予100 μl丙二醇溶液灌胃。均持續(xù)6周，6周后消毒小鼠腹壁毛發(fā)及皮膚，四肢伸展固定于超清手術(shù)臺上，用無菌剪刀于腹中線剪開皮膚，分離小腸，去除脂肪，用生理鹽水反復(fù)沖洗腸腔，小彎剪將附著于小腸壁集合淋巴濾泡即Peyer 小結(jié)分離清潔，放入RPMI1640 培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入100 目不銹鋼篩網(wǎng)上碾磨，RPMI1640培養(yǎng)液沖洗，將Peyer小結(jié)勻漿液轉(zhuǎn)入試管中，離心，去上清液，加PBS洗滌備用。

1.3指標(biāo)測定? 流式細胞儀（BECKMAN公司FC500 MCL）測定活化及凋亡的Tfh細胞百分率（AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自bioswamp公司），B淋巴細胞及漿細胞百分率，趨化因子CCL12、CXCL13、CCL19、CCL21的表達;Real-Time PCR測定IL-21、IL-4mRNA的表達;Western Blot測定IL-21、IL-4、Bcl-6、Blimp-1、XBP-1、Pax-5、BAFF蛋白的表達。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法? 使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包分析，數(shù)據(jù)用（x±s）表示，多組比較用one-way ANOVA方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD 法，方差不齊者用Dunnetts T3 檢驗。兩組比較用獨立樣本t 檢驗，采用Pearson 相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 VitD對MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)Tfh細胞的影響? MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)Tfh細胞百分率較C57/B6小鼠顯著增加（P<0.01），而二者活化的Tfh細胞熒光值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;VitD不能明顯降低C57/B6小鼠Tfh細胞、活化的Tfh比率水平。與MRL/lpr小鼠相比，小劑量VitD可降低Tfh細胞百分率，大劑量VitD可顯著降低Tfh細胞百分率，但對Tfh細胞的活化無明顯影響;VitD與PA聯(lián)用使Tfh細胞百分率降至最低（P<0.01），但不能明顯改變Tfh細胞的活化，見表1。

2.2 VitD對MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)細胞凋亡的影響? MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)細胞凋亡百分率較C57/B6小鼠顯著增加（P<0.01）;給予VitD并未降低C57/B6小鼠細胞凋亡水平。與MRL/lpr小鼠相比，給予小劑量VitD可降低細胞凋亡水平;給予大劑量VitD進一步降低細胞凋亡百分率;VitD與VDR激動劑PA聯(lián)用使細胞凋亡百分率降至最低，見表2。

2.3 VitD對MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)B淋巴細胞百分率的影響? MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)前B淋巴細胞（B220+IgM-B）百分率較C57/B6小鼠顯著降低，而未成熟B淋巴細胞（B220-IgM+B）、成熟B淋巴細胞（220+IgD+B）百分率較較C57/B6小鼠顯著升高（P<0.01）;VitD可降低C57/B6小鼠未成熟B淋巴細胞（B220-IgM+B）百分率，對B淋巴細胞（B220+IgM-B）、成熟B淋巴細胞（220+IgD+B）百分率無明顯影響。與MRL/lpr小鼠相比，給予小劑量VitD可降低未成熟B淋巴細胞（B220-IgM+B）百分率;給予大劑量VitD進一步降低未成熟B淋巴細胞（B220-IgM+B）、成熟B淋巴細胞（220+IgD+B）百分率;VitD與VDR激動劑PA聯(lián)用使前B淋巴細胞（B220+IgM-B）百分率升至最高，未成熟B淋巴細胞（B220-IgM+B）、成熟B淋巴細胞（220+IgD+B）百分率降低，見表3。

2.4 VitD對MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)漿細胞百分率的影響? MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)前體百分率較C57/B6小鼠無明顯增加，而漿細胞百分率較C57/B6小鼠顯著增加。在C57/B6小鼠中，VitD對漿細胞前體、漿細胞百分率無明顯影響。與MRL/lpr小鼠相比，給予小劑量VitD對漿細胞前體細胞百分率無明顯改變，而可降低漿細胞百分率;給予大劑量VitD進一步增加漿細胞前體細胞百分率，降低漿細胞百分率;VitD與VDR激動劑PA聯(lián)用使?jié){細胞前體細胞百分率升至最高，漿細胞百分率降至最低，見表4。

2.5 MRL/lpr小鼠Peyer小結(jié)Tfh相關(guān)細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達? 1組與2組IL-21、IL-4、Bcl-6、Blimp-1、XBP-1、Pax-5、BAFF蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;MRL/lpr小鼠IL-4、Blimp-1、BAFF蛋白表達較C57/B6小鼠顯著增加，而Bcl-6表達明顯下降。小劑量VitD可上調(diào)Bcl-6的表達;大劑量VitD可下調(diào)IL-21、IL-4、Blimp-1、XBP-1、BAFF表達，上調(diào)Bcl-6、Pax-5的表達。VitD與PA聯(lián)用進一步下調(diào)MRL/lpr小鼠IL-21、IL-4、Blimp-1、XBP-1、BAFF的表達，上調(diào)Bcl-6、Pax-5的表達，見表5。

2.6 Peyer小結(jié)Tfh相關(guān)細胞因子IL-21、IL-4 mRNA的表達? C57/B6小鼠Peyer小結(jié)IL-21、IL-4基因表達較MRL/lpr小鼠顯著升高（P<0.05）;VitD可降低C57/B6小鼠IL-21基因的表達，對IL-4 mRNA的表達無明顯影響;與MRL/lpr小鼠相比，給予小劑量VitD及大劑量VitD均可顯著降低IL-21、IL-4 mRNA的表達;VitD與VDR激動劑PA聯(lián)用使IL-21 mRNA的表達降至最低。與單用VitD相比，VitD與PA聯(lián)用可顯著降低IL-21 mRNA的表達（P<0.01），而二者對IL-4 mRNA的表達影響的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表6。

2.7 Peyer小結(jié)趨化因子的表達? VitD對C57/B6小鼠CCL12、CXCL13、CCL19、CCL21的表達無明顯影響。MRL/lpr小鼠CCL12、CXCL13、CCL19、CCL21的表達較C57/B6小鼠升高。與MRL/lpr小鼠相比，小劑量及大劑量VitD均可顯著降低CCL12、CXCL13、CCL19、CCL21的表達，但僅CCL19的下降統(tǒng)計學(xué)意義顯著;VitD與VDR激動劑PA聯(lián)用使CCL12、CXCL13的表達進一步降低，但無差異統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表7。

3討論

SLE是一種病因未明，由自身免疫應(yīng)答異?；罨閷?dǎo)的炎癥性結(jié)締組織病。其致病機制十分復(fù)雜，其中尤以多克隆B細胞高度活化、免疫球蛋白增多和多種自身抗體生成及細胞內(nèi)外免疫反應(yīng)低下為主要特征。而通過本研究發(fā)現(xiàn)VitD與PA聯(lián)用可以顯著降低Tfh細胞的百分率和細胞凋亡的百分率，同時可以升高漿細胞和B淋巴細胞前體細胞的百分率，從而降低漿細胞和B淋巴細胞的百分率。為了進一步了解VitD對SLE的作用機制，本研究對相關(guān)因子進行了更深入地分析。

B細胞激活因子（BAFF）屬于TNF超家族，是一種B淋巴細胞刺激器，能影響B(tài)細胞存活和分化。BAFF通過上調(diào)抗凋亡蛋白來保證B細胞的存活和漿細胞分化。研究證明[18]，當(dāng)BAFF濃度升高時，SLE患者疾病活動程度增強。B淋巴細胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1（Blimp-1）調(diào)控B細胞向漿細胞轉(zhuǎn)化，是漿細胞分化的啟動元件，在漿細胞分化、維持及產(chǎn)生抗體過程中有著舉足輕重的作用。Blimp-1正常表達時，可促進B細胞向漿細胞分化，而Blimp-1表達缺陷時，漿細胞成熟出現(xiàn)障礙。B細胞淋巴瘤-6（Bcl-6）是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)控初始T細胞成長為T細胞。其表達在B細胞和T化細胞的生發(fā)中心（GC），其過度表達可抑制CD4+Th細胞亞群的分化，在GC中也僅有10%左右的T細胞表達Bcl-6;而Bcl-6缺乏會嚴重影響GC的形成，T細胞不能發(fā)育為Tfh細胞，影響機體正常的免疫應(yīng)答，無法生成抗體。Bcl-6/Blimp-1平衡是調(diào)控抗體分泌的關(guān)鍵因子，但兩者相互拮抗，當(dāng)其平衡被破壞時，抗體的分泌影響極大[19-21]。在研究中，VitD通過上調(diào)Bcl-6和下調(diào)Blimp-1的表達來破壞Bcl-6/Blimp-1的平衡，以此減少抗體分泌，在一定程度上對SLE產(chǎn)生作用。

白細胞介素-21（IL-21）主要由T細胞分泌產(chǎn)生，作用于B細胞表面的IL-21R上，啟動一系列可以促進Blimp-1表達的信號通路，T細胞對B的作用可促進B細胞分化形成漿細胞，增加抗體的分泌。本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)VitD可以顯著降低IL-21mRNA的表達，抑制IL-21的分泌可以降低B細胞活化和漿細胞形成，導(dǎo)致自身抗體濃度降低，同時，中性粒細胞和單核細胞數(shù)目也會減少，進一步改善狼瘡小鼠的癥狀，這與現(xiàn)有研究結(jié)論一致[22，23]。

白細胞介素-4（IL-4）主要由Th2細胞分泌，可以促進B細胞增殖，促進體液免疫，但是會抑制Thl細胞因子的分泌，降低細胞免疫。此外，IL-4也可以促進B細胞CD40、FcεRⅡ/CD23和MHCⅡ類抗原的表達，增強呈遞抗原的能力，促進免疫應(yīng)答[22-24]。

能使細胞產(chǎn)生趨化運動的細胞因子被稱為趨化因子，對淋巴細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞等均有作用。在腫瘤、自身免疫性疾病等數(shù)種疾病中均有趨化因子及其受體的發(fā)揮作用[25]。CXC趨化因子配體13 （CXCL13）作為CXC趨化因子家族的一員，主要由次級淋巴器官（包括脾、淋巴結(jié)、Peyer's結(jié)）中的樹突狀細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，通過與其受體CXC趨化因子受體5（CXCR5）相結(jié)合，對B淋巴細胞移動、尋靶和誘導(dǎo)次級淋巴組織中GC的形成中發(fā)揮重要作用[26，27]。研究表明其在多種自身免疫性疾病如SLE、RA和干燥綜合征（SS）中發(fā)揮重要的作用[28]。CCL12最初是從有過敏性炎癥反應(yīng)的小鼠肺中分離出來，主要在淋巴結(jié)中表達，能明顯誘導(dǎo)活化巨噬細胞表達。純化的重組CCL12蛋白對外周血單核細胞有較強的趨化作用。在高劑量時對嗜酸性粒細胞活性弱，對中性粒細胞無活性，具有CC趨化因子的特點[29-31]。CCL19和CCL21是CC類趨化因子家族成員，是內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性趨化因子，在氣管內(nèi)高表達，調(diào)節(jié)炎癥細胞的遷移和功能，與呼吸系統(tǒng)多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[32，33]。本研究對這些趨化因子進行分析時發(fā)現(xiàn)VitD可以顯著降低CCL12、CXCL13、CCL19、CCL21的表達，在各種組織器官和外周血中減弱淋巴細胞和炎癥細胞的功能，減少其他并發(fā)癥的發(fā)生，提升SLE患者的生活質(zhì)量。

綜上所述，對狼瘡小鼠模型使用VitD可以明顯下調(diào)IL-4，IL-21，XBP-1，BAFF的表達，影響B(tài)cl-6/Blimp-1的平衡，降低趨化因子CCL12、CXCL13、CCL19、CCL21的表達。從而降低Tfh細胞比率，減少細胞凋亡，降低成熟B淋巴細胞和漿細胞的數(shù)量，達到抑制抗體分泌，治療SLE的作用。

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收稿日期：2020-04-09;修回日期：2020-04-28

編輯/肖婷婷

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81373179）

作者簡介：白玉芬（1968.3-），女，湖北宜昌人，本科，主治醫(yī)師，主要從事免疫和生長發(fā)育疾病的診療工作

通訊作者：鄒敏書（1971.8-），男，湖北大冶人，博士，副主任醫(yī)師，主要從事兒童腎臟病及生長發(fā)育疾病的診療工作