董玉雙 談 珍 張 勤 袁曉軍

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院小兒血液腫瘤科（上海 200092）

尤文肉瘤家族腫瘤（Ewing sarcoma family tumor，ESFT）是起源于骨和軟組織的小圓細胞惡性腫瘤，包括尤文肉瘤、原始神經(jīng)外胚層瘤（primitive neuroectodermal tumor，PNET）和胸壁Askin瘤（特指發(fā)生于胸壁的原始神經(jīng)外胚層腫瘤）。ESFT具有特異性的EWSR 1-ETS融合基因。世界衛(wèi)生組織骨腫瘤第四版刪除了尤文肉瘤/PNET這一分類，統(tǒng)一命名為尤文肉瘤，并歸入其他腫瘤大類中[1]。ESFT較為罕見，在兒童和青少年中發(fā)病率為1.5/百萬[2]，容易誤診。現(xiàn)回顧分析50例ESFT患兒的臨床資料，分析ESFT的臨床、病理和分子表型特點以及預后。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2008年8月至2018年12月于上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除或腫塊穿刺活檢，病理診斷為尤文肉瘤、PNET或Askin瘤的患兒為研究對象。研究對象入選標準：①發(fā)病及確診年齡＜14周歲；②經(jīng)手術(shù)切除或腫塊穿刺活檢，病理診斷確診為尤文肉瘤、PNET或Askin瘤；③排除確診后拒絕后續(xù)治療，或臨床資料不全者。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 通過查詢院內(nèi)電子病歷系統(tǒng)及病史檔案收集患兒的臨床資料，包括診斷年齡、性別、臨床表現(xiàn)、影像檢查、就診時有無遠處轉(zhuǎn)移、腫塊部位、腫塊來源、腫塊大小、手術(shù)方式和治療方案等。

1.2.2 治療及隨訪 50例患兒中，2例僅活檢后接受化療治療，6例行化療聯(lián)合手術(shù)治療，10例接受化療聯(lián)合放療，32例給予綜合治療（手術(shù)、化療和放療）。所有患者出院后均通過專科門診或電話隨訪，隨訪時間截至2019年12月31日。

1.2.3 化療方案 所有患兒的化療方案均采用美國Children's Oncology Group（COG）的INT-0091方案，即VDC（長春新堿+多柔比星+環(huán)磷酰胺）與IE（異環(huán)磷酰胺+依托泊苷）間隔3周交替應(yīng)用，共17個療程。

1.2.4 組織形態(tài) 標本經(jīng)質(zhì)量分數(shù)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)取材、石蠟包埋，切片厚4 μm，蘇木素-伊紅染色，光鏡觀察。光鏡下ESFT的瘤細胞呈小圓細胞形，核仁不明顯，染色質(zhì)分布均勻，核分裂常見。

1.2.5 免疫組化 根據(jù)免疫組化標準流程進行操作,檢測指標包括CD 99、佛氏白血病整合蛋白1（Friend leukemia integration 1，F(xiàn)LI-1）、NK2轉(zhuǎn)錄樣蛋白B抗體（NKX 2.2）、波形蛋白（Vimentin，Vim）、突觸素（Synaptophysin，SYN）、結(jié)蛋白（Desmin，Des）、白細胞共同抗原（Leukocyte common antigen，LCA）等。結(jié)果判讀標準：胞膜、胞漿或核棕黃色為陽性，如CD99染色陽性為胞膜棕黃色到深褐色，F(xiàn)LI-1染色陽性為胞核棕黃色到深褐色。

1.2.6EWSR 1基因檢測 采用美國雅培公司的EWSR 1雙色異位分離探針，F(xiàn)ISH檢測EWSR 1基因的易位。判讀標準：每個病例隨機選取200個有熒光信號的細胞核，計算出現(xiàn)雜交信號細胞核的個數(shù)。無EWSR 1易位信號的細胞核中顯示為兩個分開的信號(即紅色與綠色信號并列或有疊加部分呈黃色)；有EWSR1易位信號的腫瘤細胞可見1個融合信號。

1.2.7 相關(guān)定義及療效評估 無轉(zhuǎn)移組是指腫瘤局限于原發(fā)部位，伴或不伴區(qū)域淋巴結(jié)侵犯，無遠處轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移組指初診時就已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的患者，如多發(fā)骨質(zhì)、骨髓、遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。按WHO實體瘤療效評價標準進行療效評價。完全緩解（CR）是指腫瘤完全消失,至少持續(xù)4周；部分緩解（PR）是指腫瘤縮小≥50%并持續(xù)4周以上；進展（PD）是指腫瘤增大≥25%或出現(xiàn)新病灶；穩(wěn)定（SD）是指腫瘤縮小未達PR或增加未到PD；無事件生存期（event-free survival，EFS）指從確診日期開始至腫瘤復發(fā)或死亡或末次隨訪的時間；總生存期（overall survival，OS）是指從確診日期至死亡或末次隨訪時間。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（全距）表示?？偵媛什捎肒aplan-Meier法繪制生存曲線；生存率的比較采用Log-Rank檢驗。影響ESFT生存時間的多因素分析采用Cox回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

研究期間經(jīng)手術(shù)切除或腫塊穿刺活檢，病理診斷為尤文肉瘤、PNET或Askin瘤，且發(fā)病年齡＜14周歲的患者共58例，剔除確診后未接受后續(xù)任何治療1例、病史資料不全者6例、復發(fā)后再次手術(shù)病理修正為橫紋肌肉瘤1例，最終共50例納入分析。50例患兒中，男29例、女21例，男女比例為1.4:1，包括尤文肉瘤/PNET 42例，Askin瘤8例。50例患兒的中位發(fā)病年齡為8歲（生后7天～14歲）；從發(fā)病到確診的中位時間為1.5月（12天～3年）；截至2019年12月31日，中位隨訪時間為35個月（1～137個月）。

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其中1例女嬰在生后7天發(fā)現(xiàn)左大腿腫塊，觀察2個月后未消退，CT發(fā)現(xiàn)后腹膜巨大實性占位，病理活檢提示存在EWSR1易位，確診為尤文肉瘤；1例5歲男孩，因發(fā)現(xiàn)腰背部腫物3年，增大1個月來院就診，病程中曾按照淋巴管瘤治療，療效不佳，MRI提示第5腰椎和第1骶椎椎管內(nèi)可見腫塊，伴多發(fā)骨轉(zhuǎn)移，病理活檢診斷為尤文肉瘤/PNET。

ESFT最常見的首發(fā)癥狀為局部疼痛23例（46%），其次為無痛性腫塊21例（42%），6例（12%）表現(xiàn)為雙下肢運動障礙、發(fā)熱、打鼾等。50例患兒的臨床特征見表1。

2.2 組織病理學特點

50例ESFT中25例經(jīng)穿刺活檢確診，25例經(jīng)手術(shù)切除確診。鏡下瘤細胞呈現(xiàn)為片狀或巢狀分布的小圓細胞形。免疫組織化學顯示腫瘤細胞CD 99、FLI-1、NKX 2.2陽性表達（圖1），且具有較高的特異性，陽性表達率分別為100%（50/50）、80%（20/25）、80%（4/5）；部分表達Vim（68%）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）（60%）、CD 56（55%）和SYN（41%），幾乎不表達LCA（4%）、CK（10%）、Des（10%）。35例患兒進行了EWSR1基因檢測，91%（32/35）檢測到EWSR1-ETS易位（圖1D）。

圖1 ESFT患兒免疫組化及分子檢測結(jié)果

2.3 生存狀態(tài)及預后分析

50例患兒中，30例存活、20例死亡。存活患兒中24例CR，6例帶瘤生存（3例復發(fā)，2例PR，1例SD）。3年總體生存率（3y-OS）為（68.2±6.9）%，3年無事件生存率（3 y-EFS）為（63.4±7.2）%，無轉(zhuǎn)移組35例患兒3 y-OS為（78.7±7.2）%，轉(zhuǎn)移組15例患兒3 y-OS（20.6±16.1）% ；兩組間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.46，P＜0.001）。見圖2。

Log-Rank檢驗結(jié)果顯示無轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑＜8 cm、原發(fā)于四肢、手術(shù)為完整切除、聯(lián)合治療（手術(shù)+化療+放療）以及聯(lián)合放療的患兒生存時間更長，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖2 50例ESFT兒童生存曲線分析

表1 ESFT患兒臨床特征及預后 (n=50)

表2 ESFT患兒總生存時間影響因素COX多因素分析結(jié)果

3 討論

ESFT好發(fā)于年長兒童和青少年，10～19歲年齡段最常見[2]，本組患兒的中位發(fā)病年齡8歲，較文獻報道偏小，考慮主要與本院兒科常規(guī)收治12歲以下兒童有關(guān)，其中有1例于生后7天就診。ESFT在新生兒中極為罕見，目前僅有37例新生兒ESFT的文獻報道[3]，他們的預后通常較差，大多數(shù)嬰兒活不過2年。本組中該例新生兒在初次治療完全緩解后8個月出現(xiàn)復發(fā)，再次化療達CR狀態(tài)4個月后出現(xiàn)第二次復發(fā)，目前為帶瘤存活狀態(tài)。

ESFT可累及任何部位的骨和軟組織，最常見的受累部位是長骨、盆腔、肋骨和脊柱[4]。來自美國SEER數(shù)據(jù)庫的分析顯示，1 631例ESFT患者最常見的受累部位為中軸骨（44.1%）[2]。本組38%（19例）患兒腫瘤原發(fā)部位在中軸骨，符合患兒年齡越大，發(fā)生在中軸骨或巨大腫瘤的比例就越高的規(guī)律[5]。局部腫塊或疼痛是ESFT最常見的初始癥狀，本組42%（21/50）患兒表現(xiàn)為局部腫塊，46%（23/50）為腰背部或四肢疼痛。因本病比較少見，當僅表現(xiàn)為局部腫脹或疼痛，且疼痛為間歇性時，常被誤診為生長痛或日常活動造成的損傷和炎癥（如肌腱炎、肌肉疼痛、肌肉損傷或骨髓炎），導致部分患者在疾病早期延誤診斷，本組1例患兒從出現(xiàn)癥狀到最終確診長達3年時間。

ESFT的診斷主要依靠組織病理學依據(jù)，免疫組化特點為90%以上的ESFT腫瘤細胞膜CD 99強表達，即使是在EWSR 1融合基因陰性的病例中也可表達[6]，且CD 99的表達與腫瘤病理亞型無關(guān)[7]。本組患兒CD99陽性表達率為100%，與文獻報道類似。因其他小圓細胞腫瘤也可表達CD 99，故尚需其他免疫組化標記進行鑒別診斷。FLI1對診斷ESFT的特異性優(yōu)于CD 99，但敏感性略低。一項回顧性分析顯示，388例尤文肉瘤患者中344例（89%）表達FLI1[8]。本組FLI 1陽性表達率為80%（20/25）。聯(lián)合CD 99和FLI1可提高ESFT診斷的特異性，但CD99和FLI1也可表達于其他腫瘤細胞中[9]。近年發(fā)現(xiàn)同源框蛋白NKX2.2作為EWSR1-FLI1的轉(zhuǎn)錄靶點，可作為鑒別ESFT的一種有效的免疫組化標記物[10-11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NKX2.2在ESFT和非ESFT腫瘤中表達率分別為93%和11%[10]。有研究報道NKX2.2在ESFT中表達的敏感性為80%，特異性為84%，并進一步證明聯(lián)合檢測NKX2.2和CD99對尤文肉瘤診斷的特異性可達98%[12]。但值得注意的是，NKX2.2在間充質(zhì)軟骨肉瘤、黑色素瘤、CIC重排肉瘤或BCOR-CCNB3肉瘤等腫瘤細胞中也可表達[13]。本研究中NKX 2.2陽性表達率為80%，與文獻報道類似，近兩年NKX2.2已作為我院疑似ESFT者的常規(guī)免疫組化檢測標記。此外，一項對174例樣本的組織芯片檢測結(jié)果提示，免疫組化標記物BCL-11B和/或GLG1的高表達對尤文肉瘤的診斷特異性可高達96%，具有快速、簡便、經(jīng)濟的特點，可顯著減少誤診，目前正在進行前瞻性研究的驗證中[14]。

ESFT具有特異性的基因融合，85%表現(xiàn)為EWSFLI1融合[15]，約10%為EWS-ERG[16]，其他形式的易位比較罕見，如FUS相關(guān)基因融合等[17-18]。針對組織學與ESFT相似但并不具備EWSR1融合基因的小圓細胞腫瘤，被稱為“尤文樣肉瘤”，包括CIC基因重排肉瘤，BCOR基因重排肉瘤等[19]，治療方案參考ESFT。本組35例患兒進行了EWSR1基因檢測，91%（32/35）存在易位，3例EWSR1融合基因陰性。因本院病理科采用的是EWSR 1基因分離探針，故在除外標本制作問題后，尚需考慮是否為非EWSR 1比如FUS相關(guān)基因融合，必要時可進行其他相應(yīng)探針檢測。同時也需考慮是否為尤文樣肉瘤可能，可加做CIC、BCOR融合基因。

局灶性ESFT患者的3 y-OS為72%～86%，3 y-EFS為57%～73%[20-22]。遠處轉(zhuǎn)移者3 y-OS僅20%～30%[23-24]，通過高劑量化療和移植可將轉(zhuǎn)移患者5 y-OS從21%提高到47%[25]。相關(guān)研究統(tǒng)計分析美國SEER數(shù)據(jù)庫中1 100例尤文肉瘤，發(fā)現(xiàn)整體3y-OS為70.46%[26]。另有研究報道16例兒童尤文肉瘤的3y-OS為69%，3y-EFS為63%[27]。本研究患兒中位隨訪時間35個月，整體3y-OS為（68.2±6.9）%，3y-EFS（63.4±7.2）%，其中非轉(zhuǎn)移組患兒的3y-OS為（78.7±7.2）%，轉(zhuǎn)移組患兒3y-OS（20.6±16.1）%，與文獻報道類似。有研究顯示診斷時存在遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤原發(fā)于中軸部位，腫瘤直徑＞8 cm者預后不良，其中遠處轉(zhuǎn)移為獨立預后不良因素[25]。本研究經(jīng)單因素分析提示有無轉(zhuǎn)移、發(fā)病部位、腫瘤大小、手術(shù)是否完整切除、是否聯(lián)合治療、是否放療是影響患兒預后的因素，其中有無轉(zhuǎn)移、是否完整手術(shù)切除和是否接受聯(lián)合治療是影響本組患兒的獨立預后因素，而性別、腫瘤性質(zhì)來源、確診時間與預后無關(guān)，與文獻報道相似[25-26]。

ESFT發(fā)病率較低，容易誤診，一旦發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移則預后較差。ESFT的最終確診有賴于組織病理學，聯(lián)合鏡下形態(tài)特征、免疫組化及特異的融合基因檢測，可提高診斷率。