周琦浩 寧方穎 李雙雙

1 浙江省人民醫(yī)院望江山院區(qū) 浙江 杭州 310024

2 浙江省人民醫(yī)院 浙江 杭州 310014

3 浙江省腫瘤分子診斷與個體化治療重點實驗室 浙江 杭州 310014

本研究選取單純的益氣養(yǎng)陰中藥（黃芪、太子參、女貞子、旱蓮草、麥冬），制備大鼠含藥血清，聯合化療藥（阿糖胞苷、喜樹堿、紫杉醇），共同作用于人白血病細胞系KG1α細胞，觀察細胞的增殖抑制率、凋亡、細胞周期等。探討益氣養(yǎng)陰方聯合化療藥對KG1α細胞活性的影響和機制。

1 實驗材料

1.1 動物和細胞株：采用8周齡、清潔級雄性Wistar大鼠36只，體重200g±20g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。KG1α細胞株購于BNCC細胞庫。

1.2 藥物及試劑：中藥材由杭州華東醫(yī)藥有限公司提供。喜樹堿、阿糖胞苷、紫杉醇：Aladdin公司。GAPDH抗體：CST公司；CD44、P21、survivin、SDF-1：abcam公司。

2 實驗方法

2.1 藥物制備及劑量：益氣養(yǎng)陰方：黃芪、太子參各30g，女貞子21g，旱蓮草18g，麥冬15g。藥液煎煮按照常規(guī)水提法進行：即煎煮前先用涼水浸泡30min，煎煮2次。濃縮至1.14g/ml，冷卻分裝，4℃?zhèn)溆?。根據“動物與人體的每公斤體重劑量折算系數表”來計算大鼠灌胃中藥的劑量。對照組給予等量生理鹽水。

2.2 含藥血清的制備：將大鼠隨機分為空白對照組和含藥血清組，分2次給灌胃（9∶00am、3∶00pm），灌胃7天。末次給藥2h后，大鼠稱重，按3.8ml/kg的量用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取血前應探明心臟搏動最強部位，通常在胸骨左緣正中，選心跳最明顯的部位作穿刺。滅活。-20℃冷凍保存?zhèn)溆茫?個月內用完。若是4℃保存，1周內用完。

2.3 細胞培養(yǎng)：KG1α細胞的培養(yǎng)條件：含10%FBS的IMDM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4 CCK8檢測細胞活力：取正常培養(yǎng)的處于對數期的細胞鋪96孔板。含藥血清分為：5%、10%、15%、20%4個濃度血清，化療藥物作用濃度：阿糖胞苷 160μg/ml，喜樹堿0.1μg/ml，紫杉醇 50μg/ml。設置組別為：空白對照組，空白血清對照組，單獨含藥血清組，單獨化療藥組，含藥血清聯合化療藥組。藥物作用細胞0h、12h、24h、48h、72h。每孔加入10μl CCK8檢測液的工作液，37℃避光反應2h，450nm處讀取各孔OD值。實驗結果按下式計算：細胞存活率（%）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

2.5 流式檢測凋亡：細胞鋪6孔板，加入藥物處理后分別于12h、24h、48h后收集細胞樣本進行凋亡檢測。收集細胞重懸，加入5μl的Annexin V-FITC混勻后室溫避光孵育15min，加5μl的PI混勻后，室溫避光孵育5min；加200μl的1×Binding Buffer流式上機檢測。

2.6 流式檢測細胞周期：細胞鋪板，換成無血清的培養(yǎng)基同步化24h；加入藥物處理后分別于12h、24h、48h后收集細胞樣本進行周期檢測。收集細胞，無水乙醇固定好的細胞，水化，離心收集，PBS清洗，加入1ml的 Reagent A溶液，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育30min。流式上機檢測。

2.7 WB檢測蛋白：細胞鋪板，加入不同藥物和含藥血清處理，藥物作用48h。制備蛋白樣品，進行蛋白濃度測定，聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL化學發(fā)光顯影。導出照片后在Image J軟件下分析各條帶光密度。

3 實驗結果

3.1 細胞活力結果：①含藥血清對KG1α細胞有一定的增殖抑制作用，12h最為明顯，抑制作用隨著時間推移而減弱，這可能與血清衰老相關；以15%抑制作用最為明顯（圖1）。②阿糖胞苷對于KG1α細胞的抑制效果不明顯，直到在72h才開始出現輕度抑制細胞增殖（增殖率86.6%±1.1%），無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但在含藥血清的作用下，阿糖胞苷對細胞的抑制明顯增加，從作用12h-5%的含藥血清開始抑制明顯（72.4%±8.3%），48h-15%含藥血清最為明顯（65.3%±4.1%），相比于對照組以及同時間點同濃度的阿糖胞苷有統(tǒng)計學意義。③喜樹堿在與細胞作用12h出現抑制效果(15%空白血清77.9%±2.6%)，并隨著時間增加而增加；在含藥血清的作用下，抑制更明顯（48h15%空白血清58.1±2.9%VS含藥血清27.1%±3.8%），對于空白組和同時間同濃度的單用喜樹堿組有顯著統(tǒng)計學意義。④紫杉醇對于細胞的抑制率不明顯，在72h出現一部分的抑制率（72h15%空白血清68.1%±0.2%）；但在含藥血清作用下，12h即出現明顯抑制（12h15%空白血清85.9%±6.4%VS含藥血清53.6%±1.8%），相比于空白組和同濃度血清組有統(tǒng)計學意義。因15%含藥血清效果較為明顯，后面的實驗濃度采用血清濃度為15%，因72h細胞老化比較明顯，故后續(xù)實驗不再加入。

圖1 不同濃度時間的含藥血清的KG1α細胞增殖抑制率

3.2 凋亡結果：在15%濃度血清下，12h、24h細胞凋亡并不明顯，48h各組細胞出現凋亡（圖2）?？瞻籽?化療藥組，各組凋亡情況差異不大；但化療藥聯合含藥血清48h后，阿糖胞苷、紫杉醇比空白血清化療藥組的細胞凋亡更加明顯，有統(tǒng)計學意義（P＜0.005）。

圖2 不同時間點各組細胞的凋亡情況

3.3 細胞周期結果：阿糖胞苷阻滯細胞在G1期，與對照組相比，3個時間點對照組+阿糖胞苷組G1期都延長；紫杉醇能夠明顯阻滯細胞的G2/M期，與對照組相比，3個時間點單用紫杉醇組G2/M期都延長；喜樹堿阻滯細胞在S期和G2/M期，與對照組相比，3個時間點單用喜樹堿組S期和G2/M期都延長。且各給藥組48h均出現了不同程度的凋亡峰和碎片區(qū)。但含藥血清聯合化療藥組與對照組對細胞周期的影響差異不大。

3.4 WB結果：由WB顯示的蛋白變化（圖3）可以看出：阿糖胞苷能使細胞的CD44蛋白明顯下降，聯合含藥血清后使下調稍增加；喜樹堿能輕度增加CD44的表達，聯合含藥血清后表達更強；紫杉醇能使細胞的CD44表達稍下降，含藥血清組下降更為明顯。阿糖胞苷、喜樹堿使細胞的P21稍下調，聯合含藥血清組，下調進一步增加；紫杉醇使細胞的P21下降明顯，含藥血清進一步加強下調。阿糖胞苷能下調survivin表達，含藥血清稍加強此作用；喜樹堿、紫杉醇對survivin作用不明顯，紫杉醇聯合含藥血清能下調survivin表達。阿糖胞苷能明顯下調細胞SDF-1蛋白；喜樹堿對SDF-1變化不是很明顯；紫杉醇能下調SDF-1，含藥血清組加強此作用。

圖3 細胞的CD44、P21、suvivin、SDF-1蛋白表達情況

4 討論

目前，治療白血病的方式主要是采用聯合化療或骨髓移植。骨髓移植存在著配型難、移植物抗宿主病、復發(fā)等諸多問題，而化療藥對機體免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的損傷也十分嚴重，并且許多患者易出現耐受。因此能找到增敏減毒有效的方法，抑制白細胞細胞增生誘導其凋亡、增加化療藥敏感性，將會開啟治療血液腫瘤的新篇章。隨著現代技術的發(fā)展，中藥的抗腫瘤作用得到了更好研究和運用。根據其臨床表現及發(fā)展特點，本病可歸為中醫(yī)學“虛勞”“癥瘕”等范疇。根據《黃帝內經》“邪之所湊，其氣必虛”的理論，白血病的發(fā)生與體內正氣不足、易感邪氣有關。但毒邪入侵一般不是馬上發(fā)病，有一個潛伏期，毒邪久戀，暗耗氣血，耗竭陰津，陰津虧虛，則氣無所依附，從而氣更虛。故益氣養(yǎng)陰法是中醫(yī)藥治療白血病的方法之一。在本研究中，用來制備含藥血清的益氣養(yǎng)陰方主要由益氣的黃芪、太子參，和養(yǎng)陰的女貞子、旱蓮草、麥冬組成，未加入清熱解毒等祛邪之類的攻藥，探討補法治療白血病的機制。

在本研究中，人白血病細胞系KG1α對160μg/ml濃度的阿糖胞苷、50μg/ml的紫杉醇并不是很敏感，在與細胞作用48h之前，對細胞的增殖抑制、凋亡都不明顯，但聯合了含有益氣養(yǎng)陰方的大鼠血清后，白血病細胞的增殖抑制、凋亡都明顯增加。0.1μg/ml的喜樹堿對KG1α的抑制效果較明顯，含藥血清能進一步增強抑制作用。但含藥血清的加入并未改變化療藥對細胞周期的影響。

CD44是細胞膜上廣泛分布的一種跨膜糖蛋白，屬于黏附分子。能與膠原、透明質酸等細胞外基質相互作用而參與血管的新生及腫瘤細胞的黏附、增殖、分化、遷移及浸潤等過程。研究表明CD44高表達與造血系統(tǒng)惡性腫瘤病情進展及預后不良密切相關[1]。本研究中阿糖胞苷能大幅度降低白血病細胞KG1α的CD44表達，聯合益氣養(yǎng)陰中藥血清后，表達進一步下降。紫杉醇能輕度降低CD44的表達，聯合含藥血清后，下降更明顯。喜樹堿對其變化不明顯。SDF-1又稱前B細胞刺激因子，屬于趨化因子CXC亞家族成員，主要由骨髓基質細胞和不成熟的成骨細胞分泌，是包括造血干細胞和淋巴細胞在內的多種細胞的高效趨化因子。其配體有CXCR4和CXCR7等，SDF-1/CXCR4在Aml形成中發(fā)揮著重要作用，化療后CXCR4高表達提示預后不良[2]，CXCR7在正常人的骨髓、外周血、臍帶血中表達較低，但在白血病細胞高表達[3]。本研究中阿糖胞苷能大幅度降低白血病細胞KG1α的SDF-1蛋白表達，因降低作用明顯，聯合益氣養(yǎng)陰中藥血清后蛋白并未進一步下降。紫杉醇能輕度降低SDF-1的表達，聯合含藥血清后，下降更明顯。喜樹堿對其變化不明顯。P21是細胞周期蛋白，可以抑制周期蛋白依賴性激酶的活性，對細胞周期發(fā)揮調控作用。本研究中阿糖胞苷、喜樹堿能輕度下降P21蛋白表達，紫杉醇能較明顯地降低其表達，聯合含藥血清后下降更明顯。但是流式細胞檢測，聯合含藥細胞周期變化不明顯。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，參與細胞凋亡。

在本研究中可以觀察到益氣養(yǎng)陰含藥血清對白血病細胞KG1α體外的抑制作用，使對阿糖胞苷、紫杉醇不敏感的KG1α細胞在12h即出現增殖被抑制的效果，并且細胞凋亡進一步增加。本實驗的含藥血清中雖無“祛邪”的成分，但其“益氣養(yǎng)陰”的作用使KG1α細胞發(fā)生了改變，對化療藥更為敏感，細胞增殖抑制、凋亡都進一步加強，這可能與CD44、SDF-1等蛋白表達改變相關。血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由多種蛋白和細胞因子參與其調控的，其具體機制有待更深入的研究。