李 瑩,瞿 浩,何靜怡,劉天飛,王 劼,王 艷,舒鼎銘,羅成龍
(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所/畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640)
【研究意義】雞胚蛋是受精雞蛋孵化至一定天數(shù)后尚未破殼可食用的雞蛋[1]。早在明朝,《本草綱目》就有記載:“雞胚蛋有治頭痛、偏頭痛、頭瘋病及四肢瘋瘴之功能,童叟弱者常食之,有健脾胃作用,遂而起到強(qiáng)身健體之功效”。在孵化過(guò)程中,雞胚蛋提供了雛雞生長(zhǎng)發(fā)育所必需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此雞胚蛋被認(rèn)為是有生命力的蛋,民間有“喜蛋”“活珠子”“毛蛋”等俗稱[2]。雞胚蛋是民間食補(bǔ)佳品,在我國(guó)南方以及日本、韓國(guó)等東南亞國(guó)家一直有食用雞胚蛋的習(xí)俗[3-4]。與鮮雞蛋相比,雞胚蛋中對(duì)人體有利的物質(zhì)增加,如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、不飽和脂肪酸、牛磺酸及免疫球蛋白等,而總糖、總脂肪、膽固醇等不利物質(zhì)明顯下降[4-5]。雞胚混懸液或凍干粉可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗應(yīng)激、抗衰老等[6-10],雞胚除常規(guī)的“喜蛋”“活珠子”產(chǎn)品外,雞胚保健食品、雞胚營(yíng)養(yǎng)粉等新型雞胚制品也應(yīng)運(yùn)而生。雞胚蛋作為傳統(tǒng)的功能性食品,因其具有提高免疫力的功效而被廣泛食用,對(duì)其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制進(jìn)行科學(xué)研究與驗(yàn)證具有重要意義。
【前人研究進(jìn)展】外泌體(Exosomes)是一種由細(xì)胞分泌的胞外囊泡,于1983年在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn),1987年Johnstone對(duì)其命名[11]。外泌體含有蛋白質(zhì)、非編碼RNA(miRNA、lncRNA等)、mRNA、脂質(zhì)等功能物質(zhì),并在細(xì)胞間信息傳遞、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫調(diào)控、代謝物清除及凝血等方面發(fā)揮重要作用[12-13]。研究表明,外泌體所含小RNA,可以穩(wěn)定存在并推測(cè)能夠通過(guò)囊泡運(yùn)輸進(jìn)入目的細(xì)胞,參與機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原遞呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等[14]。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李學(xué)偉教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)乳汁外泌體內(nèi)的miRNA在高溫、酸性、凍融和外源RNA酶處理等條件下免受內(nèi)源性RNA酶的降解作用,以一種非常穩(wěn)定的狀態(tài)存在,由此推測(cè)外泌體miRNA可能通過(guò)乳汁的方式從消化道黏膜表皮細(xì)胞直接被子代攝入[15-16]。人食用牛乳4~6 h后血漿中檢測(cè)到高含量miR-29b和miR-200c(牛乳富含miRNAs),牛奶消耗后血液?jiǎn)魏思?xì)胞中的矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2,miR-29b的已知靶標(biāo))的表達(dá)增加31%[17];金銀花的MIR2911通過(guò)飲食方式傳遞至小鼠外周血和肺臟,并通過(guò)靶向聚合酶堿性蛋白2(Polymerase basic protein 2, PB2)和非結(jié)構(gòu)蛋白1(Nonstructural protein 1, NS1)基因抑制甲型流感病毒的復(fù)制;生姜外泌體miRNAs可以調(diào)節(jié)腸道菌群改善腸道健康[19]。上述研究說(shuō)明食物中外泌體的miRNAs可能是調(diào)節(jié)人類基因的食源性生物活性物質(zhì)。近年來(lái),血液、唾液、尿液、乳汁、細(xì)胞培養(yǎng)液等液體樣本中的外泌體分離及功能得到深入研究,而組織樣本中外泌體的分離及功能研究報(bào)道鮮見(jiàn)?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】作為傳統(tǒng)的食補(bǔ)佳品,雞胚蛋中生物活性物質(zhì)的傳遞及其可能的作用機(jī)制尚不清楚,所含的外泌體及其攜帶的miRNAs對(duì)人類健康如何發(fā)揮作用值得我們探索,然而目前既無(wú)適用于動(dòng)物組織中外泌體分離純化的標(biāo)準(zhǔn)方法,也無(wú)適用的商業(yè)化試劑盒,阻礙了雞胚外泌體功能的深入研究?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以雞胚為素材,綜合采用樣品前處理、超速離心、液體樣本外泌體提取的商業(yè)化試劑盒分離雞胚組織來(lái)源的外泌體,比較各方法所獲外泌體含量與純度,為后續(xù)深入解析雞胚中活性物質(zhì)及其作用機(jī)制提供依據(jù)。
從廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所家禽試驗(yàn)場(chǎng)收集處于產(chǎn)蛋高峰期的惠陽(yáng)胡須雞受精蛋30枚。于收集當(dāng)天置于數(shù)字孵化器中孵化,孵化條件為37 ℃、相對(duì)濕度65%~75%,每小時(shí)自動(dòng)翻蛋1次,孵化至13 d時(shí),取出雞胚蛋終止孵化,選擇大小及重量相近的胚蛋12枚,分為3組,每組4枚,用于后續(xù)處理。
主要試劑:Ⅲ型膠原酶,美國(guó)Worthington Biochemical公司;無(wú)菌PBS、DMEM培養(yǎng)基、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自Thermo Scientific公司;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;exoEasy Maxi kit試劑盒購(gòu)自Qiagen公司;ExoQuick ULTRA EV Isolation kit試劑盒購(gòu)自System Biosciences公司;流式檢測(cè)CD63-Antibody-FITC和CD81-Antibody-FITC,購(gòu)自美國(guó)BD生物科學(xué)公司。
主要儀器:數(shù)字孵化器(Digital incubator Rcom PRO 50 PX-50),韓國(guó)Autoelex 有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科技有限公司;低溫離心機(jī),Thermo Fisher Scientific公司;超速離心機(jī)(XPN-100),美國(guó)Beckman Coulter有限公司;透射電鏡(JEM-1200EX),日本電子株式會(huì)社(JEOL);納米流式檢測(cè)儀(Flow NanoAnalyzer,nanoFCM),廈門福流生物科技有限公司;流式細(xì)胞儀(BD accuri C6 flow cytomenter),美國(guó)BD生物科學(xué)公司。
1.2.1 雞胚組織消化 用75%酒精擦拭胚蛋表面后置于超凈工作臺(tái),用無(wú)菌鑷子從雞蛋鈍端開(kāi)孔并取出雞胚,將分離到的雞胚經(jīng)無(wú)菌PBS漂洗2~3次,去除喙、翅、腳等。用滅菌的剪刀輕柔剪碎,并經(jīng)0.5% Ⅲ型膠原酶于37 ℃消化30 min,期間輕柔混勻消化液,收集消化樣品,加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑,并定容至50 mL,用于后續(xù)離心。
1.2.2 雞胚組織中外泌體分離 雞胚組織經(jīng)酶消化、差速離心、過(guò)濾等前處理后,分別采用超速離心法(UC)、蔗糖墊超速離心法(SDUC)、exoEasy Maxi kit膜 親 和 法(exoEasy) 以 及exoQuick ULTRA EV Isolation kit聚乙二醇沉淀法(exoQuick)4種方法進(jìn)行外泌體的分離、純化,操作流程如圖1所示,所獲樣品經(jīng)PBS重懸或洗脫液洗脫,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后分裝,分別標(biāo)記為A、B、C和D,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
圖1 4種雞胚組織中外泌體分離提取方法流程Fig. 1 Four methods process for the isolation and extraction of exosomes from chicken embryo tissues
1.2.3 外泌體蛋白濃度測(cè)定 按照BCA試劑盒操作說(shuō)明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并測(cè)定A、B、C和D樣品蛋白濃度。取各稀釋濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)蛋白質(zhì)樣品各25 μL,加入微孔板中,然后加入200 μL工作液,并在振蕩器上震蕩30 s,充分混勻,將微孔板密封,在37 ℃孵育30 min,將微孔板冷卻到室溫,使用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在562 nm處的吸光值。
1.2.4 外泌體鑒定 采用透射電鏡觀察囊泡形態(tài)、大小,將制備好的外泌體樣品10 μL滴于2 mm載樣銅網(wǎng)上,沉淀3 min,用濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸去浮液;經(jīng)PBS漂洗后用3%磷鎢酸負(fù)染;室溫干燥5 min,將載樣銅網(wǎng)置于電鏡樣品室,80 kV下觀察樣品形態(tài)并拍照。采用納米流式nanoFCM檢測(cè)囊泡大小分布及其囊泡顆粒濃度,該法利用二氧化硅標(biāo)準(zhǔn)球建立散射光強(qiáng)度與顆粒粒徑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,可將相同條件下待測(cè)樣品的散射強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為粒徑,獲得待測(cè)樣品的粒徑分布;通過(guò)檢測(cè)已標(biāo)定濃度的熒光微球的個(gè)數(shù)快讀得到特定進(jìn)樣壓力的樣品流體積流量,在相同的進(jìn)樣壓力條件下檢測(cè)待測(cè)樣品,獲得樣品的顆粒濃度,根據(jù)儀器操作說(shuō)明參照粒徑標(biāo)準(zhǔn)品和已標(biāo)定濃度的熒光微球的適宜檢測(cè)條件對(duì)外泌體樣品進(jìn)行測(cè)定。外泌體標(biāo)記蛋白流式細(xì)胞儀檢測(cè),用100 μL無(wú)菌PBS復(fù)勻外泌體,密封冰上保存,樣品分別與含CD63和CD81抗體磁珠孵育、染色,并留取陰性對(duì)照,按照儀器操作進(jìn)行檢測(cè)。
采用BCA法對(duì)雞胚組織中外泌體進(jìn)行蛋白定量分析,得到A、B、C和D樣品的蛋白濃度分別為 274.56±18.19、94.81±10.74、793.86±28.81、1 301.28±180.26 μg/mL,由高到低依次為D>C>A>B,不同方法獲得的外泌體蛋白濃度存在極顯著差異。聚乙二醇沉淀法獲得外泌體D,同時(shí)可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合沉淀,因此所獲外泌體中可能參雜其他雜蛋白,蛋白濃度最高。膜親合法獲得外泌體C,該方法運(yùn)用了囊泡的通用特性,可分離到所有類型的囊泡,因此C樣品蛋白濃度也較高。A、B分別為經(jīng)超速離心和蔗糖墊超速離心獲得的外泌體,前者沉淀了所有對(duì)應(yīng)離心力范圍的物質(zhì),后者相對(duì)富集了30%蔗糖密度墊附近的囊泡顆粒,因此A樣品蛋白濃度較B樣品高。
2.2.1 形態(tài)鑒定 在相同條件下利用透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, TEM)觀察4種方法分離獲得的樣品,均發(fā)現(xiàn)獲得呈圓形或橢圓形的囊泡顆粒,具有典型的杯狀,在囊泡外周可見(jiàn)膜性結(jié)構(gòu)(圖2),從微囊結(jié)構(gòu)、形態(tài)可判定樣品均為外泌體。各外泌體樣品囊泡顆粒大小、呈現(xiàn)狀態(tài)存在差異,A、B、C樣品在電鏡下均能看到大量具有外泌體樣結(jié)構(gòu)的囊泡,D樣品雖然也有一些外泌體樣結(jié)構(gòu),但大部分出現(xiàn)聚團(tuán),這可能與提取方法的特性有關(guān)。
圖2 透射電鏡檢測(cè)雞胚組織來(lái)源的外泌體Fig. 2 Embryo tissue-derived exosomes under TEM
2.2.2 粒徑分布及濃度檢測(cè) 根據(jù)nanoFCM測(cè)得的囊泡直徑分布(表1)可知,4種方法獲得的囊泡直徑范圍主要分布在50~145 nm之間,且直徑均值集中在70~80 nm范圍,其中C、D樣品直徑分布范圍寬,而B樣品直徑分布范圍最窄。4種方法獲得囊泡濃度由高到低依次為D>C>A>B,與外泌體蛋白濃度變化趨勢(shì)一致。同時(shí),傳統(tǒng)方法與商業(yè)化試劑盒分離到的囊泡數(shù)量存在極顯著差異。A、B均采用超速離心法,但B樣品為在30%蔗糖密度墊處富集的囊泡,囊泡顆粒濃度和種類均少于A樣品。此外,因雞胚組織由多種細(xì)胞組成,故分離到的囊泡異質(zhì)性特征明顯,大小、直徑均有差異。
表1 雞胚組織中胞外囊泡的納米流式檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of embryo tissue-derived extracellular vesicles under nanoFCM
圖3 雞胚組織中外泌體標(biāo)志蛋白的流式檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Detection results of embryo tissue-derived exosome marker proteins under flow cytometry
2.2.3 標(biāo)志蛋白鑒定 為進(jìn)一步確認(rèn)和比較分析所獲外泌體情況,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)外泌體標(biāo)志蛋白(CD63、CD81)熒光抗體孵育的外泌體樣品。由圖3可知,4個(gè)樣品中均檢測(cè)到一定比例的陽(yáng)性囊泡顆粒,說(shuō)明分離到的外泌體具有胞外囊泡標(biāo)志蛋白。本研究中CD63和CD81陽(yáng)性比例存在差異,其中CD63陽(yáng)性率為B(77.0%)>D(71.7%)>C(68.2%)>A(16.3%),CD81陽(yáng)性率為B(81.2%)>D(79.0%)>C(78.9%)>A(48.6%),但兩者陽(yáng)性率變化趨勢(shì)一致。從標(biāo)志蛋白陽(yáng)性率來(lái)看,B方法分離獲得的外泌體純度最好。
國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用不同的商業(yè)化試劑盒、超速離心等方法研究了各種液體樣本(血清、乳汁、細(xì)胞上清等)中的外泌體,僅從所獲外泌體的蛋白濃度、顆粒濃度指標(biāo)判定,商業(yè)化試劑盒普遍優(yōu)于超速離心法,且以聚乙二醇沉淀法開(kāi)發(fā)的試劑盒分離產(chǎn)量最高[20-24],因聚乙二醇沉淀法分離外泌體試劑盒出現(xiàn)早、應(yīng)用廣,有效解決了超速離心耗時(shí)長(zhǎng)及其對(duì)技術(shù)與平臺(tái)要求高的問(wèn)題,因此相關(guān)研究報(bào)道最多。該方法具有快速、簡(jiǎn)單、易操作、樣本處理體積范圍廣的優(yōu)勢(shì)[25],部分研究者從經(jīng)濟(jì)成本、蛋白產(chǎn)量和囊泡濃度指標(biāo)考量推薦使用基于聚乙二醇沉淀法開(kāi)發(fā)的試劑盒,如ExoQuik試劑盒(System Bioscience公司)和Total Exosome Isolation Kit試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)[21,25]。但是,隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)聚乙二醇沉淀法對(duì)各類囊泡均無(wú)選擇性,除了獲得外泌體外,同時(shí)還能獲得其他細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體等[26]?;谀びH和法分離外泌體的試劑盒具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),且可根據(jù)外泌體與雜質(zhì)有無(wú)膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分,因此樣本是否存在細(xì)胞和細(xì)胞碎片等有膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)是該方法成敗的關(guān)鍵。
組織內(nèi)細(xì)胞間外泌體在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但組織中外泌體分離、純化及其功能研究報(bào)道較少。鑒于目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的組織樣本外泌體分離方法,本研究采用Ⅲ型膠原酶消化、差速離心和過(guò)濾等進(jìn)行前處理,與前人采用的前處理方法不盡相同。對(duì)于富含外泌體的腦組織,Gallart-Palau等[27]采用機(jī)械均質(zhì)化和過(guò)濾進(jìn)行腦組織樣品前處理;Vella等[28]采用酶消化、離心進(jìn)行前處理;對(duì)于脂肪組織,Zhang等[29]采用離體培養(yǎng)3 d后通過(guò)收集培養(yǎng)液分離外泌體,該方法獲得了組織分離培養(yǎng)條件下所分泌的外泌體,組織細(xì)胞離體培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)因環(huán)境的改變影響外泌體的釋放及其所攜帶的物質(zhì)成分。近期兩個(gè)不同研究團(tuán)隊(duì)先后報(bào)道了人腎癌組織和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組織中外泌體的分離與純化,在樣品前處理方面,均采用了膠原酶消化、離心、過(guò)濾,與本研究采用的前處理方法相似,在分離、純化方面采用超速超速離心或蔗糖梯度離心,與本試驗(yàn)UC和SDUC法基本一致,均采用 100 000~120 000 g的離心條件[30-31]。
由TEM、nanoFCM和流式細(xì)胞檢測(cè)可知,4種方法均可獲得具有典型形態(tài)特征的外泌體囊泡,囊泡形態(tài)、粒徑范圍及標(biāo)志蛋白與乳汁[32]、尿液[33]、血漿[34]、子宮腹水[35]及細(xì)胞培養(yǎng)液[36]中分離的外泌體特征基本一致。本研究中商業(yè)化試劑盒分離到的囊泡數(shù)量是超速離心法的10倍以上。Tang等[37]比較了超速離心法和兩種商業(yè)化試劑盒(exoQuick和TEI)分離提取細(xì)胞培養(yǎng)液和血清中外泌體的效果,Helwa等[34]分析了超速離心與miRCURY、exoQuick和TEI 3種商業(yè)化試劑盒提取血清外泌體的效果,均發(fā)現(xiàn)商業(yè)化試劑盒的外泌體顆粒濃度遠(yuǎn)高于超速離心,與本研究結(jié)果一致。然而聚乙二醇沉淀法分離的外泌體蛋白濃度最高且出現(xiàn)聚團(tuán),說(shuō)明分離到的樣品中含有大量其他物質(zhì),這與Tang等[37]、Caradec等[21]分離血清、細(xì)胞培養(yǎng)液等液體樣本外泌體的研究報(bào)道結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明,不同分離方法獲得的外泌體樣品的標(biāo)志蛋白含量不同,這與Royo等[38]采用WB檢測(cè)不同方法獲得的尿液中外泌體樣品標(biāo)志蛋白(CD9、CD10、CD63、TSG101等)得到的結(jié)果相似;SDUC法分離到的外泌體標(biāo)志蛋白陽(yáng)性率最佳,而Ding等[20]采用WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD63和TSG101發(fā)現(xiàn),exoQuick分離的外泌體其標(biāo)記蛋白陽(yáng)性率高于超速離心,與本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果不同,這可能與所采取的檢測(cè)方法及其抗體結(jié)合能力有關(guān)。
目前,外泌體純化產(chǎn)品不斷涌現(xiàn),綜合比較發(fā)現(xiàn),不同方法獲得的外泌體在蛋白濃度、囊泡顆粒濃度、直徑大小分布、RNA總量、小RNA表達(dá)譜、蛋白質(zhì)譜等方面均存在差異,尤其小RNA表達(dá)譜、蛋白質(zhì)譜差異較大[20,22,39]。不同研究團(tuán)隊(duì)均發(fā)現(xiàn)超速離心獲得的血漿外泌體樣品RNA含量及蛋白純度優(yōu)于商業(yè)化試劑盒[34,37],且結(jié)合密度梯度純化獲得的樣品純度最高[22-23],但產(chǎn)量遠(yuǎn)低于商業(yè)化試劑盒。針對(duì)各種商業(yè)化試劑盒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),基于膜親和法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)液和血漿外泌體RNA純度高、質(zhì)量好[22]。分析外泌體樣本蛋白質(zhì)譜發(fā)現(xiàn),商業(yè)化試劑盒中聚乙二醇沉淀法獲得較高的外泌體產(chǎn)量[20],但含有大量非外泌體顆粒(如血清蛋白聚集體),因此外泌體純度很低[34]。
不同方法各有優(yōu)缺點(diǎn),超速離心法作為外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn),仍是最常用的外泌體純化手段。同時(shí),目前僅有的少量從組織中分離純化外泌體的報(bào)道均采用超速離心法,但超速離心法費(fèi)時(shí)、對(duì)設(shè)備要求高,在多個(gè)循環(huán)中施加不同的離心力,有助于去除細(xì)胞碎片和其他污染物,使外泌體樣本純度更好,但也存在可能導(dǎo)致樣本中的外泌體損失及外泌體產(chǎn)量更低等缺陷。目前尚無(wú)針對(duì)組織樣本外泌體分離純化的商業(yè)化試劑盒,現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒均為針對(duì)液體樣本,其操作簡(jiǎn)單、高效,但試劑盒之間差異大,每種方法都不能有效分離到高純度的外泌體,不同方法獲得的外泌體中存在白蛋白、高密度脂蛋白和RNA結(jié)合蛋白(Argonaute 1和2)聚集體等污染,而這一比例的大小尚無(wú)確切數(shù)據(jù)支撐,需要進(jìn)一步鑒定[22,24]。因此,需根據(jù)試驗(yàn)材料、目的以及后續(xù)研究需要綜合評(píng)估選用適宜的分離純化方法,在得率與純度之間取得良好平衡。本研究在前處理的基礎(chǔ)上利用超速離心、蔗糖墊超速離心和商業(yè)化試劑盒進(jìn)行了組織中外泌體的分離比較,為后續(xù)開(kāi)展組織中外泌體分離及其功能研究奠定基礎(chǔ)。
本研究比較了超速離心法、蔗糖墊超速離心法、膜親和法以及聚乙二醇沉淀法分離雞胚組織中外泌體的效果,綜合考量外泌體的純度、形態(tài)、大小及其標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況,根據(jù)供試組織樣品來(lái)源、試驗(yàn)條件和目的可優(yōu)選蔗糖墊超速離心法或膜親和法,如需高純度外泌體可首選蔗糖墊超速離心法(SDUC),樣品稀有或不具備超速離心設(shè)備則選用膜親和法(exoEasy)。