楊 易，陳漢才，沈 卓，周 軒，黎庭耀，杜志煒，楊麗璇，張 艷

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.廣州市花都區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)管理中心，廣東 廣州 510800）

【研究意義】菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsenet Lee）是蕓薹科蕓薹屬中以菜薹為產(chǎn)品的一種蔬菜，是華南地區(qū)栽培規(guī)模最大的特產(chǎn)蔬菜之一，在華南地區(qū)的蔬菜周年供應(yīng)及出口創(chuàng)匯中起著舉足輕重的作用［1］。菜心具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，目前通過連續(xù)自交選育自交系及雜種親本的傳統(tǒng)育種方法存在自交系純合速度慢、整齊度差、育種周期長等諸多缺陷，且親本長時(shí)間單株選擇會(huì)造成近交衰退［2］。小孢子培養(yǎng)技術(shù)利用未成熟的雄性配子體在離體培養(yǎng)中受到脅迫處理后，其發(fā)育命運(yùn)由花粉向胚胎發(fā)育轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生并發(fā)育為成熟植株，加倍后形成純合的雙單倍體（Double haploid，DH），1～2年內(nèi)即可獲得大量基因型豐富且遺傳穩(wěn)定材料，在提高選擇效率和準(zhǔn)確度的前提下，可快速選育純系、縮短育種周期，已在作物遺傳育種中廣泛應(yīng)用［3］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自Lichter于1982年首次從油菜小孢子培養(yǎng)中獲得小孢子植株后，Sato報(bào)道了通過機(jī)械擠壓分離白菜小孢子，熱激培養(yǎng)獲得胚狀體體系，此后白菜類的小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展迅速，并在生產(chǎn)上得到推廣應(yīng)用［4-9］。朱允華等［10］對(duì)影響菜心游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體的主要因素研究表明，基因型對(duì)小孢子培養(yǎng)出胚率起決定性作用，花序低溫預(yù)處理、高溫起始培養(yǎng)和培養(yǎng)基成分均影響菜心游離小孢子胚狀體的誘導(dǎo)。曾小玲等［11］以11個(gè)不同基因型的菜心栽培品種為試材，研究不同培養(yǎng)條件對(duì)菜心游離小孢子胚誘導(dǎo)和植株再生的影響，結(jié)果有7個(gè)基因型材料獲得小孢子胚，不同基因型誘導(dǎo)成胚的頻率存在顯著差異，表明基因型是影響菜心小孢子胚發(fā)生的主要因素；小孢子第1天熱激培養(yǎng)用170 g/L高濃度蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后轉(zhuǎn)換成含130 g/L蔗糖培養(yǎng)基能顯著提高小孢子胚誘導(dǎo)率；激素配比6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.2 mg/L能促進(jìn)菜心小孢子誘導(dǎo)成胚。牛劉靜等［12-13］以增城菜心和連州菜心為試材進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，研究了不同基因型、細(xì)胞器抗氧化劑處理（VcNa）和植物生長調(diào)節(jié)劑（BR和TDZ）對(duì)小孢子胚胎發(fā)生及胚狀體再生成苗的影響，結(jié)果顯示培養(yǎng)基中適當(dāng)濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑可顯著提高小孢子胚的誘導(dǎo)率。與甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)模式相似，菜心的小孢子培養(yǎng)同樣受基因型、供體材料生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分、熱激處理?xiàng)l件等因素影響。【本研究切入點(diǎn)】盡管作物育種中誘導(dǎo)單倍體已被廣泛應(yīng)用，但其主要瓶頸是單倍體胚胎誘導(dǎo)缺乏或效率低下，形成單倍體胚胎的能力高度依賴于物種和基因型。不同物種的小孢子胚胎發(fā)生有其自身規(guī)律，且受供試植株生長環(huán)境、培養(yǎng)基成分及脅迫處理等多方面因素影響，在為特定作物或基因型建立有效培養(yǎng)系統(tǒng)前，需要克服一個(gè)或多個(gè)瓶頸。目前，在廣東高溫高濕的自然氣候條件下，露天種植環(huán)境下的菜心材料處于特定的生理狀態(tài)，菜心小孢子誘導(dǎo)率極低，培養(yǎng)方案需要根據(jù)具體情況開發(fā)或微調(diào)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過調(diào)整菜心小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，針對(duì)廣東高溫高濕的氣候環(huán)境，對(duì)秋冬季露天大田種植的不同基因型菜心材料進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，篩選具有穩(wěn)定性、廣適性、出胚效率高的培養(yǎng)基配方，以期為實(shí)現(xiàn)菜心育種親本的高效率選擇和快速純化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所葉菜豆類研究室提供的10份菜心為試材，材料名稱及類型見表1。2019年11月中旬在廣州市白云區(qū)試驗(yàn)基地大棚內(nèi)，穴盤播種育苗，三葉一心后移栽到大田，田間常規(guī)栽培管理；2019年12月中下旬至1月中旬花期取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。

表1 供試材料基本情況Table 1 Basic information of test materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菜心小孢子培養(yǎng)方法 參照Takahashi等［14］方法對(duì)菜心游離小孢子培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)。于晴天上午，取處于初花和盛花期生長健壯的菜心植株的主花序帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃低溫處理24 h。挑取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾，用84消毒液滅菌15 min后用無菌水沖洗3次，置于50 mL無菌離心管中，加入少量蔗糖濃度130 g/L的B5培養(yǎng)液，用玻璃棒研碎花蕾，經(jīng)直徑74.2 μm雙層尼龍網(wǎng)過濾，1 100 r/min離心5 min，沉淀小孢子，棄上清液，加入B5重懸，再離心，棄上清，用NLN培養(yǎng)液懸浮小孢子，分裝在直徑90 mm無菌培養(yǎng)皿中（10個(gè)花蕾/皿，NLN培養(yǎng)液 22 mL），Parafilm膜封口，每個(gè)處理10皿，3次重復(fù)。32℃黑暗培養(yǎng)48 h后，25℃黑暗培養(yǎng)10～15 d，待肉眼可見胚形成。培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到25℃搖床50 r/min黑暗培養(yǎng)至成熟子葉胚（培養(yǎng)約23 d），統(tǒng)計(jì)小孢子出胚數(shù)，計(jì)算出胚率。轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于25℃、光強(qiáng)3 000 lx、光照14 h/d條件下培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)基成分對(duì)菜心小孢子出胚率的影響設(shè)定100、130和160 g/L蔗糖濃度的NLN培養(yǎng)液和營養(yǎng)元素減半、100 g/L蔗糖濃度NLN培養(yǎng)液，簡稱為 NLN-10、NLN-13、NLN-16和1/2 NLN-10。分別觀察記錄不同培養(yǎng)液下小孢子的發(fā)育狀態(tài)及出胚情況。

1.2.3 6-BA和NAA對(duì)菜心小孢子胚誘導(dǎo)的影響 以NLN-10為培養(yǎng)基，選取6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）和NAA（萘乙酸）為培養(yǎng)基添加激素，6-BA濃度分別為0、0.1、0.2 mg/L，NAA濃度分別為0、0.01、0.1、0.15、0.2 mg/L，設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合，共6個(gè)處理，分離試驗(yàn)材料雜交2號(hào)菜心、雜交3號(hào)菜心、連州尖葉菜心和Rt19006的小孢子，加入不同激素配比的培養(yǎng)基中，每個(gè)處理30皿，32℃熱激48 h后25℃暗培養(yǎng)，23 d后統(tǒng)計(jì)子葉胚數(shù)量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型在不同培養(yǎng)基中菜心小孢子胚胎誘導(dǎo)率的差異比較

從表2可以看出，不同基因型的菜心胚狀體誘導(dǎo)率存在較大差異。在用于游離小孢子培養(yǎng)的10份不同基因型菜心材料中，有7份材料成功產(chǎn)生胚狀體，為增城遲菜心2號(hào)、雜交3號(hào)菜心、60天柳葉尖葉菜心、大青、Rt19006、17057、廣海甜菜薹。7份材料的胚狀體誘導(dǎo)率相差較大，NLN-10處理最易出胚的 Rt19006菜心胚狀體誘導(dǎo)率可達(dá)30.36胚/皿，出胚率最低的大青僅為3.45胚/皿，相差近10倍。而增城遲菜心1號(hào)、雜交2號(hào)菜心、連州尖葉菜心均未產(chǎn)生胚狀體?？梢姡蛐蛯?duì)胚狀體誘導(dǎo)率有決定性作用。

2.2 不同蔗糖濃度對(duì)菜心胚狀體發(fā)生的影響

蔗糖在小孢子離體培養(yǎng)中提供營養(yǎng)和維持細(xì)胞滲透壓。由表2可知，除增城遲菜心1號(hào)、雜交2號(hào)菜心、連州尖葉菜心3個(gè)材料沒有出胚外，100 g/L蔗糖濃度的NLN（NLN-10）誘導(dǎo)率最高、達(dá)30.46胚/皿，且這一規(guī)律在7個(gè)出胚材料中表現(xiàn)一致；在 1/2 NLN-10處理中，出胚率約為使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基NLN-10處理的2/3，但胚狀體的生長速度明顯快于NLN-10組；蔗糖濃度為130 g/LNLN（NLN-13）處理出胚率顯著降低，最高僅為14胚/皿，且該規(guī)律在7份出胚材料中表現(xiàn)一致；蔗糖濃度為160 g/L的NLN（NLN-16）處理未出現(xiàn)胚狀體。由此表明，蔗糖濃度為100 g/L和130 g/L（NLN-13）的NLN能夠誘導(dǎo)出胚狀體，但100 g/L NLN（NLN-10）蔗糖濃度最適于菜心小孢子的胚胎發(fā)生。

表2 不同基因型和培養(yǎng)基對(duì)菜心小孢子出胚率的影響（個(gè)/皿）Table 2 Effects of different genotypes and media on embryo production rates of microspore in Chinese flowering cabbages （embryo/dish）

2.3 不同激素配比對(duì)菜心胚狀體發(fā)生的影響

由表3可知，6組激素組合中，添加6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L的處理出胚效果最佳，雜交2號(hào)菜心和Rt19006出胚率分別達(dá)11.28、46.93胚/皿，是不加激素出胚率的1.98、1.54倍，而對(duì)不加激素處理中沒有出胚的材料雜交3號(hào)菜心、連州尖葉菜心的出胚沒有促進(jìn)作用；隨著激素濃度升高，出胚率中等的材料雜交2號(hào)菜心和出胚率相對(duì)高的材料Rt19006胚胎發(fā)生能力均有所下降?？梢?，一定濃度激素有促進(jìn)小孢子胚胎發(fā)生的作用，且對(duì)出胚相對(duì)率低材料的促進(jìn)作用高于出胚率高的；激素不能促使基因型頑固的材料出胚。

2.4 菜心小孢子離體培養(yǎng)形成再生植株的過程

游離小孢子經(jīng)釋放離體培養(yǎng)發(fā)育成子葉胚（圖1A）平均需要23～26 d。子葉胚接種至分化培養(yǎng)基（B5+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L +瓊脂13 g/L），置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。成熟的子葉胚接種見光起開始逐漸轉(zhuǎn)綠，且生長迅速；幼嫩的子葉胚接種后光照條件下一周才開始轉(zhuǎn)綠，且生長緩慢（圖1B）；而肉眼可見的球形胚接種到分化培養(yǎng)基后，個(gè)體變大，但不能轉(zhuǎn)綠，逐漸白化、褐化至死亡。子葉胚分化出側(cè)芽后，側(cè)芽接種到生根培養(yǎng)基（MS+ 6-BA 0.02 mg/L+ NAA 0.2 mg/L + 瓊脂12 g/L），7～15 d開始生根（圖1C），發(fā)育成一棵完整的再生植株（圖1C）。圖1為菜心游離小孢子培養(yǎng)從誘導(dǎo)出胚狀體到形成再生植株過程。據(jù)統(tǒng)計(jì)，成熟子葉胚接種至分化培養(yǎng)基后，最終能形成再生植株的比例為92.1%～98.3%，而球形胚最終能發(fā)育成再生植株的平均比例為0.34%，絕大部分球形胚從肉眼可見到直徑2～3 mm后停止發(fā)育。

表3 不同激素配比對(duì)菜心小孢子胚誘導(dǎo)率的影響Table 3 Effects of different hormone combinations on embryo induction rates of microspore in Chinese flowering cabbages

圖1 小孢子培養(yǎng)中植株再生過程Fig. 1 Plant regeneration during microspore culture

3 討論

本研究將10份菜心進(jìn)行小孢子離體培養(yǎng)，在相同條件下，70%材料成功誘導(dǎo)出子葉胚，而出胚率敏感型材料是不敏感材料的10倍。胚狀體的誘導(dǎo)能力與基因型密切相關(guān)，不同菜心品種小孢子培養(yǎng)產(chǎn)胚率存在明顯差異，這與前人研究結(jié)果［15-16］一致。

NLN培養(yǎng)基是蕓薹種作物小孢子培養(yǎng)常用配方，也有使用1/2NLN的報(bào)道，研究表明，1/2 NLN比全營養(yǎng)的NLN對(duì)白菜小孢子胚的誘導(dǎo)效果更好［17-18］。高濃度蔗糖調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓和提供能源，100～130 g/L蔗糖濃度的NLN是白菜類蔬菜小孢子培養(yǎng)常用培養(yǎng)基，也有使用150 g/L的報(bào)道，但是培養(yǎng)后期需要換到較低濃度的蔗糖培養(yǎng)基［19］。在現(xiàn)有研究報(bào)道中，大白菜中多采用130 g/L 的NLN（NLN-13），而在小白菜中，采用100 g/L NLN（NLN-10）或者1/2 NLN的都有報(bào)道，部分報(bào)道100 g/L的1/2NLN（1/2 NLN-10）的培養(yǎng)效果更佳。本試驗(yàn)中質(zhì)量濃度100 g/L的蔗糖培養(yǎng)基NLN-10，相較于NLN-13、NLN-16，顯著提高菜心小孢子產(chǎn)胚的數(shù)量。其原因是適當(dāng)?shù)臐B透壓可以使花粉小孢子沖破花粉外殼，并啟動(dòng)胚胎發(fā)育，130 g/L蔗糖相較于100 g/L蔗糖濃度高，也會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞分裂，但會(huì)阻礙細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育，在顯微鏡下可以看見后期細(xì)胞大部分出現(xiàn)空泡化而凋亡，因此100 g/L蔗糖更適合。而1/2 NLN-10培養(yǎng)基處理小孢子胚誘導(dǎo)率低于NLN-10處理，但胚胎生長速度快，推測(cè)由于該培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素減半，脅迫胚胎迅速發(fā)育，以完成生命周期的競(jìng)爭(zhēng)，造成生長速度不同。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加外源激素在白菜類葉用蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中有較多應(yīng)用，對(duì)胚胎發(fā)生的影響尚未取得一致的研究結(jié)果。Sato等［20］認(rèn)為NAA和6-BA對(duì)大白菜小孢子胚誘導(dǎo)無影響，曾小玲等［11］研究了NAA和6-BA的不同濃度配比對(duì)菜心胚誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明最適宜誘導(dǎo)菜心小孢子胚胎發(fā)生的激素濃度是0.05 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA。唐兵等［19］以20個(gè)不同基因型白菜栽培品種為供試材料，研究影響白菜游離小孢子胚誘導(dǎo)的因素，結(jié)果表明白菜小孢子胚胎誘導(dǎo)的激素最優(yōu)組合為6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L。在本研究中，不同激素組合和濃度對(duì)不同基因型小孢子出胚數(shù)的影響有顯著差異，在NLN-10誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA能極顯著提高小孢子子葉胚的數(shù)量；當(dāng)6-BA、NAA濃度上升至0.2 mg/L時(shí)，發(fā)育成子葉胚的數(shù)量下降，畸形胚數(shù)量增加，球形胚數(shù)量顯著增加，但絕大多數(shù)球形胚發(fā)育停滯，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，小孢子胚逐漸褐化。植物胚胎從受精開始，激素就開始合成并在胚胎發(fā)育建成中起到重要作用，并且生長素類激素在早期發(fā)育中隨著細(xì)胞數(shù)的增加導(dǎo)致濃度開始上升［21］，說明激素在胚胎形成中不可或缺；在本研究中，添加適量外源激素的處理小孢子出胚率顯著上升，說明離體培養(yǎng)的菜心小孢子胚在早期發(fā)育過程中自身激素合成缺乏，未能支持胚胎細(xì)胞持續(xù)發(fā)育，而添加外源激素處理與不加激素組對(duì)照相比，前者獲得更多數(shù)量的胚，說明在菜心小孢子培養(yǎng)中添加適量激素對(duì)胚胎發(fā)育具有促進(jìn)作用。而激素濃度提高到一定程度后，反而會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒害，使胚胎發(fā)育停滯。

4 結(jié)論

通過采用不同蔗糖濃度和激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)不同基因型菜心進(jìn)行小孢子離體培養(yǎng)的胚胎誘導(dǎo)率綜合分析發(fā)現(xiàn)，遺傳背景對(duì)小孢子的胚胎發(fā)生能力起決定性作用，7份材料獲得胚狀體，各材料間出胚率存在顯著差異，其中Rt19006胚產(chǎn)率最高；而改良培養(yǎng)基成分可以提高胚胎發(fā)生率，不同蔗糖濃度的NLN誘導(dǎo)率差異顯著，NLN-10誘導(dǎo)效果最佳，出胚率最高達(dá)30.46胚/皿。隨著蔗糖濃度的升高，出胚率顯著下降，NLN-13處理出胚率最高僅為14.27胚/皿，NLN-16處理出胚受到抑制，未出現(xiàn)胚狀體；在NLN-10中分別添加6-BA 0.1 mg/L和NAA 0.1 mg/L，能顯著提高出胚率，最高達(dá)46.93胚/皿，是不加激素NLN-10處理出胚率的1.5倍。但該激素組合對(duì)難出胚的試驗(yàn)材料無促進(jìn)出胚作用；當(dāng)6-BA和NAA濃度均達(dá)到0.2 mg/L時(shí)，胚胎生長發(fā)育受到抑制。