張力文，田輝伍，陳大慶，劉紹平，段辛斌，汪登強

(1.上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，武漢 430223)

紋胸鮡屬(Glyptothorax)起源于喜馬拉雅山及橫斷山脈中段，隨著喜馬拉雅山運動，沿著江河向各處擴散和遷移[1]，是鮡科魚類中種類最多、分布最廣的一個屬。根據(jù)《中國動物志》和《四川魚類志》的記錄，在我國境內(nèi)分布的紋胸鮡屬共有22種[2]，主要分布在伊洛瓦底江、怒江、瀾滄江、雅魯藏布江、元江和長江及其附屬水系。中華紋胸鮡(Glyptothoraxsinensis)和福建紋胸鮡(G.fukiensis)是該屬分布在低海拔的魚類，主要分布在長江及以南河流。謝仲桂等[3]和王汨等[4]從形態(tài)特征角度對這兩種魚進行對比后，認為二者并沒有明顯的性狀分化，應為同種異名，因此，本研究將這兩種魚類統(tǒng)稱為中華紋胸鮡。

中華紋胸鮡為小型底棲魚類，喜棲息于流水環(huán)境中，產(chǎn)粘性卵，受精卵粘附在石頭上發(fā)育孵化。中華紋胸鮡分布較為廣泛，棲息在多種類型生態(tài)環(huán)境，既可生活在長江上游高山峽谷河流中，也可在長江中下游平原湖泊及河流中，形成了不同的生態(tài)群[5]，是研究生物地理學和環(huán)境適應性的良好對象。長江上游漁業(yè)資源調(diào)查顯示，中華紋胸鮡是上游干支流主要漁獲物之一[6，11，12]。目前長江上游建設或規(guī)劃101座水電站[7]，導致中華紋胸鮡等魚類棲息地縮小和破碎化，阻礙其基因交流，引起資源量下降[8]。研究中華紋胸鮡群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，對評估水電開發(fā)對魚類的影響和制定資源保護措施具有重要意義。

目前有關(guān)中華紋胸鮡的研究主要集中在物種分類[9]、資源分布[10]和系統(tǒng)發(fā)育[11，20]方面，未見群體遺傳學研究報道。本研究采用Cytb和COI基因?qū)﹂L江上游中華紋胸鮡群體進行遺傳多樣性分析，旨在闡明其遺傳背景、不同地理群體的遺傳結(jié)構(gòu)，為資源保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本采集于2017年至2018年，共9個采樣點341尾樣本。采樣點包括長江上游干流5個[巴南(BN)、江津(JJ)、合江(HJ)、瀘州(LZ)、南溪(NX)]、岷江1個[犍為(QW)]、金沙江中游1個[攀枝花(PZH)]、金沙江下游1個[巧家(QJ)]及金沙江支流黑水河1個[寧南(NN)]。采樣點和樣本量信息見圖1和表1。樣本經(jīng)鑒定[5]后剪取少量鰭條，保存于無水乙醇中備用。

圖1 中華紋胸鮡采樣位點Fig.1 Sampling sites of G.sinensis

1.2 基因組DNA 提取、PCR 擴增及測序

樣本經(jīng)雙蒸水沖洗后浸泡2 h以上除去乙醇，采用鹽析法提取基因組DNA[12]。用線粒體DNACytb和COI基因序列進行分析，其中Cytb基因擴增引物可參考文獻[13]，COI基因擴增引物參考文獻[14]。兩個基因采用相同的PCR體系和反應程序，PCR擴增體系為5 0 μL，含2×Master Mix酶(武漢天一輝遠生物科技有限公司)25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，DNA模板2 μL，滅菌去離子水補至50 μL。PCR擴增反應程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸8 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增效果良好的擴增產(chǎn)物送至武漢天一輝遠生物科技有限公司進行雙向測序，測序引物與PCR引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

使用DNASTAR軟件包中的SeqMan對測序結(jié)果進行拼接，序列比對由CLUSTL X完成。使用MEGA v6.06[15]將序列進行翻譯，以檢查是否存在測序錯誤，并計算堿基組成和轉(zhuǎn)換/顛換比。群體遺傳多樣性參數(shù)，如變異位點、單倍型數(shù)量、單倍型(Hd)和核苷酸(Pi)多樣性使用軟件Dnasp version 5.10[16]分析。應用Arlequin version 3.1.1[17]進行分子方差分析(AMOVA)估算群體間遺傳變異及遺傳分化指數(shù)(FST)，分析群體遺傳結(jié)構(gòu)。群體間基因流用公式計算。為了檢驗群體間地理距離與遺傳分化是否符合距離隔離(Isolation by distance，IBD)[18]模式，用SPSS 22.0計算距離和遺傳分化指數(shù)的相關(guān)性。

單倍型網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)用NETWORK 5.0[19]完成。采用MEGA 6.0構(gòu)建基于Kimura-two-Parameter(K2P)單倍型鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)，boostrap設為1000，檢驗分支支持率。為了確定本研究所采集樣本中是否存在隱存種或亞種，采用目前常被用作物種鑒定的DNA條形碼的COI基因進行Automated barcode gap detection(ABGD)分析，由在線軟件服務器ABGD web(https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html)完成，以P=0.01作為種數(shù)參考指數(shù)[20]。采用Structure 2.3.4 軟件分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)，設置運行參數(shù)K=2-9，每個K值10次重復，將運算結(jié)果提交到在線工具Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)[21]計算△K，以△K的峰值，判斷群體的最佳K值。

為評估群體歷史動態(tài)，首先用Dnasp完成中性檢驗(Tajima′s D,Fu′s Fs)和堿基錯配分析。其次用BEAST version 2.4.3[22]進行Bayesian skyline plot(BSP)分析，推斷中華紋胸鮡的群體動態(tài)。以上三種方式僅使用Cytb序列，BSP分析采用魚類線粒體Cytb的平均突變率(0.65%每百萬年)[23]，保證ESS值大于200，結(jié)果的圖形化用軟件Tracer version 1.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

序列對比后得到341條長度為1 057 bp的Cytb序列和109條長度為607 bp的COI序列。序列中的轉(zhuǎn)換數(shù)明顯高于顛換數(shù)，Ts/Tv比分別為6.328和14.331。Cytb序列和COI序列A+T含量分別為58.02%和54.3%，高于C+G含量(41.95%和45.7%)，與硬骨魚類一致[24]。

Cytb序列共檢測到80個變異位點，其中簡約信息位點52個，單一變異位點28個。341條序列定義了65個單倍型，其中單倍型HB_2頻率最高，為35.78%，其次是HB_19為12.32%，HB_9為8.21%。其中單倍型HB_2和HB_9為長江干流和岷江6個群體共享。HB_19為QJ和NN 2個群體共享。總樣本Hd和Pi分別為0.845和0.007(表1)。各群體中，BN群體Hd最高為0.867，PZH群體Pi最高為0.005，NN群體最低，分別為0.251和0.002。

COI序列共檢測到31個變異位點，其中13個簡約信息位點，18個單一變異位點。109條序列共定義了23個單倍型，其中單倍型HC_1和HC_4頻率最高，分別為38.53%和25.69%，為LZ、NX和QW群體共享。單倍型HC_7頻率為9.17%，僅出現(xiàn)在NN群體?？倶颖綡d和Pi分別為0.774和0.005(表1)。兩種標記得到的遺傳多樣性指數(shù)相近，金沙江的3個群體遺傳多樣性低于長江上游群體。

表1 中華紋胸鮡線粒體DNA群體遺傳多樣性和中性檢驗Tab.1 Genetic diversity parameters and neutral test of G.sinensis populations based on mtDNA

2.1.2 遺傳結(jié)構(gòu)

分子變異方差分析(AMOVA)顯示，無論是Cytb序列還是COI序列，遺傳變異主要來自群體間(Cytb，59.62%；COI，55.24%)，群體間出現(xiàn)顯著遺傳分化(Cytb，F(xiàn)ST=0.60，P<0.01；COI，F(xiàn)ST=0.55，P<0.01)(表2)。

基于Cytb序列的兩兩群體間FST分析結(jié)果見表3，長江干流5個群體和岷江的犍為群體間FST均小于0.05，這6個群體與QJ、NN和PZH群體之間的FST都大于0.7。QJ和NN群體間FST也小于0.05，它們與PZH群體間的FST為0.459和0.644。基因流分析顯示長江干流和岷江群體間Nm值(或絕對值)均大于8，它們與QJ、NN和PZH群體間對群體間FST(表3)與地理距離(表4)進行Pearson相關(guān)性分析表明，這兩個變量間呈線性正相關(guān)關(guān)系(r=0.696，P<0.001)。

表3 基于Cyt b的中華紋胸鮡群體間兩兩FST(對角線下方)和基因流 Nm(對角線上方)Tab.3 Pairwise FST(below diagonal)and Nm values(above diagonal)among populations of G.sinensis based on Cyt b sequences

表4 中華紋胸鮡群體間的地理距離Tab.4 Pairwise geographical distances among G.sinensis populations km

利用Median Joining方法構(gòu)建Cytb單倍型網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖(圖2)顯示，中華紋胸鮡群體形成三個明顯分支：Clade I、Clade II和Clade III，分支間突變步驟為12-22個，分支內(nèi)相鄰單倍型間突變步驟最多為5個(圖2 a)。Clade I個體主要來自于BN、JJ、HJ、LZ、NX、QW等群體；Clade II主要來自NN和QJ等群體；Clade III主要來自PZH等群體(圖2 a)。COI單倍型網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖形成兩個分支：Clade A、Clade B，Clade A主要來自LZ、NX、QW等群體，與Cytb的Clade I對應；Clade B主要來自寧南等群體，與Cytb的Clade II對應(圖2 b)。

以老撾紋胸鮡(G.laosensis)和扎那紋胸鮡(G.zanaensis)(登錄號：HM636516.1,HM636515.1，HQ898002.1,HQ593565.1,DQ514349.1,KM610 755.1)為外類群，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。系統(tǒng)發(fā)育樹具有相似的拓撲結(jié)構(gòu)，其中Cytb系統(tǒng)發(fā)育樹呈現(xiàn)三個具有高支持率的分支，COI樹有兩個高支持率分支，分別與單倍型網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖的分支對應?；谶z傳距離的ABGD分析結(jié)果表明，P=0.01時，樣本被劃分為一組。

對全部樣本進行Structure聚類分析，根據(jù)△K結(jié)果顯示K=2時最佳。當K=2時，長江上游6個群體和金沙江3個群體被分為2個不同群體(圖3a)；當K=3或4時(圖3 b、c)，樣本被劃分為3個聚類群，長江上游、QJ和NN、PZH群體各為一個聚類群，與網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖(圖2)和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)相符合。

圖3 基于Cyt b序列的中華紋胸鮡群體Structure聚類分析Fig.3 Structure clustering conducted based on Cyt b within populations of G.sinensis

圖2 基于Cyt b序列(a)和COI序列(b)構(gòu)建的中華紋胸鮡單倍型網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖(右)和鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(左)Fig.2 Haplotype network(right)and NJ phylogenetic tree(left)of G.sinensis based on(a)Cyt b and(b)COI sequences單倍型網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)圖中一個圓圈代表一個單倍型，圓圈大小代表樣本頻率.

2.1.3 種群歷史

對Cytb序列的9個群體以及Clade I、II(圖4)分別進行Tajima′s D[25]和Fu′s Fs[26]中性檢驗，結(jié)果顯示Clade I(-59.18，-2.18)均為顯著負值，長江上游群體也均為負值(表1)。堿基錯配分析顯示，Clade I、Clade II呈多峰結(jié)構(gòu)(圖4)。BSP分析結(jié)果表明，Clade I群體在距今0.1～0.04 Ma(百萬年)經(jīng)歷了擴張事件。

圖4 基于Cyt b序列的中華紋胸鮡錯配分布分析和BSP分析Fig.4 Graphs of mismatch distribution and extended BSP for G.sinensis based on Cyt b

3 討論

3.1 遺傳多樣性

目前已開展群體遺傳學研究的紋胸鮡屬魚類有怒江扎那紋胸鮡(Hd=0.851,Pi=0.014)[27]和瀾滄江老撾紋胸鮡(Hd=0.299,Pi=0.000 32)[24]，與這兩種魚比較，中華紋胸鮡總體遺傳多樣性(表1)與扎那紋胸鮡相似，高于老撾紋胸鮡。但從不同群體看，各群體遺傳多樣性差異較大，其中金沙江的3個群體(PZH、NN、QJ)遺傳多樣性明顯低于長江上游及岷江的6個群體(表1)。金沙江中華紋胸鮡群體低水平的遺傳多樣性可能是由于奠基者效應造成。受第四紀冰期影響，冰期期間中華紋胸鮡可能僅存于長江中下游，隨著冰期結(jié)束，金沙江各江段氣候隨海拔從低到高逐漸回暖，中華紋胸鮡從長江中下游逐漸往上遷移而形成目前的格局。長江和金沙江的泉水魚(Semilabeoprochilus)[28]和裸體異鰾鰍鮀(Xenophysogobionudicorpa)[29]也有類似的情況。

3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA分析、network網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育樹以及Structure聚類分析的結(jié)果都表明，長江上游及金沙江中華紋胸鮡群體存在顯著遺傳分化，至少形成3個遺傳譜系，分別為金沙江中游(PZH)、金沙江下游(QJ、NN)、長江上游(BN、JJ、HJ、LZ、NX、QW)群體。Pearson相關(guān)性分析顯示中華紋胸鮡群體間FST與地理距離呈正相關(guān)關(guān)系(r>0.6)，說明中華紋胸鮡群體的遺傳結(jié)構(gòu)是距離隔離造成，符合IBD模式。距離和生境的差異是中華紋胸鮡產(chǎn)生群體隔離的可能原因。中華紋胸鮡為底棲魚類，產(chǎn)粘性卵，活動范圍窄，本研究采樣點最大距離達540 km(表4)，攀枝花到重慶巴南江段海拔落差達920 m左右，金沙江段內(nèi)地形極為復雜，眾多高山深谷相間并列，流域內(nèi)氣候時空變化較大，垂直差異十分顯著。這些因素阻礙了中華紋胸鮡遷移，基因流分析結(jié)果也表明了三個譜系間幾乎沒有基因交流。

歷史研究表明中華紋胸鮡存在多個生態(tài)類群[5]，本研究結(jié)果顯示中華紋胸鮡存在多個遺傳譜系，為了揭示中華紋胸鮡是否存在隱存種或亞種，本研究用兩種方法進行檢驗，即遺傳距離和ABGD法。首先，根據(jù)李博[30]基于Cytb序列計算三種紋胸鮡屬魚類[中華紋胸鮡、扎那紋胸鮡、穴形紋胸鮡(G.cavia)]之間遺傳距離，種間遺傳距離在0.067～0.098之間；王利華等[31]基于Cytb序列計算的鲌屬6種魚類的種間遺傳距離在0.1～7.5。本研究中中華紋胸鮡9個群體間的遺傳距離在0.003～0.020，單倍型之間遺傳距離最大為0.027(HB_21-HB_61)，遠小于鲌屬和紋胸鮡屬種間的遺傳距離。其次，通常用DNA條形碼ABGD作種類鑒定時，一般以P=0.01顯示組數(shù)作為種類數(shù)量的依據(jù)[20]。本研究COI基因的ABGD分析結(jié)果表明，所分析的樣本在P=0.01下只有一個組即為同一個種。綜合以上兩種方法結(jié)果表明，長江上游及金沙江中華紋胸鮡群體中并無隱存種或亞種存在。

本研究的采樣江段中建有兩座電站，即向家壩水電站和溪洛渡水電站，位于宜賓和巧家之間，AMOVA分析顯示水電站上游(BN、JJ、HJ、LZ、NX、QW)、下游(QJ、NN、PZH)群體有明顯的遺傳結(jié)構(gòu)差異(表2)，但這種差異是種群歷史造成，而不是大壩阻隔的影響。Sturcture分析顯示Clade I(主要是大壩下游群體)包含有大壩上游的少量個體，而Clade II和III完全沒有大壩下游個體(圖3)，目前大壩運行距采樣時間僅5年，難以對群體差異產(chǎn)生如此大的影響。并且，攀枝花江段與巧家江段之間目前未受大壩阻隔，但兩群體間也發(fā)生了顯著遺傳分化，因此，大壩建設是否會對群體基因交流造成影響，有待今后長期監(jiān)測。

3.3 種群歷史

BSP分析表明，中華紋胸鮡長江上游群體(Clade I)在晚更新世(0.13～0.01 Ma)發(fā)生了種群擴張事件，此時為末次冰期后期，長江上游氣候回暖，有利于中華紋胸鮡群體增長。長江上游一些特有魚類，如紅唇薄鰍(Leptobotiarubrilabris)、長薄鰍(L.elongata)[32]、裸體異鰾鰍鮀、異鰾鰍鮀(X.boulengeri)[29]等也在這一時期檢測到種群擴張事件。金沙江下游群體(Clade II)在0～0.0125 Ma也檢測到擴張現(xiàn)象(圖4)，擴張時間比Clade I的要晚，說明金沙江出現(xiàn)適宜于中華紋胸鮡氣候的時間更晚，與其較高海拔相符。

本研究結(jié)果顯示，長江上游及金沙江中華紋胸鮡群體發(fā)生了顯著的遺傳分化，將金沙江中游、金沙江下游、長江上游群體分別視為一個進化顯著單元(ESU)[33]，應對三個單元分別加以保護。巧家、寧南、攀枝花江段中華紋胸鮡群體遺傳多樣性較低，對環(huán)境變化的適應能力較低，在金沙江水電工程開發(fā)過程中需要特別加以關(guān)注。