李順峰 劉麗娜 王安建 田廣瑞 許方方

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002)

香菇(Lentinusedodes)是傘菌目口蘑科一種藥食兩用的真菌，因含有多糖、多酚、小分子肽以及膳食纖維等活性成分[1-3]而具有抗腫瘤、降血脂、提高免疫力等保健作用[4-6]，還含有豐富的5′-核苷酸和谷氨酸、天冬氨酸等呈鮮味氨基酸而呈現(xiàn)出鮮美的味道[7]。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計(jì)[8]，2017年中國香菇產(chǎn)量為986.51萬t，而河南省香菇產(chǎn)量為280.5萬t，占全國香菇年產(chǎn)量的28.43%，位列全國第一。目前，香菇除了干制和鮮銷以外，有將近30%的香菇用于加工，而在加工過程中燙漂是必需的工序，產(chǎn)生大量煮菇水(約800～1 400萬t)，這些煮菇水含有大量水溶性營養(yǎng)成分等。如能將這些營養(yǎng)成分和呈味成分進(jìn)行提取利用，制成保健食品、調(diào)味品等，不僅能提高企業(yè)的效益，還可以減少對環(huán)境的污染。

目前，對食用菌煮菇水的研究甚少，常樹人[9]將煮平菇水用于制作平菇母種培養(yǎng)基，俞智明[10]利用煮菇水制備醬油。而對食用菌煮菇水的營養(yǎng)成分和呈味成分構(gòu)成及其產(chǎn)品開發(fā)尚缺乏研究。另有不同溫度處理對香菇香氣成分變化方面的報(bào)道[11-12]，而對香菇煮菇水的利用研究鮮見報(bào)道。研究[13-14]表明，采用酶法得到的蛋白酶解液含有豐富的呈味氨基酸、呈味肽等呈味成分，已成為制備高檔復(fù)合調(diào)味品的重要基料。試驗(yàn)擬以香菇煮菇水為研究對象，采用生物酶解技術(shù)提高其呈鮮味物質(zhì)含量，增強(qiáng)風(fēng)味，以期為香菇煮菇水的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

香菇煮菇水(干物質(zhì)2.58 g/100 mL，其中蛋白質(zhì)0.43 g/100 mL，總糖0.54 g/100 mL)：河南天中億龍食品有限公司，經(jīng)紗布過濾后備用。

1.1.2 試劑

5'-磷酸二酯酶：食品級，酶活1萬U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

磷酸二氫鉀、四水合鉬酸銨、高碘酸鈉、乙酰丙酮、乙二醇、抗壞血酸、乙酸鈉、乙酸等：國產(chǎn)分析純；

5'-腺苷酸(5'-AMP)、5'-鳥苷酸(5'-GMP)、5'-肌苷酸(5'-IMP)：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

5'-黃苷酸(5'-XMP)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

分析天平：FA2004C型，上海越平科學(xué)儀器有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-98AB型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-1800型，島津儀器(蘇州)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RV8V-C型，德國IKA集團(tuán)；

恒溫磁力攪拌器：DF-101S型，鞏義市予華儀器有限公司；

艾柯超純水機(jī)：Exceed-Bc-16型，成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠；

臺式高速冷凍離心機(jī)：H2050R型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國戴安公司。

1.2 方法

1.2.1 氨基酸態(tài)氮的定量測定 采用GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》第二法比色法。精密吸取0.1 mg/mL氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL(相當(dāng)于NH3-N 0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 μg)分別于10 mL比色管中，向各比色管分別加入4 mL乙酸鈉—乙酸緩沖液(pH 4.8)及4 mL顯色劑(15 mL 37%甲醛與7.8 mL乙酰丙酮混合，加水稀釋至100 mL，劇烈振搖混勻)，用水稀釋至刻度，混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出，水浴冷卻至室溫后，移入1 cm比色皿內(nèi)，以0管為參比，于波長400 nm處測量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算線性回歸方程，回歸方程為：y=0.861 6x-0.01(R2=0.999 0)。

1.2.2 木瓜蛋白酶酶解單因素試驗(yàn) 香菇煮菇水濃縮至原體積的1/2，取100 mL于三角瓶中，在加酶量0.20%、酶解時(shí)間3 h、酶解溫度50 ℃條件下，分別采用不同的pH (5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)進(jìn)行酶解；在酶解時(shí)間3 h、pH 6.5、酶解溫度50 ℃條件下，分別采用不同加酶量(0.05%，0.10%，0.20%，0.30%，0.40%)進(jìn)行酶解；在加酶量0.30%、pH 6.5、酶解溫度50 ℃條件下分別酶解1，2，3，4，5 h；在加酶量0.30%、酶解時(shí)間4 h、pH 6.5條件下，采用不同溫度(40，45，50，55，60 ℃)進(jìn)行酶解，按照1.2.1方法將氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液替換為樣品溶液進(jìn)行氨基酸態(tài)氮含量的測定，考察木瓜蛋白酶不同酶解條件對香菇煮菇水中氨基酸態(tài)氮含量的影響。

1.2.3 木瓜蛋白酶酶解正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對加酶量、酶解時(shí)間、pH值和酶解溫度4個(gè)因素分別選取3個(gè)水平，對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 呈鮮味氨基酸、呈鮮味核苷酸的測定

(1) 呈鮮氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)含量：按GB 5009.124—2016執(zhí)行。

(2) 呈鮮味核苷酸[5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-鳥苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-黃苷一磷酸(5′-XMP)]含量：酶解前后香菇煮菇水經(jīng)4 000 r/min離心10 min后，上清液過0.45 μm濾膜后進(jìn)行HPLC分析[1, 15]。

1.2.5 等效鮮味濃度(EUC)計(jì)算 EUC值常用來表征食品的鮮味程度[16]，具體指：在100 g的食物中，以谷氨酸鈉(MSG)的量來表示呈鮮物質(zhì)的總量，其值按式(1)計(jì)算：

Y=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj)，

(1)

式中：

Y——EUC值，g MSG/100 mL；

ai——呈鮮氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)的含量，g/100 mL；

aj——呈鮮核苷酸[5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-鳥苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-黃苷一磷酸(5′-XMP)]的含量，g/100 mL；

bi——呈鮮氨基酸相對MSG的鮮味程度值(谷氨酸為1，天冬氨酸為0.077)；

bj——呈味核苷酸相對5′-IMP的值(5′-IMP=1、5′-GMP=2.3、5′-XMP=0.61、5′-AMP=0.18)；

1 218——協(xié)同作用常數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析與整理采用SPSS軟件和Excel軟件，采用Origin 9.6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH值對氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖1可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著pH的升高，氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高，在pH 6.5時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大0.43 g/100 mL，隨著pH的繼續(xù)增大，氨基酸態(tài)氮含量呈逐漸下降的趨勢。這一結(jié)果與李順峰等[17]和鄭炯等[18]的研究趨勢一致。這可能是由于在較適的pH范圍內(nèi)，酶的活性比較高，酶的水解作用有很大增強(qiáng)；而偏離了較適pH作用范圍，影響了底物的空間構(gòu)象，從而影響了酶與底物的結(jié)合。故選擇pH 6.5作為較適宜酶解pH。

圖1 酶解pH對氨基酸態(tài)氮含量的影響

2.1.2 木瓜蛋白酶加酶量對氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖2可知，當(dāng)加酶量由0.05%增加到0.30%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量由0.41 g/100 mL顯著升高至0.50 g/100 mL，然后再繼續(xù)增加加酶量，氨基酸態(tài)氮含量呈緩慢升高趨勢，與加酶量為0.30%時(shí)相比，氨基酸態(tài)氮含量均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，當(dāng)加酶量增至0.40%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量僅比加酶量為0.30%時(shí)增加了0.002 g/100 mL，考慮后續(xù)工作和節(jié)約資源等綜合因素，選擇加酶量0.30%較為合適。

圖2 加酶量對氨基酸態(tài)氮含量的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖3可知，酶解時(shí)間在1～4 h，隨著酶解時(shí)間的增加氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高，酶解時(shí)間在4 h時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大，隨著酶解時(shí)間的延長，氨基酸態(tài)氮含量不再增加。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長，酶與底物充分接觸，反應(yīng)速度加快，促進(jìn)了酶解反應(yīng)的發(fā)生，使氨基酸態(tài)氮含量持續(xù)增加；當(dāng)催化反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)，繼續(xù)延長酶解時(shí)間并不能促進(jìn)酶解反應(yīng)的發(fā)生，故氨基酸態(tài)氮含量不再增加[19-22]。因此酶解時(shí)間確定為4 h。

圖3 酶解時(shí)間對氨基酸態(tài)氮含量的影響

2.1.4 酶解溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高，并在酶解溫度為50 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到較高水平(0.51 g/100 mL)，隨后繼續(xù)升高溫度，氨基酸態(tài)氮含量則逐漸降低。這一趨勢與Pan等[19]報(bào)道的采用纖維素酶提取大蒜多糖的趨勢相一致。這可能是由于酶在較適的溫度下有較高的酶活，催化反應(yīng)速度快；而偏離(低于或高于)較適作用溫度后酶的活性受到部分抑制或變性而失去活性[19-22]。因此酶解溫度確定為50 ℃。

圖4 酶解溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響

2.2 木瓜蛋白酶酶解工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化

以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，對香菇煮菇水中氨基酸態(tài)氮的木瓜蛋白酶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，各因素對氨基酸態(tài)氮含量影響大小依次為C>A>D>B，木瓜蛋白酶酶解提高煮菇水中氨基酸態(tài)氮含量的最佳工藝組合為A1B3C3D3，即酶解 pH 6.0、酶解溫度55 ℃、加酶量0.40%、酶解時(shí)間5 h。此最優(yōu)條件為表2中第3組試驗(yàn)，其氨基酸態(tài)氮含量為0.454 g/100 mL。這一結(jié)果高于課題組[17]采用中性蛋白酶酶解香菇柄提取液的氨基態(tài)氮含量(0.046 g/100 mL)，可能與溶液中所含蛋白質(zhì)含量和蛋白酶酶解能力有關(guān)。

2.3 木瓜蛋白酶酶解對香菇煮菇水鮮味的影響

由表3可知，木瓜蛋白酶酶解可顯著提高香菇煮菇水中呈鮮味氨基酸——谷氨酸和天冬氨酸含量(P<0.05)，而對呈鮮味核苷酸含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 酶解對香菇煮菇水鮮味成分的影響?g/100 mL

呈鮮味氨基酸與呈鮮味核苷酸存在協(xié)同效應(yīng)，可以增加蘑菇的鮮味。Mau[23]將蘑菇中呈鮮成分的等效鮮味濃度(EUC)分為4級：一級>10.0 g MSG/g干物質(zhì)，二級1.0～10.0 g MSG/g干物質(zhì)，三級0.1～10.0 g MSG/g干物質(zhì)，四級<0.1 g MSG/g干物質(zhì)。按此標(biāo)準(zhǔn)，酶解前后香菇煮菇水的EUC均為二級(酶解前后EUC分別為5.47，7.34 g/g干物質(zhì))，但EUC從酶解前的27.371 g/100 mL顯著升高至36.683 g/100 mL。此結(jié)果高于Chen等[24]報(bào)道的香菇菌蓋的EUC(二級)為1.068～3.427 g/g，菌柄EUC(三級)為0.359～0.951 g/g和趙靜等[25]報(bào)道的香菇菌湯、酶解液和復(fù)水原液的EUC值分別為0.119，0.305，0.212 g/g 的結(jié)果。

3 結(jié)論

采用木瓜蛋白酶對香菇煮菇水進(jìn)行酶解增鮮，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)，得到木瓜蛋白酶酶解提高香菇煮菇水氨基酸態(tài)氮的最佳工藝條件為pH 6.0、酶解溫度55 ℃、加酶量0.40%、酶解時(shí)間5 h，氨基酸態(tài)氮含量為0.454 g/100 mL。香菇煮菇水經(jīng)木瓜蛋白酶處理后可顯著提高呈鮮味氨基酸——谷氨酸和天冬氨酸含量，且經(jīng)酶解后等效鮮味濃度顯著增強(qiáng)。酶解前后香菇煮菇水的等效鮮味濃度均為二級，仍需通過篩選不同酶、多酶協(xié)同作用等提高呈鮮味成分含量，進(jìn)而增強(qiáng)鮮味。