唐學(xué)峰， 劉昌昊， 于樹印， 曾慶豐， 施建黨

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.西安點(diǎn)云公司，西安 710000； 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院脊柱骨科，銀川 750004）

脊柱結(jié)核病灶局部藥物濃度過低及病灶清除術(shù)后骨缺損修復(fù)材料不足是脊柱結(jié)核病灶難以治愈及容易再燃的主要原因，如何增加病灶局部藥物濃度及有效修復(fù)重建病灶骨缺損，促進(jìn)病灶愈合是臨床思考的難題[1]。局部應(yīng)用載抗結(jié)核藥緩釋植骨材料有望同時(shí)解決上述難題[2]。本研究選擇了最新三聯(lián)抗癆藥物組合PaMZ［Pa-824（Pretomanid，Pa）、莫西沙星（Moxifloxacin，M）、吡嗪酰胺（Pyrazinamide，Z）］及納米羥基磷灰石（nanohydroxyapatite，nHA），設(shè)計(jì)并 3D 打印了載藥 PaMZ/nHA 抗結(jié)核人工骨用于脊柱結(jié)核的病灶治療。Pa是通過抑制細(xì)菌霉菌酸和蛋白合成來殺滅結(jié)核桿菌，在無氧和有氧條件下都可以高效殺滅結(jié)核桿菌，有出色的組織滲透性[3]，對(duì)耐藥結(jié)核桿菌有高度的敏感性[4]，PaMZ 對(duì)多重耐藥性結(jié)核病有理想的治療效果[5]。如何使載藥人工骨既能滿意釋藥，又能滿足支撐強(qiáng)度是人工骨制作中必須首先回答的問題。載藥人工骨的藥物配比及不同孔徑對(duì)釋藥均有影響，亦對(duì)3D 打印人工骨壓縮強(qiáng)度產(chǎn)生影響，在確保足夠強(qiáng)度的前提下，確定材料不同孔徑及不同載藥量的配比是此部分研究的關(guān)鍵。本研究通過對(duì)不同孔徑nHA 與不同含量的PaMZ 藥物構(gòu)成的9 種載藥抗結(jié)核人工骨的釋藥性能和抗壓縮強(qiáng)度測(cè)試，篩選出最優(yōu)藥物配比和孔徑的載PaMZ 的nHA 抗結(jié)核人工骨。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

高效液相色譜儀（安捷倫公司）；RGM-G010電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)（深圳市瑞格爾儀器有限公司）；AL-204 電子天平（上海梅特勒有限公司）；QL-861 渦旋混合器（中國(guó)其林貝爾儀器制造公司）；納米羥基磷灰石晶須粉體、羥基磷灰石粉體（西安點(diǎn)云公司）；聚乳酸-羥基乙酸（poly lactic co glycolic acid，PLGA）75/25OH（濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；二氯甲烷（徐州天鴻化工有限公司）、丙酮（煙臺(tái)市雙雙化工有限公司）、無水乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；Pa 樣品（美國(guó)MedChemExpress 公司）、M（大連美侖生物技術(shù)有限公司），Z（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；3D 打印機(jī)（西安點(diǎn)云公司）。聚乙烯醇（PVA）（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）。Pa 標(biāo)準(zhǔn)品（廈門慧嘉生物技術(shù)有限公司）；M 標(biāo)準(zhǔn)品（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；Z 標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜級(jí)）（Fisher chemical 公司）。

1.2 材料制備

1.2.1 nHA 漿料的制備 nHA 和納米羥基磷灰石晶須按照1∶10 的比例混勻，加入一定比例的PVA 粘接劑，將三者混勻充分后備用。

1.2.2 制備PaMZ-PLGA 固體分散體溶液 分別制備3 種不同的固體分散體溶液，Pa 加到丙酮中渦旋溶解形成溶液a；PLGA 加入到二氯甲烷渦旋溶解形成溶液b，M、Z 加入到無水乙醇中渦旋溶解形成溶液c，將a、b、c 溶液充分混合后，加熱到70 ℃，待揮發(fā)至少量時(shí)，降低溫度至25 ℃，將該固體分散體黏稠液體加入到上述制備的nHA漿料中混勻，準(zhǔn)備行3D 打印。

1.2.3 載抗癆藥人工骨的3D 打印 按照是否載藥分為載藥和非載藥人工骨組，按照孔徑及載藥量不同，載藥人工骨分為 A、B、C、D、E、F、G、H、I組（共 9 組），非載藥人工骨分為 J、K、L 組（共 3組）。將上述配制的混勻漿料加入到3D 打印機(jī)中進(jìn)行常規(guī)打印。

1.2.4 載PaMZ/nHA 3D 打印人工骨大體形態(tài)學(xué)觀察 載藥組為長(zhǎng)方體狀，呈奶白色，質(zhì)韌而硬，表面粗糙，可以看到孔隙，非載藥組，長(zhǎng)方體狀，呈白色，質(zhì)硬，表面粗糙（圖1）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

設(shè)計(jì)的支架體積為10 mm×8 mm×8 mm，孔徑分別是 200、400 和 600 μm，孔隙率 60%，實(shí)驗(yàn)組（載PaMZ 的3D nHA 抗結(jié)核人工骨組）根據(jù)上述不同孔徑、不同載藥量制作成不同人工骨分為9 組，即 A、B、C、D、E、F、G、H、I 組，根據(jù)藥物配比分為 3 個(gè)組，藥物配比 6∶12∶45∶95 為實(shí)驗(yàn)組 1（A、B、C 組），藥物配比 4∶12∶45∶244 為實(shí)驗(yàn)組 2（D、E、F 組），藥物配比 3∶12∶45∶140 為實(shí)驗(yàn)組 3（G、H、I 組）。對(duì)照組（非載藥的 nHA 人工骨）根據(jù)上述不同孔徑制作成非載藥人工骨分為3組 ：J、K、L 組 中 加 入 nHA 混 合 物 總 量 均 為429.59 mg。將人工骨冷凍干燥后，鈷60 滅菌后保存?zhèn)溆茫ū?）。

1.4 抗壓縮強(qiáng)度的測(cè)定

將制備好的底面邊長(zhǎng)為8 mm、高度為10 mm的長(zhǎng)方體載藥或不載藥人工骨共9 組，依次固定在電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)上，將壓縮沖頭的速度設(shè)置為1 mm·min-1，施加不同的載荷于樣品上，直到樣品在垂直方向壓縮至 80%停止，以載荷-位移曲線中載荷下降時(shí)最大載荷時(shí)的壓強(qiáng)確定為各人工骨的最大抗壓縮強(qiáng)度。每組均做3 個(gè)，記錄每次測(cè)量值。

表1 不同載藥配比人工骨重量的比較

1.5 高效液相色譜對(duì)載PaMZ/nHA 抗結(jié)核人工骨釋藥性能進(jìn)行觀察

1.5.1 建立色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用色譜柱：GL sciences WondasilTM C18superb 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng) 250 nm；柱溫 40℃；進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相條件為：甲醇-0.1%的冰乙酸，流速為1 mL·min-1，梯度出峰進(jìn)樣。利用Pa標(biāo)準(zhǔn)品分別配置 0.1～10 μg·mL-1之間的濃度，M分別配置 0.1～1000 μg·mL-1之間的濃度，Z 分別配置 0.1～2000 μg·mL-1之間的濃度。按照上述的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）。將呈線性的點(diǎn)連接，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表2）。

表2 PaMZ 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

1.5.2 載PaMZ/nHA 抗結(jié)核人工骨釋藥性能的觀察及參數(shù)的測(cè)定 分別將上述的9 種不同的載藥人工骨（A～I(xiàn) 組）裝入一端扎好的透析袋中，注入2 mL 磷酸鹽緩緩沖液（pH=7.4）液，將另一端扎緊，置入裝有5 mL PBS 液的離心管中，在37 ℃下，以100 r·min-1的水浴搖床中進(jìn)行體外釋藥試驗(yàn)。于 1、4、8、12、24、36 和 48 h 取樣，第 3天及第3 天以后每天同一時(shí)間段取樣，3 d 后的取樣時(shí)間為第 4、5、7、11、14、21、28、35 和 42 天（6 周）。取樣于-20℃密封、凍存待檢。同時(shí)補(bǔ)充5 mL 新鮮PBS 液于離心管中。將所取的樣品經(jīng)過 0.22 μm 的微孔濾膜過濾后，取 10 μL 利用前面建立的液相條件進(jìn)樣記錄峰面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出濃度、累積釋藥率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用F 檢驗(yàn)，孔徑及藥物配比的比較采用 2×2 析因設(shè)計(jì)方差分析，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人工骨抗壓縮強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果

不同孔徑非載藥人工骨的最大抗壓強(qiáng)度間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.532，P=0.160），表明非載藥人工骨的最大抗壓強(qiáng)度和孔徑無關(guān)（表3）。同孔徑載藥和非載藥人工骨的最大抗壓縮強(qiáng)度間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）（表3）。表明nHA 的人工骨的最大抗壓強(qiáng)度和是否載藥無關(guān)。藥物配比及孔徑兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析中，不同藥物配比人工骨的最大抗壓縮強(qiáng)度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.873，P＜0.001）（圖 2），表明各組中載藥人工骨的最大抗壓縮強(qiáng)度和藥物配比有關(guān)。其中 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實(shí)驗(yàn)組3）的最大抗壓縮強(qiáng)度高于其余實(shí)驗(yàn)組（P均＜0.01）（圖 2）。表明 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實(shí)驗(yàn)組3）的最大抗壓縮強(qiáng)度最大。不同PLGA 含量的人工骨的最大抗壓強(qiáng)度間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.873，P＜0.001），表明各組中載藥人工骨的最大抗壓縮強(qiáng)度和人工骨中PLGA的含量有關(guān)，其中，PLGA20.95%的載藥人工骨（3∶12∶45∶140）（實(shí)驗(yàn) 3 組）的最大抗壓強(qiáng)度高于其余實(shí)驗(yàn)組（P 均＜0.01），表明載藥人工骨中PLGA含量20.95%的人工骨最大抗壓強(qiáng)度是最大的。

2.2 載藥人工骨的Pa、M、Z 的釋藥性能分析

記錄不同組別載藥人工的釋藥情況（表4），9 組載藥人工骨間的6 周Pa 釋藥率間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.449，P＜0.001）（圖 3），其中 G組Pa 的6 周累積釋藥率均低于除B 組外的其他各組（P 均＜0.05 或＜0.01）；B 組的 Pa 的 6 周累積釋藥率低于除C、G 組外的其余各組（P 均＜0.05或＜0.01）；B、G 組間 Pa 釋藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B、G 組間 Pa 釋藥率相對(duì)較低，G 組的Pa 釋藥率9 組中最小的是16.74%。

表3 非載藥人工骨和載藥人工骨抗壓強(qiáng)度的比較（，MPa）

表3 非載藥人工骨和載藥人工骨抗壓強(qiáng)度的比較（，MPa）

組別 n 不同孔徑支架抗壓強(qiáng)度 F 值 P 值200 μm 400 μm 600 μm非載藥 3 6.40±0.18 5.85±0.15 7.64±1.71 2.532 0.160載藥 9 6.01±0.80 6.24±1.98 6.19±2.24 0.068 0.934 t 值 0.641 0.28 0.981 P 值 0.442 0.271 0.343

表4 不同組別載藥抗結(jié)核人工骨中PaMZ 各藥的釋藥情況比較

2.3 孔徑和藥物配比兩因素析因設(shè)計(jì)釋藥率的方差分析

孔徑和藥物配比兩因素設(shè)計(jì)的釋藥率方差分析中，不同孔徑載藥人工骨的Z 和M 關(guān)鍵點(diǎn)（釋藥1、8、12 和24 h）釋藥率總和間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.7859，P=0.4708），表明各組中載藥人工骨的釋藥率與孔徑無關(guān)。藥物配比間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.525，P=0.0074）（圖 4）。表明各組中載藥人工骨的釋藥率和藥物配比有關(guān)，其中，藥物配比 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實(shí)驗(yàn)組3）的釋藥率是最小的，其和 6∶12∶45∶95（實(shí)驗(yàn)組1）及 4∶12∶45∶244（實(shí)驗(yàn)組 2）的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.01）（圖 4）。

2.4 孔徑和藥物配比兩因素析因設(shè)計(jì)釋藥時(shí)間的方差分析

孔徑和藥物配比兩因素的釋藥時(shí)間的方差分析中，不同藥物配比的Z 和M 的釋藥率90%時(shí)的釋藥時(shí)間總和之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.449，P=0.0044）（圖 4），表明各組載藥人工骨的親水性藥物釋藥時(shí)間與藥物配比有關(guān)。其中，藥物配比 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實(shí)驗(yàn)組 3）的親水性藥物釋藥時(shí)間最長(zhǎng)，和 4∶12∶45∶244（實(shí)驗(yàn)組 1）及 6∶12∶45∶95（實(shí)驗(yàn)組 2）比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.01）（圖 5）。A～I(xiàn) 組的載藥人工骨孔徑和藥物配比兩因素析因設(shè)計(jì)的Z 和M 釋藥率90%的釋藥時(shí)間總和的方差分析中，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 均與實(shí)驗(yàn)組3 的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，實(shí)驗(yàn)組3 的Z 和M 釋藥率為90%的釋藥時(shí)間之和最大。

2.5 最優(yōu)載藥人工骨的篩選結(jié)果及其釋藥曲線

以最大抗壓強(qiáng)度為載藥人工骨的篩選指標(biāo)，最佳載藥人工骨為實(shí)驗(yàn)組3，以釋藥性能為載藥人工骨的篩選指標(biāo)，最佳載藥人工骨為G 組，因而，以最大抗壓強(qiáng)度和釋藥性能為總的篩選條件得出最佳載藥人工骨為G 組。G 組的釋藥曲線如圖6。

3 討論

3D 打印的載藥nHA 支架可望解決脊柱結(jié)核病灶局部濃度不足及植骨材料缺乏的臨床難題。nHA 是構(gòu)建骨組織工程支架的理想材料，3D打印可以設(shè)計(jì)nHA 的孔徑及孔隙率。3D 打印后的多孔結(jié)構(gòu)材料機(jī)械強(qiáng)度必然下降[6-9]。如何在孔結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度之間進(jìn)行調(diào)節(jié)，快速成型技術(shù)可以解決這一難題[10]；如何在材料載藥后確保nHA 支架足夠的支撐強(qiáng)度，確定材料最優(yōu)的的孔徑及合適的藥物配比是成為人工骨制作中首要解決的問題。

3.1 最佳強(qiáng)度時(shí)配比的確定

本研究觀察9 組載藥PaMZ 的nHA 抗結(jié)核支架中，藥物輔料配比 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實(shí)驗(yàn)組3）的人工骨具有最優(yōu)的抗壓縮強(qiáng)度，表明PLGA 占支架20.95%時(shí)，載藥人工骨的抗壓縮強(qiáng)度最大。在孔徑相同的情況下，載藥和非載藥的人工骨的最大抗壓縮強(qiáng)度無差別，說明加入藥物PaMZ 的載藥人工骨的最大抗壓縮強(qiáng)度和非載藥人工骨的基本相同，孔隙率60%時(shí)的人工骨既確保了載藥人工骨植入骨缺損處的支撐作用，又確保了在骨缺損處的成骨和足夠的藥物濃度。

在脊柱結(jié)核病灶局部治療中，人工骨需要有一定孔隙率和足夠載藥量，才能滿足長(zhǎng)程、緩慢釋藥的要求。而本組載藥支架的孔隙率盡可能達(dá)到松質(zhì)骨孔隙率的50～90%[11]。而松質(zhì)骨的抗壓強(qiáng)度2～12 MPa[10]。本研究所制備的載PaMZ 的3D nHA 抗結(jié)核支撐人工骨能夠滿足以上條件，具有較高的60%孔隙率，抗壓強(qiáng)度較大，平均6.17 MPa，承載足量的抗結(jié)核藥物，可以滿足支撐植骨的要求。

3.2 PLGA 對(duì)人工骨強(qiáng)度有加強(qiáng)作用

多孔HA 的抗壓強(qiáng)度很低，多孔HA 的支架強(qiáng)度為0.88 MPa 左右[12]。常難以達(dá)到支撐植骨。本組研制的載藥多孔HA 抗壓強(qiáng)度，平均達(dá)6.17 MPa，非載藥多孔HA 最大抗機(jī)械壓縮強(qiáng)度平均為7.06 MPa，明顯高于多孔HA，達(dá)到松質(zhì)骨的強(qiáng)度。理論上HA 支架加入大比例抗結(jié)核藥物后抗壓強(qiáng)度將下降[13]，但本研究采用的nHA 加入三種藥物總量百分比從5.99%增加到11.93%，載藥人工骨的抗壓強(qiáng)度卻無明顯下降，究其原因，我們認(rèn)為PLGA 抵消了加入藥物所造成機(jī)械強(qiáng)度的下降，當(dāng)載藥輔料PLGA 從17.99%增加到20.95%，載藥人工骨的最大壓縮強(qiáng)度逐漸增大，從20.95%增加到23.94%時(shí)，載藥人工骨的最大抗壓縮強(qiáng)度逐漸下降，說明PLGA 增加了材料的機(jī)械強(qiáng)度，并且在PLGA 質(zhì)量比為20.95%時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度最大，隨后又開始下降。Chen 等[14-18]認(rèn)為，PLGA 可增強(qiáng)磷酸鈣骨水泥的機(jī)械強(qiáng)度，機(jī)制是PLGA 強(qiáng)化了nHA 晶體矩陣，減少了HA 孔壁的裂隙缺陷數(shù)目，改善了脆性nHA 基質(zhì)的機(jī)械穩(wěn)定性。HA孔隙表面上缺陷的減少導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度的增加[15]。但當(dāng)濃度過大時(shí)，PLGA 強(qiáng)度畢竟遠(yuǎn)小于nHA，并使nHA 晶體間分布過于松散，最大抗機(jī)械壓縮強(qiáng)度就會(huì)開始變小。

3.3 最佳釋藥性能時(shí)配比的確定

本研究觀察9 組載藥PaMZ 的nHA 人工骨在體外釋藥時(shí)，其中G 組釋藥最佳，Pa 釋藥6 周遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到完全釋放，緩釋效果很好。Pa 是脂溶性藥物，在磷酸鹽緩釋液中緩釋效果相對(duì)較好，Z和M 是偏水溶性藥物，會(huì)出現(xiàn)明顯的突釋，如能增加Z 和M 的釋藥時(shí)間和減少二者關(guān)鍵點(diǎn)（釋藥 1、8、12 和 24 h） 的釋藥率，PaMZ 復(fù)合配方就是最佳的。本研究結(jié)果顯示，G 組Pa 釋藥時(shí)間最長(zhǎng)，Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140（實(shí)驗(yàn)組 3）的載藥人工骨關(guān)鍵點(diǎn)（釋藥 1、8、12 和 24 h）上 Z 和 M的釋藥率總和是最小的，該組Z、M 的釋藥時(shí)間也是最長(zhǎng)的，唯有G 組Pa 在釋藥2 周、Z 在釋藥24 h、M 在釋藥120 h 的藥物平均濃度均高于各自藥物10 倍的最低抑菌濃度。Z、M、Pa 的體外藥物最 低 抑 菌濃 度 分 別 是 2[19]、0.025 ～0.5[20]和0.015～0.25 μg·mL-1[3]。因而同時(shí)滿足 Pa 優(yōu)良釋藥率、Z 和 M 的關(guān)鍵點(diǎn)（釋藥 1、8、12 和 24 h）釋藥率總和最小、最大Z 和M 的釋藥率90%時(shí)的釋藥時(shí)間總和、10 倍的MIC 的只有G 組。

綜上，載PaMZ/nHA 抗結(jié)核具有較好的載藥緩釋特性和理想的抗機(jī)械壓縮強(qiáng)度，可以滿足脊柱結(jié)核術(shù)后骨缺損的支撐植骨和局部有效殺菌的要求。研究確定 Pa∶M∶Z∶PLGA=3∶12∶45∶140，孔徑200 μm 為最佳，三種藥物釋放均在10 倍最低抑菌濃度以上。支架在較高孔隙率60%時(shí)，人工骨抗壓強(qiáng)度可達(dá)平均6.17 MPa，達(dá)到了松植骨的抗壓強(qiáng)度，能夠滿足骨缺損的椎間支撐植骨要求。PLGA 可增加載藥人工骨的機(jī)械抗壓強(qiáng)度，當(dāng)PLGA 含量達(dá)到20.95%時(shí)，其抗壓強(qiáng)度最大。