周子鈴， 馬 堅， 侯宇轉， 于麗麗， 丁小艷， 韓 龍， 黃永清

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口腔外科，銀川 750004）

唇腭裂（oral cleft or palate）是最常見的顱頜面畸形，全球范圍內(nèi)發(fā)病率為1/700[1]，我國以1.4/1000 的發(fā)病率成為世界高發(fā)國家之一[2]。在寧夏新生兒出生缺陷疾病中居于首位，發(fā)病率為1.85/1000[3]。該疾病不僅影響患兒的生長發(fā)育，降低患兒家庭生活質(zhì)量，也影響了我國出生人口素質(zhì)[4]。唇腭裂分為綜合征型唇腭裂（SCL/P）和非綜合征型唇腭裂（NSCL/P），非綜合征型唇腭裂（NSCL/P）是指不伴有其他系統(tǒng)器官畸形，不屬于任何綜合征范圍之內(nèi)的單純唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的總稱[5]。近年來研究篩選發(fā)現(xiàn)很多與NSCL/P 相關的易感基因，包括 1q32.2（IRF6）、20q12（MAFB）、8q24.21（MYC）、4p16.2（MSX1）、17p13.1（NTN1）、10q25.3（SHTN1、VAX1）、5p12（FGF10）等[6-9]。2010年Beaty 對亞洲及歐洲唇腭裂人群進行GWAS（genome-wide association studies）后提示 ABCA4和MAFB 在亞洲人群中更加顯著的異常表達[10]。但ABCA4 在唇部和腭部不表達，而ABCA4 第一內(nèi)含子中一段保守序列促進基因的顯著表達會在小鼠面中部出現(xiàn)異常表征，這與Arhgap29 的RNA在人顱面部的表達模式類似[11]。Letra 等[12]于2014年在非西班牙裔白種人群中進行驗證，發(fā)現(xiàn)Arhgap29 基因上 3 個位點（rs3789688、rs1541098、rs1576593）與NSCL/P 有強相關性。隨后2017 年Paul 等人通過在小鼠基因組中插入從NSCL/P 患者中篩選到的點突變體，構建一個新的Arhgap29基因的無義突變（K326X）小鼠模型，該突變可能會導致基因功能缺失（LoF），使Arhgap29 基因沉默進而引起唇腭部發(fā)育期上皮連接異常[13]。

本課題組前期通過大家系樣本測序，得知Arhgap29 是與NSCL/P 最具相關性的易感基因之一。因此，本研究選取Arhgap29 上23 個常見SNP位點進行人群驗證，探討在寧夏Arhgap29 基因多態(tài)性與非綜合征型唇腭裂是否具有相關性。

1 對象及方法

1.1 研究對象

收集 2014 年 1 月—2018 年 12 月就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院口腔頜面外科的唇腭裂患者500 例（男孩 306 例，女孩 194 例）為病例組；本醫(yī)院同期出生的正常新生兒450 例（男孩233 例，女孩217 例）為對照組。所有樣本均嚴格按照納入標準進行收集，病例組納入標準：①患兒為先天性NSCL/P 且不伴有其他系統(tǒng)器官的先天性畸形及后天疾?。虎诨純杭彝o其他遺傳病家族史；③患兒雙親精神正常，能接受問卷調(diào)查者；④患兒父母家庭至少三代為寧夏籍。對照組納入標準：除符合新生兒無任何系統(tǒng)器官的先天疾病或畸形外還應滿足病例組納入標準中的②、③、④。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會批準（批號：2015-076），所有樣本收集均征得患者或其監(jiān)護人知情同意，并簽屬知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本DNA 提取 由經(jīng)統(tǒng)一培訓的實驗人員采集病例組、對照組外周靜脈血5 mL，加EDTA 抗凝劑，使用Wizard 基因組DNA 純化試劑盒來提取純化基因組DNA，再對所提取的樣本DNA 分別經(jīng)紫外線吸收法和瓊脂糖凝膠電泳法測定濃度及純度，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 基因分型 結合Hapmap 基因庫、haploview中的tagSNP 及MAF＜0.5 作為選取標準，選取Arhgap29 基因上23 個常見的SNP，于Ion Torrent測序平臺上對所選SNP 運用AgriSeqTM 靶向測序技術進行基因分型。該方法是在待測DNA 自動構建AgriSeqTM 文庫后，通過油包水PCR 擴增多個SNP 靶標以構建穩(wěn)定的測序模板，再經(jīng)過純化后進行測序和基因分型。從而達到鑒定不同基因型的目的。此部分實驗委托博奧生物公司完成（通過對生物公司經(jīng)過多方考察和對比，公司后期給予質(zhì)控標準及驗證，可保證數(shù)據(jù)可靠）。

1.2.3 實驗耗材 實驗選用東盛生物科技有限公司生產(chǎn)的5mL EDTA 抗凝采血管（K2）、美國貝克曼庫爾特有限公司的臺式高速離心機（GS-15R）、德國 Eppendorf 公司的小型高速離心機（5424R），電熱恒溫水浴箱（上海電子儀器廠（DK-8B））、NanoDrop2000 微量紫外分光光度計（美國 Equl-Thermo SCIENTIFIC（ND2000））、美國普洛麥格 Promega 公司的Wizard 基因組 DNA純化試劑盒（A1120）等儀器和試劑用于提取DNA。

1.3 統(tǒng)計學方法

對照組基因分型結果進行H-W 平衡分析；采用SPSS 17.0 軟件對病例組和對照組中基因位點的等位基因及基因型頻率進行χ2檢驗，檢驗水準α=0.05；運用Haploview 軟件對這些SNP 位點進行連鎖分析和單倍型分析。

2 結果

2.1 H-W 平衡檢驗

Arhgap29 基因常見的23 個SNP 位點基因型頻率經(jīng)H-W 平衡檢驗無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），符合 H-W 平衡（表 1）。

2.2 病例組和對照組Arhgap29 基因中 23 個SNP 位點等位基因及基因型分析

23 個SNP 差異位點中的4 個位點rs3814019（等位基因=7.763，P=0.0053；基因型=7.907，P=0.019）、rs7540684（等位基因=6.243，P=0.0125；基因型 6.403，P=0.041）、rs17396055（等位基因=4.249，P=0.0393；基因型=7.631，P=0.022）和rs72964308（等位基因=4.74，P=0.0295；基因型=7.907，P=0.019）的基因型和等位基因頻率在病例組與對照組間差異均有統(tǒng)計學意義（P 均<0.05）（表 2）。

表2 Arhgap29 基因中23 個SNP 位點等位基因及基因型分析

2.3 連鎖不平衡及單倍型分析

連鎖分析顯示，23 個SNP 位點形成2 個連鎖block（單體型塊 1：rs1411700、rs1411701、rs12044 374、rs11196、rs17111203、rs17111206、rs11577575、rs1411702、rs3789691、rs77940435、rs2274788。單體型塊2：rs7554714、rs6541343、rs1999270、rs3814019、rs72964308、rs17111259、rs1756245、rs17396055、rs7540684、rs1360365、rs6697764、rs1756248），2 個block 共有4 個單倍型組合在病例組和對照組之間差異均有統(tǒng)計學意義（P 均<0.05）。block 1：單倍型CGCAAGGGCGC（P=0.0406）和單倍型AATCGG GGCGT（P=0.0479）。block 2：CGTGCTCGGAGG（P=0.0103）單倍型和 CGTATTCAAAGG（P=0.0336）單倍型（表 3、圖 1）。

3 討論

非綜合征型唇腭裂的病因復雜，病因涉及遺傳基因和環(huán)境因素以及兩者的交互作用[7]。在非綜合征型唇腭裂的多基因閾值假說中，數(shù)個中效或輕度微效基因會共同作用，微弱作用疊加達到一定的閾值從而導致NSCL/P 的發(fā)生，這屬于數(shù)量性狀遺傳[5]。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的不斷發(fā)展，國內(nèi)外對NSCL/P 易感基因定位篩選不斷更新。從遺傳標記分子檢測，過渡到以基因芯片為主要手段的全基因組關聯(lián)研究，到目前主要以二代測序為基礎的全基因組或及外顯子組為代表的基因組學研究，這些都為探究NSCL/P 易感基因及發(fā)病機制提供了非常重要的線索。

Arhgap29 基因位于染色體1p 22.1 區(qū)域，含有24 個外顯子，在上皮細胞中表達較高，尤其是在口腔、舌、腭上皮中強表達。該基因距ABCA4基因 47kb，編碼 Rho-GTP 酶活化蛋白 29[14]。Arhgap29 可使 RhoA 由 GTP 限制型變?yōu)?GDP 限制型進而失活，從而影響下游效應分子ROCK，調(diào)節(jié)細胞動力學和肌動蛋白細胞骨架，使細胞的分裂、周期異常、上皮細胞極性的穩(wěn)定性發(fā)生改變，并參與EMT 過程的調(diào)控[15-17]。針對此基因與NSCL/P 的研究發(fā)現(xiàn)，Arhgap29 可能在 IRF6 的下游發(fā)揮作用，在IRF6 基因表達缺失的小鼠腭上皮和皮膚中Arhgap29 基因表達被抑制[18-19]。Leslie等[20]對唇腭裂病因?qū)W的研究也進行了小鼠模型試驗，結果證實 Arhgap29 與 WNT、IRF6、TGFB等信號通路有關聯(lián)。而這些信號通路在眾多研究中被證實與 NSCL/P 的發(fā)病具有強相關性[18，20-22]。因此可以推測Arhgap29 是NSCL/P 一個十分重要的候選基因。

表3 Arhgap29 基因中23 個SNP 位點單倍型分析

國內(nèi)尚未有關于Arhgap29 基因與唇腭裂相關性的研究，本研究針對Arhgap29 基因中23 個常見的SNP 進行了單點分析和多點的相關性分析。H-W 平衡檢驗顯示，對照組的基因型分布符合H-W 平衡，所收集的樣本具有很好的群體代表性。rs3814019、rs72964308、rs7540684 和 rs17396055這4 個位點的等位基因型和基因型頻率在病例組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義，雖然與Letra[12]等學者于2014 年在非西班牙裔唇腭裂白種人群中發(fā)現(xiàn)的Arhgap29 基因上的三個易感位點（rs3789688、rs1541098、rs1576593）并不一致，但不同人群中導致唇腭裂的位點并不相同是有可能的，這也與NSCL/P 病因?qū)W中的基因和環(huán)境因素協(xié)同影響才會形成唇腭裂的理論不違背，所以不同位點的確認更加確認Arhgap29 基因與唇腭裂存在相關性；基于唇腭裂疾病是多因素疾病，在我們進行的多位點的連鎖分析中顯示，23 個SNP位點形成2 個連鎖block 中共有4 個單倍型組合在病例組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義。每個block 中各有2 個單倍型組合，分別為block1 中的單倍型CGCAAGGGCGC（單倍型頻率=0.278，P=0.0406）、單倍型 AATCGGGGCGT（單倍型頻率=0.097，P=0.0479）和 block2 中的單倍型CGTGCTCGGAGG（單倍型頻率=0.456，P=0.0103）、單倍型 CGTATTCAAAGG（單倍型頻率=0.105，P=0.0336）。病例對照研究中四個有意義的位點均位于block2 中，提示block2 是Arhgap29 基因中很有價值的研究區(qū)域。這為我們后期進行Arhgap29 基因與NSCL/P 發(fā)病機制之間的功能驗證奠定了基礎。以上結果和Arhgap29 基因與眾多易感基因的相關性均提示Arhgap29 基因多態(tài)性與NSCL/P 之間存在某種關聯(lián)。

綜上，Arhgap29 單核苷酸多態(tài)性變異與寧夏地區(qū)NSCL/P 人群的發(fā)病有相關性。這一研究結果為我們后期進行Arhgap29 基因與NSCL/P 發(fā)病機制之間的功能驗證奠定了基礎。