胡章喜 , 尚麗霞 , 鄧蘊彥 , 唐贏中

(1. 中國科學院海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島266071)

1 船舶壓艙水(泥)與有害藻華地理擴散

船舶壓載水或壓艙水是 19世紀 70年代以來遠洋船舶在空載或輕載時為保障穩(wěn)定性而從各港口或近海泵入[1], 然而它的大量運輸與排放卻可能對排入地區(qū)的海洋生態(tài)系統(tǒng)造成巨大的負面影響甚至是嚴重的生態(tài)災害[1-2]。最早可能在19世紀90年代就已經有人認識到浮游植物可能通過壓艙水(泥)地理擴散, 但 1908年丹麥哥本哈根大學 Carl Hansen Ostenfeld教授根據歷史紀錄推斷1903—1907年在丹麥發(fā)生赤潮的硅藻中華盒形藻(Biddulphia = Odontella sinensis)是通過船舶壓艙水傳入歐洲的[3], 算是學術界最早發(fā)表于正式學術期刊的相關研究。1973年在一艘到達澳大利亞的遠洋船上檢出了活的浮游動物, 算是對壓艙水導致生物入侵的第一個確證[4]。經過相對沉寂的幾十年, 直到20世紀80年代中期科學界才開始真正意識到這個問題的重要性并開始了一系列定量檢測和研究。1985年Carlton發(fā)表了一篇著名的關于“壓艙水的生物學”的綜述[2], 此后至今的三十多年這個領域開始了爆炸性的發(fā)展, 累計已發(fā)表了至少500篇文章。根據對1955—2013年發(fā)表的近400篇有關壓艙水的文章分析[1], 它們可以被歸為七大類：(1)種類調查, (2)遠海水交換的效率, (3)壓艙水處理系統(tǒng)或工藝的效率, (4)新的分析方法或手段, (5)港口的生物調查, (6)風險評估, (7)不同方向或課題的綜述。從中可以看到, 最初的工作主要是對壓艙水中種類組成的調查, 20世紀90年代后期開展不同航運方式的風險評估以及不同種類的環(huán)境耐受性的研究增多且占據主流, 2000年以后主要研究不同處理方式或策略的效果以及繼續(xù)研究更準確、更具代表性的采樣、分析、檢測技術。值得一提的是, 2007年國際著名同時也是有害藻華領域唯一的專業(yè)學術期刊Harmful Algae出版了第一個有關壓艙水傳播與有害藻華地理擴散關系研究的專刊。2018年, 另一專業(yè)期刊Journal of Sea Research也出版了一期有關壓艙水的專刊, 內容包括了當今世界上很多本領域重要科學家的研究文章或綜述, 如2015年由7個國家的19個研究人員在一艘從佛德角到德國洪堡的船上開展的現場聯(lián)合研究結果, 包括試驗處理設備、處理方法、檢測方法的有效性[4]。大量的研究不僅引起了更廣泛的學術界關注, 也引起了很多國家和政府間組織的高度重視。因此, 國際海事組織(Intergovernmental Maritime Organization, IMO)在1993年和1997年分別出臺了一個關于壓艙水管理的指導性規(guī)范, 2004年2月 13日在倫敦召開的成員國外交大會上更是通過了具有法律約束性的國際公約即《控制和管理船舶壓艙水和沉積物國際公約, The International Convention for the Control and Management of Ship’s Ballast Water and Sediment, BWM Convention》(以下簡稱壓艙水公約)[5]。該公約對船舶壓艙水的排放標準進行了嚴格規(guī)定, 2017年9月8日正式生效。而按照相關程序, 該公約于2019年1月22日起對我國正式生效。全球現共有78個國家/地區(qū)加入了壓艙水公約, 占世界商船總噸位的77.19 %。據10年前的估計, 全世界每年通過商船排放的壓艙水至少35億噸[6]。而對我國約25個主要港口的統(tǒng)計, 每年進出我國沿海水域的壓艙水有數十億噸之多, 實為全球之最。可見, 該公約無論從什么方向看都將對我國產生重要影響。我國加入壓艙水公約, 不僅意味著懸掛我國國旗的國際航行船舶必須滿足該公約要求, 同時意味著我國也可以對泊靠在中國港口的外籍船舶按照該公約實施對壓艙水(泥)的港口國檢查。

自2004年壓艙水公約出臺以來, 我國有關部門向 IMO提出了多項壓艙水管理相關提案, 有的提案已經被采納。有些大學和研究院所的研究人員還從開發(fā)、發(fā)展壓艙水處理技術方面開展了研究, 如氯化處理[7]、強電場電離放電[8-9]、柴油機余熱加熱[10]、微孔過濾與紫外輻射結合處理[11]、低溫等離子體處理[12]等。還有一些關于壓艙水(泥)中外來生物特別是微藻的檢測研究(見后述)。2017年, 科技部立項了由國內多家科研單位承擔的一項重點研發(fā)計劃, 其中就包括《我國近海外來生物入侵災害風險防控技術和裝備研發(fā)》的課題。這都是對公約第 6條要求各當事國單獨或聯(lián)合努力促進、推動壓艙水管理的科技研究的積極響應。有關職能部門如河北海事局已經開始起草《壓載水取樣與檢測技術要求》和《船舶壓載艙沉積物港口接收設施技術要求》的行業(yè)標準, 國家檢驗檢疫局(現屬海關總局)還于2017年在江陰分局成立了壓艙水檢驗檢疫重點實驗室。這些都為我國進行壓艙水和(底泥)管理、處理奠定了良好的基礎?？傊? 如何對進出中國海域的巨量壓艙水(泥)進行檢驗與管理以防止外來生物的入侵, 如何因應壓艙水公約的全面實行從而維護航運業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的同時推動我國水域生態(tài)環(huán)境保護, 是擺在海事管理機構面前的一個重要課題, 也是從事海洋生態(tài)學和環(huán)境保護的研究群體面前的重要研究課題。

海洋有害藻華(Harmful algal blooms, HABs)是一類重要的海洋生態(tài)災害, 過去幾十年以來在世界范圍內頻繁暴發(fā), 并呈現增加的態(tài)勢, 而且若干藻華種類還表現出向其他國家和地區(qū)擴散的趨勢[13-15]。有害藻華為何在世界范圍頻發(fā)和地理擴散, 除水體富營養(yǎng)化是一個已經取得全世界有害藻華生態(tài)學家共識的最重要的外在原因[13-14]和全球氣候變暖的影響之外, 許多研究證明和很多重要的科學家都認為通過船舶壓艙水及其壓艙泥傳播也是非常重要的外部原因[16-21]。如Hallegraeff教授1993年在分析世界范圍有害藻華呈現增加趨勢的原因時給出了四個可能的因素： (1)有害藻華在全球范圍得到重視后增加了有關的研究; (2)近海養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展; (3)人類活動引起的富營養(yǎng)化及氣候變化(如變暖); (4)甲藻孢囊通過船舶壓艙水的異地入侵[22]。在最近剛剛出版的、有全世界眾多著名有害藻華領域的科學家合作的《Global Ecology and Oceanography of Harmful Algal Blooms》一書的前言中, 包括我國有害藻華研究領域領軍人周名江研究員在內的五位主編認為： “可以肯定, 全球范圍的有害藻華發(fā)生的數量、頻次、范圍和持續(xù)時間在過去的幾十年間都在增加。還可以肯定的是這其中很多是由人類活動引起的, 如更多的營養(yǎng)鹽輸入和船舶壓艙水或者水產養(yǎng)殖種類引種導致的藻華生物入侵”[15]。

據統(tǒng)計, 在所有海洋微藻藻華事件中, 其中75%是由甲藻引起的[23], 而且許多種類還會產生各種毒素。甲藻是一類最具有生態(tài)學重要性的浮游植物, 除引起有害藻華和產生毒素外, 也是海洋尤其是近海的重要初級生產者, 而且核糖體DNA測序結果表明它們在表層海洋原生生物中占了大概50%[24]。甲藻一個很重要的生物學特征是其許多種類包括藻華種類在生活史中可以形成休眠孢囊。甲藻的這一特征在其生態(tài)學上具有十分重要的意義。首先, 孢囊由于其較厚的孢囊壁從而能夠抵抗惡劣環(huán)境, 在海洋沉積物中可長期存活(幾個月到長達上100年), 而在環(huán)境條件合適時萌發(fā), 一如高等植物的種子, 從而為一個地域的種群繁衍以致藻華提供種源(seeds)[25-26]。其次, 孢囊對極端環(huán)境的耐受性(黑暗、缺氧、低溫、pH等)和存活能力也使其更容易通過人為或自然過程進行地理擴散, 如通過養(yǎng)殖貝類的異地引種和通過壓艙水及其沉積物(以下簡稱壓艙泥)傳播[16-17,21-22]。已故國際著名有害藻華生態(tài)學家、Harmful Algae前主編Smayda教授說過： “那些被明確認為是通過船舶壓艙水傳播從而異地形成有害藻華的種類無例外的都是產孢囊或者休眠細胞的種類”[21]。因而, 我們可以反過來推論： 那些可以產生休眠孢囊的甲藻理論上都可以通過壓艙泥進行異地擴散。孢囊在極端環(huán)境下的耐受性和存活能力既影響甚至決定了壓艙水(泥)的處理方式的選擇,也影響和決定著處理效果檢測技術的發(fā)展與選擇。更進一步, 在我們針對防范有害藻華通過壓艙水傳播的檢測或者處理技術的評估中, 都應該以壓艙泥中的甲藻孢囊作為最主要的檢測或者研究內容。

從20世紀 90年代起, 中國有害藻華(主要是甲藻)的發(fā)生頻率、規(guī)模和面積(即時空廣度)不斷增大,對我國沿海養(yǎng)殖業(yè)、漁業(yè)資源、漁產品質量、生態(tài)環(huán)境、人類健康構成了重大的危害和威脅, 有些還會給海洋生態(tài)系統(tǒng)健康(如對生物多樣性的影響)和核電設施構成威脅[25,27-29]。在有害藻華發(fā)生頻次、規(guī)模、危害程度增加的同時, 特別值得關注的是新的有毒有害藻華甲藻的種類數也在最近十幾年不斷發(fā)現[30-31], 如太平洋亞歷山大藻或鏈狀亞歷山大藻[32]、劇毒卡爾藻(Karlodinium veneficum)[33-36]、多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides, 即多環(huán)旋溝藻)[37]、褐色馬格里夫藻(Margalefidinium fulvescens, 即褐色旋溝藻)[38],Azadinium poporum[39]、Takayama xiamenensis[40]、寶石多溝藻(Polykrikos geminatum)[41]和若干從沉積物孢囊萌發(fā)而發(fā)現的若干新紀錄種和新種, 如Gymnodinium microreticulatum[42]、Gymnodinium inusitatum[42]、Scrippsiella enormis[43]、Azadinium dalianense[44]。邏輯上很自然的, 新出現的藻華類型和新發(fā)現的種類是本來就已經長期存在于中國還是外源入侵種就成為一個具有重要科學和現實意義的問題。要回答此問題, 就必須從可能的外源傳播途徑如壓艙泥和我國海域沉積物二個方面開展工作。雖然可能通過壓艙水(泥)傳播的外源生物包括各種動物(特別是浮游動物)、浮游植物、真菌、細菌到病毒, 但本文關注的是最主要的有害藻華原因類群-甲藻的休眠孢囊, 故以下對國內外研究進展的敘述只包括甲藻, 偶或涉及其他有害藻華類群。

2 國內外有關壓艙泥中甲藻孢囊多樣性的檢測與溯源

船舶壓艙水及其底泥很早就被證明是外源浮游生物入侵的重要攜帶者[16,20-21]。其中, 有害藻華種類隨壓艙水(泥)傳播更是在最近二十年引起廣泛關注和擔憂。自 1908年 Ostenfeld[3]發(fā)表他推斷 1903—1907年在歐洲暴發(fā)赤潮的中華盒形藻是通過壓艙水傳入的文章后, 有關研究沉寂了 70多年[2]。一直到1985年伍茲霍爾海洋研究所的被稱為“海洋入侵種(研究)先驅”(“Marine Invasive Species Pioneer”)[1]的Carlton 發(fā)表著名的關于“壓艙水生物學”的全面綜述并提出了一個海洋生物通過壓艙水(泥)入侵定居的四階段概念模型才掀起了一個關于壓艙水研究的高潮, 從那時以來已經發(fā)表了至少 500篇以上的研究文章。

在眾多對壓艙水中浮游植物的檢測中, 不少研究早就發(fā)現壓艙水中的浮游植物種類會因為浮游動物捕食、黑暗、缺氧、溫差等原因隨時間(航行距離)很快減少[45-47]。而甲藻由于能夠在脅迫條件下形成休眠孢囊沉入壓艙泥, 從而保持長期存活[48]。所以,雖然在剛剛泵入壓艙水時取樣在水中能夠找到較多的甲藻(營養(yǎng)細胞)和其他浮游植物, 但在長時間航行之后(如半個月或以上), 在到港的壓艙泥中反而會保留比壓艙水中多很多的甲藻種類[17,49-50]。而由于休眠孢囊對環(huán)境脅迫具有更大的抗性和適應性[25,51], 其入侵風險也要高于壓艙水中以營養(yǎng)細胞存在的種類。由于壓艙水公約的要求首先是針對水而不是泥,且需要檢測、達標的是所有生物(除了我們關心的浮游植物, 還有大者如蝦蟹, 小如細菌病毒), 所以國內外大量的研究, 尤其是那些意在評價處理方法效果的隨船跟蹤監(jiān)測, 把注意力更多地傾注于對壓艙水而不是壓艙泥的檢測。

20世紀80年代末至90年代初, 澳大利亞塔斯馬尼亞大學的Hallegraeff教授實驗室對形成有害藻華藻類特別是甲藻和硅藻的休眠孢囊通過船舶壓艙水傳播從而地理擴散的國際共識作出了奠基性的貢獻[16-17]。他們通過對澳大利亞18個港口中的343艘船只的壓艙水及壓艙泥進行調查(光鏡和掃描電鏡觀察以及孢囊萌發(fā)試驗), 發(fā)現所有的沉積物樣品中都存在大量硅藻和硅藻休眠孢子(resting spore), 包括大量澳大利亞本地沒有的種類, 50%的沉積物樣品中存在總共53種甲藻孢囊(resting cyst), 其中包括許多非本地種,有 20種孢囊和孢子得到成功萌發(fā)。尤其引人注意的是, 16艘船的壓艙泥中檢測出麻痹性貝毒(PSP毒素)原因種塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense, 根據最新關于塔瑪復合體的分類, 該種極可能是A. australiense, 澳洲亞歷山大藻)、鏈狀亞歷山大藻(A.catenella=A. pacificum, 太平洋亞歷山大藻)和鏈狀裸甲藻(Gymnodinium catenatum), 最多的單個壓艙底泥中攜帶3億個塔馬亞歷山大藻孢囊[17]。他們的研究結果直接推動了澳大利亞檢驗檢疫部門于 1991年制定了有關壓艙水管理和控制的法規(guī)[30]。自那以后, 不同國家和實驗室的科學家繼續(xù)從壓艙泥中開展甲藻孢囊的檢測。如Macdonald[52]從90%的到岸英國運輸石油天然氣的貨輪壓艙泥樣品中檢出甲藻孢囊。Hamer等[53]從到達英格蘭和威爾士港口船只的壓艙泥中檢出48種甲藻孢囊, 包括有毒的、形成藻華的、本地沒有的種類。Burkholder等[46]從美國軍用船只壓艙水中檢出了 33種甲藻, 包括重要的有害有毒種類如Dinophysis acuminata, 劇毒卡爾藻(Karlodinium veneficum), 微小原甲藻(Prorocentrum minimum)。較重要的是, Casas-Monroy等[54]從加拿大東西海岸和大湖區(qū)的147條船的壓艙泥中檢出60種甲藻孢囊, 尤其是檢出了當地港口海域未曾發(fā)現過的劇毒的魚毒性甲藻多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides)。

前面列舉的從壓艙泥中鑒定甲藻孢囊的工作都是通過光鏡或掃描電鏡的形態(tài)觀察, 也有少數情況通過挑取單孢囊萌發(fā)[16-17,53,55-56]。但是, 除了耗時費力以外, 形態(tài)鑒定或孢囊萌發(fā)都需要專業(yè)的訓練,甚至是分類專家也會覺得非常困難, 因為不同種類孢囊可能形態(tài)極為相似, 或形態(tài)高度簡單, 或孢囊體積極小, 或分類學特征難以判別。這樣, 錯誤鑒定就很常見, 甚至難以避免[57-58]。但分子生物學技術的進步為我們準確鑒定孢囊種類提供了多種選擇, 如熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、熒光定量PCR(fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qPCR)、單細胞PCR(single-cell PCR)等。分子技術甚至可以幫助我們對某地新出現的種類進行溯源[59-62]。比如, 至今最可靠的一個例證是 Hallegraeff實驗室應用分子標記, 輔之以沉積物的同位素定年和分子進化分析, 令人信服地推斷出現在澳洲塔斯瑪利亞的塔瑪亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻非?？赡苁?00多年前通過運木材的船從日本、韓國或其他東南亞國家攜帶過來的[20,63]。最近的例子是Garrett 等[55]通過LSU rDNA和ITS序列分析, 推斷從一艘經全球航行停靠佛羅里達坦帕灣港的商船中壓艙泥樣品中分離的有毒甲藻Vulcanodinium rugosum很可能起源于日本, 因為分子進化分析表明其與新西蘭本地以及法國的種群有別, 但與日本種群完全吻合。

隨著高通量測序技術(High-throughput sequencing)又稱“下一代”測序技術(Next-generation sequencing,NGS)的成熟, 其高通量、靈敏性、特異性、自動化等特征可以使之應用于大量環(huán)境樣品的快速檢測, 因此可望在壓艙泥甲藻孢囊的檢測與風險評估中具有巨大的應用前景。Zaiko等[64]曾經建議過應用此技術于壓艙水(泥)的檢測, 但在我們下節(jié)將要介紹的本實驗室最近的工作之前, NGS還沒有被應用到這一領域。

我國開展有關壓艙水(泥)的研究主要都是在2004年IMO的壓艙水公約出臺之后(除個別例外)。李偉才等[65]于 2003—2004年對日照港和鄰近錨地水域及其船舶壓艙水中的浮游植物進行了調查, 結果發(fā)現壓艙水中含有較高的有害物種, 從 23艘日照港口的入境船舶壓艙水樣品中鑒定了浮游植物41種(硅藻36種, 甲藻4種, 金藻1種)。楊清良等[66]檢測了2006—2007年間福建省4個港口12艘外輪的壓艙水樣品, 檢出浮游植物7門86屬240種(包括60種赤潮生物)和浮游動物5門30屬52種。張金鵬等[67]檢測了5艘廈門港國際船舶的14個壓艙水水樣中的硅藻, 檢出硅藻37屬111種, 其中赤潮種28種, 潛在有毒種1種, 非本海域種6種。楊清良等[68]又從壓艙水中檢出分屬于7個浮游植物門類和5個動物門類的309種壓艙水生物(包括 60種赤潮生物), 還從來自東南亞港口的船舶壓艙水中檢出了 12種福建口岸本地及鄰近海域從未記錄的 12 種淡水和半咸水藻類。可以看到, 這些初步研究都是只檢測壓艙水樣品, 所檢出的以硅藻為主, 因為是到岸船舶, 所以甲藻種類較少。而對壓艙泥中甲藻孢囊的檢測, 迄今只見到戴鑫烽等[69]用光學顯微鏡方法鑒定?？恐凵礁鄣?艘商船壓艙泥樣品的工作, 共鑒定出 24種甲藻孢囊, 3種未知種孢囊, 也發(fā)現4份樣品中甲藻孢囊的種類組成具有明顯差異, 但均檢測出能產生麻痹性貝毒的甲藻孢囊種類, 如亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻?？偫ǘ? 由于起步較晚或者認識不足, 我國開展的壓艙泥甲藻孢囊的工作還極少或者初步(如只有光鏡鑒定一種手段), 有害藻華研究群體對基本的風險認識因為各種條件限制(如很難采集到壓艙水樣品, 壓艙泥樣品因為技術上的限制更難)還很不充分, 而且對我們中國海域的本底情況即甲藻種類區(qū)系還沒有全面的了解, 所以很難判斷是否存在壓艙水帶來的生態(tài)入侵及其風險有多大。研究的整體水平和受重視程度不僅與美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、德國、日本的差距很大, 與我們國家作為海洋大國、貿易大國的地位極不相稱, 對我國生物多樣性保護、防范生物入侵和外來有毒有害種類暴發(fā)藻華,以及應對貿易爭端和制定反制措施甚為不利, 對認識我國生物多樣性本底狀況也甚為不利。

3 美國港口船舶壓艙泥中甲藻孢囊具有很高的種類多樣性和樣品間的異質性

我們自2015年起與美國歐道明大學Dobbs教授合作, 通過應用自主設計的特異性引物、高通量二代測序、生物信息學分析、光鏡和掃描電鏡觀察、單孢囊PCR克隆測序等手段, 研究了2001—2003年采自?？吭诿绹蠛^(qū)(the Great Lakes)和切薩皮克灣(Chesapeake Bay)的23艘船舶壓載艙的32份底泥樣品中甲藻孢囊的種類多樣性(樣品在 4℃黑暗條件下已經保存 12～14年), 并由此獲得了一系列非常重要的結果和認識(圖1)[70]。這也是國際上首次采用高通量測序和分子條形碼技術檢測壓艙泥中的甲藻孢囊。

首先, 我們在壓艙底泥中檢測到了很高的甲藻種類多樣性。32個樣品平均每個得到 79個 OTUs (operational taxonomy unit, 可以簡單理解為相當于種的分類單元)。在 801個甲藻 OTUs中, 包括至少 10目30科63屬, 特別是有高達62%的OTUs不能注釋到GenBank中任何已知種類[間隔區(qū)(gaps)＞ 50 bps, 覆蓋長度＜ 85%, 或相似性＜ 80%]。需要說明的是, 這不是所采用方法的限制, 而是因為自然界存在著大量還沒有被人們發(fā)現、研究、描述的種類。即使在307個得到很好注釋的OTUs中, 也有51個OTUs在GenBank最近的參考序列沒有注釋或鑒定到種。所以, 加起來就有68%或545個OTUs很可能都是還未被研究過的新種甚至新的屬、科、目。另外的256個OTUs 被完全注釋到 71個種(注： 因為種下遺傳多樣性甚至種下的不同生態(tài)型以及隱存種, 很多 OTUs會被注釋到一個種, 如61個OTUs 注釋到Scrippsiella acuminata), 其中 56個種還從未在此前的壓艙泥中被發(fā)現報道過(即本研究為首次報道)。我們完全鑒定的 73個種(包括2個通過單孢囊PCR克隆測序獲得鑒定)使得迄今為止文獻中報道的從壓艙泥中檢測到的甲藻種類達到142種(本研究占50 %)。我們從壓艙泥中獲得如此高的甲藻種類多樣性, 是通過傳統(tǒng)顯微鏡下的形態(tài)學鑒定無論如何難以獲得的。

第二, 我們觀察到樣品間種類組成的高度異質性(heterogeneity)。表現在四個方面： (1)雖然有16個OTUs在超過50 %的樣品中檢出, 但沒有一個OTU在所有32個樣品中都出現; (2)把32個樣品按照停泊港口分為5組進行維恩圖分析發(fā)現, 只有31個OTUs為 5組樣品所共有(都是常見的產孢囊種類); (3)PCoA分析也清楚地表明, 樣品間, 甚至同一條船不同艙的樣品間, 其種類組成也有很大差異; (4)分別有366和146個OTUs只在1個或2個樣品中檢出, 絕大部分都是還未被描述的種類。毫無疑問, 這種異質性是由不同船舶的航線和航行歷史以及不同壓水艙的注水歷史造成的。

第三, 在我們完全鑒定的73種甲藻中, 有36種藻華原因種, 18種有毒種(如5種亞歷山大藻Alexandrium affine,A. fundyense,A. ostenfeldii,A. pacificum,A.pseudogonyaulax,Gymnodinium catenatum,Azadinium poporum,A. polongum,Karenia cristata,K. papilionacea,Apocalathium aciculiferum,Margalefidinium polykrikoides,Margalefidinium fulvescens), 23種此前未報道過能產生孢囊, 9種直徑小于15 μm (其中只有一種此前在壓艙泥中檢測到), 34種為近10年內新描述的種, 56種為首次在壓艙底泥中報道。這里列出的每一個數字都具有值得深思的重要意義。

圖1 壓載艙底泥中甲藻孢囊的種類多樣性研究流程(包括通過應用自主設計的特異性引物、高通量二代測序、生物信息學分析、光鏡和掃描電鏡觀察、單孢囊PCR克隆測序等手段)和主要研究結果[70]Fig. 1 Analytical procedures for dinoflagellate resting cyst biodiversity in ballast tank sediments (including the design of specific primers targeting the D2 domain of LSU rDNA, high-throughput sequencing, bioinformatics analysis, light and scanning electron microscopy observation, and single-cyst PCR sequencing) and the main research results[70]

第四, 為驗證上述的高通量測序的檢測結果(證明檢測到的種類為孢囊), 我們從壓艙泥中通過挑取單孢囊和單細胞PCR測序鑒定檢測到7種孢囊, 其中有二個種的孢囊即多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides)和寶石多溝藻(Polykrikos geminatum)特別重要(見圖 2), 值得在此討論。多環(huán)馬格里夫藻是世界廣布的裸甲藻, 經常形成大規(guī)模有害藻華, 對水生生物有劇毒[71-72], 對其他浮游植物具有強烈化感作用[73], 已證明能形成休眠孢囊[74-75], 而且過去三十年在全球呈現出非常明顯的地理擴散趨勢[76]。該藻1998年在我國香港和2010年以來在我國東海、黃海膠州灣海域有過暴發(fā)不同規(guī)模藻華的記錄。該藻在全球不同海域的種群在LSU rDNA序列上具有較大的遺傳差異, 或者種群遺傳分化, 從而被分為四種核糖體型(美洲/馬來西亞型、東亞型、菲律賓型、地中海型)[77-78]。有趣的是我們從二條船的壓艙泥中分別分離、鑒定到其中的美洲/馬來西亞核糖體型和東亞核糖體型, 這是形態(tài)學鑒定不能識別出來的。寶石多溝藻自 2006年以來在我國珠江口海域連年暴發(fā)藻華[79], 我們最近的研究證明該種其實在中國四大海域都有分布,但以南海海域最常見、豐度上南高北低, 似乎有自南向北的擴散趨勢(尚未發(fā)表數據)。除我國外, 此前只在澳大利亞和日本報道過。因此, 我們上述結果既為有害甲藻可通過壓艙泥傳播和入侵提供新的個例, 也對我國近些年才出現的這二種有害藻華藻提出了它們是本地種還是入侵種的重要問題。

圖2 從壓艙泥中通過挑取單孢囊和單細胞PCR測序鑒定出來的多環(huán)馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides)和寶石多溝藻(Polykrikos geminatum)孢囊Fig. 2 Resting cysts of Margalefidinium polykrikoides andPolykrikos geminatum identified by single-cell PCR,cloning, and sequencing from ballast tank sediments.Note： cysts of A and B were Margalefidinium polykrikoides, belonging to the American/Malaysian ribotype; the cyst in C was Margalefidinium polykrikoides, belonging to the East Asian ribotype; and the cyst in D was Polykrikos geminatum[70]

需要說明的是, 對于可能有人質疑高通量測序檢測到的是否為孢囊, 我們有若干理由表明它們最可能是孢囊, 雖然來自營養(yǎng)細胞及其 DNA殘留的可能性尚不能完全排除： (1)樣品在 4℃環(huán)境下已經保存12～14年, 營養(yǎng)細胞的DNA應該基本被降解; (2)我們檢測到的豐度最高、在樣品中出現頻率最高的種類基本上都是在海洋沉積物中常見的(Pelagodinium béii=Gymnodinium béii除外, 因為其是否產孢囊尚未見諸于文獻); (3)得到完全鑒定的種類中超過 70%是文獻中已經證明為產孢囊的種類; (4)我們光鏡和電鏡觀察確乎看到了大量孢囊種類, 其中多數都是根據形態(tài)難以鑒定的(現代甲藻孢囊研究的先驅、奧斯陸大學Barrie Dale教授在本實驗室訪問研究時也難以通過形態(tài)鑒定); (5)我們通過單孢囊 PCR測序鑒定的 7種孢囊就包括了高通量測序得到的種類Polykrikos geminatum和Scrippsiella acuminata, 及沒在高通量測序中確證的Apocalathium malmogiense和二種核糖體型的多環(huán)馬格里夫藻。

4 科學問題與研究方向

從我們最近的工作及與文獻報道的工作比較,我們可以得到這樣幾個結論：

(1) 由于方法的限制(光學顯微鏡為主)、分類學的滯后(還有“一個隱藏的世界”等待發(fā)現)[80]和樣品覆蓋面有限, 對通過壓艙泥攜帶、傳播的甲藻孢囊的種類多樣性和有毒有害甲藻的種類被很大程度地低估了。換句話說, 通過壓艙泥傳播有害藻華甲藻的風險可能比以前認識的還要大。有趣的是, 近20年前有人做過同樣的呼吁： “雖然有很多證據了, 但壓艙水傳播的浮游植物多樣性可能還是沒有充分的被人認識到”[19]。這一觀點今天仍然成立。

(2) 從我們的研究可以判斷, 迄今為止, 基于光鏡下形態(tài)學鑒定對船舶壓艙泥中甲藻孢囊種類的檢測不可能獲得對壓艙泥中孢囊種類多樣性的全面認識。形態(tài)學方法能夠鑒定那些細胞較大、形態(tài)特征明顯、豐度高、有參考圖譜的種類, 反之, 對孢囊體積很小(＜ 20 μm)、形態(tài)高度簡單(球形)或相似、缺少鑒別性特征、豐度較低、新描述或命名的種類就不易甚至不可能鑒定出來, 更不用說大量尚未被發(fā)現和描述的種類了。相較之下, 從對大量樣品中進行種類的準確鑒定而言, 只要采用的分子條形碼適當和測序深度足夠, 應用高通量二代測序具有毋庸置疑的優(yōu)越性。特別需要指出的是, 對于那些現在還不能完全鑒定的種類, 所獲得的特征性基因序列數據庫將為以后的入侵種溯源和譜系地理學研究提供重要的數據資源。

(3) 此前的研究和綜述文章都未曾對船舶間甚至一艘船不同艙的樣品間的種類組成的高度異質性予以重視。很明顯, 這是由船舶的整個航行歷史決定的, 如泵入壓艙水的海域、航行路線與距離、是否清洗壓艙水艙、是否采取處理措施等。邏輯上, 其實這也可以理解, 正是因為每種甲藻都有其自然的地理分布范圍, 才有這種不同船舶間種類組成的異質性,也才有外源生物入侵的風險與擔憂, 也才有通過壓艙泥的檢測對入侵種類進行溯源的可能性。

從壓艙水處理技術、工藝、設備研究和開發(fā)領域的角度看, 種類多寡或風險高低對其影響不大。但從有害藻華生態(tài)學和壓艙水(泥)的檢驗檢疫角度,則不能采取這樣實用主義的立場。因為, 我們要對可能已經發(fā)生的和未來可能發(fā)生的入侵風險做出更明確的實證性評估和開展追根溯源研究, 要對壓艙水(泥)中可能帶來的重要種類采取針對性的檢測和追溯來源國家或港口(但只有知道了哪些種才能開發(fā)特異性的檢測技術)。因此, 根據上文對國內外研究的綜述和對我們最近的相關工作的簡述, 提煉出了研究有害藻華種類通過壓艙水(泥)入侵的科學問題和基本技術路線：

(1) 外源有害藻華通過壓艙水(泥)入侵中國的風險到底有多高？我們認為此問題實際上可以轉換為下列二個問題： 進入中國港口的船舶壓艙泥中的甲藻孢囊種類清單與中國海域沉積物中的孢囊種類有哪些不同？不同來源的壓艙水底泥中的甲藻孢囊清單或名錄之間存在的差異與船舶航行歷史有多大的關系？已有工作基礎讓我們確信, 只有同時獲取足夠數量和代表性的壓艙泥樣品和中國海域的沉積物樣品并對之進行比較完備的檢測, 才能對到底有多高的入侵風險做出更明確的評估。簡單言之, 當壓艙泥中含有中國海域沉積物中沒有的有毒有害種類越多, 則由船舶壓艙水(泥)帶來的外來種入侵風險就越高。因此, 我們必須獲得和對照中國海域沉積物中和更多不同來源的到港船舶壓艙泥中甲藻孢囊清單,以此為基礎評估壓艙水(泥)帶來的有害藻華種類入侵我國海域的可能風險, 建立重點檢測種類的名錄。

(2) 我們通過高通量測序從壓艙泥中檢測到的種類, 特別是以前從未從壓艙水及其沉積物報道的種類和還沒有報道產孢囊的種類, 到底來自于孢囊還是營養(yǎng)細胞或 DNA碎片？這一科學問題的來源是,盡管根據前面的論證, 我們可以判斷用高通量測序檢測到的種類最可能是來自于孢囊而不是營養(yǎng)細胞,但是在我們與不同學術背景專家的互動和特別是與領域內眾多研究者的討論使我們意識到必須對這一問題或人們的保留態(tài)度有更積極的、科學的應對。因為, 對此問題更令人信服的回答不僅可能解除形態(tài)學背景和分子生物學背景研究者的二個方面的疑惑, 本身也具有重要的生物學和生態(tài)學意義, 因為證明一種藻華甲藻能夠形成休眠孢囊就為其藻華暴發(fā)以致地理擴散提供了一種最重要的機制[25-26,51]。我們知道, 應用分子生物學手段檢測可以得到更完備、準確的名錄, 尤其是大量的未知種類(即未被研究、描述的種類), 但可能會被質疑得到的信號可能來自營養(yǎng)細胞(或 DNA片斷)。反之, 使用傳統(tǒng)光學顯微技術進行檢測和形態(tài)學鑒定, 可以看到一個個細胞是營養(yǎng)細胞還是孢囊, 似乎“有圖有真相”, 然而這只適合豐度較高、形態(tài)特征明顯、孢囊較大、已經有參考圖譜的種類。而這類孢囊實際上只占能夠產孢囊種類的少部分[25,70]。對于孢囊形態(tài)高度類似、豐度低、形態(tài)簡單、個體很小的種類(小于20 μm;絕大部分研究中采用20 μm篩絹或篩網來分離孢囊時很可能漏掉)和未曾深入研究和證明產孢囊的種類就不合適。因此, 我們必須建立分子檢測和形態(tài)鑒別相結合的技術手段, 以得到更全面、準確、確定的信息。具體而言, 就是在高通量第二代測序甚至第三代測序得到種類名錄的基礎上, 根據序列信息, 對重要的、代表性的種類(產毒素的; 未曾報道產孢囊的;種類不確定的; 肯定是新種、屬的, 等等), 設計特異性分子探針和引物, 應用 FISH-LM-Single-cell PCR克隆測序的手段, 得到特定孢囊的準確又有形態(tài)觀察的鑒定。我們前期對多環(huán)馬格里夫藻、米氏凱倫藻、寶石多溝藻等重要種類的檢測[70,81]證明了此研究路線的有效性。當然, 如果通過孢囊萌發(fā)建立有價值種類的實驗室純培養(yǎng)系, 則是在這一重要領域探索的額外“紅利”。

綜上, 在對我國近海沉積物中孢囊的多樣性獲得更加全面的認識后, 再對海外到港船舶壓艙泥中孢囊進行細致的采樣和分析, 將能夠對船舶壓艙水(泥)可能給中國海域帶來的外源有害藻華種類入侵風險得到一個系統(tǒng)、全面的實證性評估依據, 為我國最近幾十年出現的新型有害藻華種類是否為外源入侵種提供初步的解釋證據。更重要的, 為我國在正式加入IMO的壓艙水公約后開展對?？恐袊劭诘耐廨嗊M行有關檢驗檢疫的執(zhí)法提供重要的、最基礎性的依據, 也為我國有害藻華防控和預警預測提供重要的第一手參考資料。