辛瑞祥 張勇 曹陽(yáng) 王秀云 牛星 王輝 牛鐘相③*

試驗(yàn)研究

有益菌降解霉菌毒素及抗菌產(chǎn)酶效果研究

辛瑞祥①?gòu)堄垄俨荜?yáng)①王秀云①牛星②王輝①牛鐘相①③*

（①濰坊華英生物科技有限公司 山東 濰坊 261000 ②山東力明科技職業(yè)學(xué)院 山東 泰安 ③山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安）

為了探索有益菌降解霉菌毒素、抵抗病原菌、分泌消化酶的效能。采用微生物培養(yǎng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)技術(shù)、藥敏試驗(yàn)及常規(guī)酶類(lèi)檢測(cè)方法，對(duì)初步篩選的8株有益菌(其中2株乳酸菌，編號(hào)R-2、R-3；4株芽胞菌，編號(hào)Y-1、Y-2、Y-3、Y-4和2株酵母菌，編號(hào)J-4、J-6)進(jìn)行了系統(tǒng)的試驗(yàn)。結(jié)果表明，8株不同類(lèi)型的有益菌對(duì)黃曲霉毒素均有一定的降解作用，其中降解率較高的菌株R-3為54.5%、Y-2為58.72%、J-4和J-6分別為90.57%和73.21%；對(duì)嘔吐毒素降解率最高的是Y-2 (51.57%)；對(duì)玉米赤霉烯酮降解率效果最好的是Y-1和Y-2，分別為56.57%和70.70%。在抑菌方面，乳酸菌R-2、R-3菌株和芽胞菌Y-1、Y-2菌株對(duì)致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均具有很強(qiáng)的抑制殺滅作用；芽胞菌Y-1、Y-2菌株還具有分泌蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶的能力。結(jié)論：8株有益菌不但能夠降解霉菌毒素，而且還具有抗菌和產(chǎn)酶能力。

霉菌毒素 降解 有益菌 抗菌 產(chǎn)酶

霉菌毒素(Mycotoxin)是指霉菌在其所污染的谷物或飼料中所產(chǎn)生的一類(lèi)有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要有曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌產(chǎn)生[1, 2]。霉菌毒素不僅降低飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，影響適口性，導(dǎo)致畜禽采食量下降，而且還會(huì)造成動(dòng)物生長(zhǎng)停滯、免疫力降低、生產(chǎn)性能下降，甚至中毒死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

科學(xué)工作者不斷地進(jìn)行霉菌毒素的預(yù)防和祛除方面的研究，取得了許多經(jīng)驗(yàn)和方法。目前，霉菌毒素的去除方法主要有物理去除法、化學(xué)去除法及生物去除法。綜合比較各種方法，現(xiàn)在市場(chǎng)上常用的霉菌毒素去除方法主要為物理吸附法和生物降解法[4]。傳統(tǒng)的物理祛除霉菌毒素的方法存在效果不穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)成分損失大、影響飼料適口性且難以規(guī)?；a(chǎn)等缺點(diǎn)；化學(xué)處理法容易造成最終產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)的殘留以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞，其安全性還需要進(jìn)行更多的研究。生物降解法，即利用自然界存在的微生物或其代謝產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，在其自然生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中將霉菌毒素的毒性基團(tuán)破壞，生成無(wú)毒代謝產(chǎn)物的一種方法。該技術(shù)具有解毒效率高、特異性強(qiáng)、對(duì)飼料和環(huán)境沒(méi)有污染等優(yōu)勢(shì)，備受研究者的關(guān)注[5]。另外，有益菌除能祛毒外，還有維持腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體免疫力、抗菌防病、營(yíng)養(yǎng)保健等功能。因而，此類(lèi)型的微生態(tài)制劑推廣應(yīng)用的前景十分廣闊。

本研究成功篩選到了多株降解霉菌毒素效果好、殺菌能力強(qiáng)、產(chǎn)酶量高的有益菌株，為研制具有降解霉菌毒毒素、抗菌促生長(zhǎng)等功能的新型微生態(tài)制劑提供了菌種保證和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 Bio-Radimark酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂(lè)生產(chǎn)；高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等，均由本公司研發(fā)中心提供。

1.1.2 試劑 黃曲霉毒素、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮ELISA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自江蘇伯克生物技術(shù)有限公司。MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、纖維素酶測(cè)定培養(yǎng)基、淀粉酶測(cè)定培養(yǎng)基、蛋白酶測(cè)定培養(yǎng)基，均購(gòu)自濰坊市化學(xué)試劑商店。

1.1.3 菌種 2株乳酸菌(R-2、R-3)、4株芽胞菌(Y-1、Y-2、Y-3、Y-4)和2株酵母菌(J-4、J-6)菌種；6株病原菌，其中1株致病性大腸桿菌(O2)，4株沙門(mén)氏菌(編號(hào)10、78、132、135)和1株金黃色葡萄球菌菌種，均由濰坊華英生物科技有限公司研發(fā)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 取乳酸菌株(R-2、R-3)、芽胞菌株(Y-1、Y-2、Y-3、Y-4)和酵母菌株(J-4、J-6)菌種，分別接種MRS液體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基，分別于37℃厭氧培養(yǎng)24h、37℃需氧培養(yǎng)24h和30℃需氧培養(yǎng)48h活化，放4℃?zhèn)溆?。?株沙門(mén)氏菌、1株致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌種分別接種LB液體培養(yǎng)基，于37℃需氧培養(yǎng)18h活化，放4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 霉菌毒素的降解實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)活化的各株乳酸菌、芽胞菌、酵母菌菌液分別離心，然后分別取離心上清與霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品(黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.54ng/ml、嘔吐毒素濃度為27ng/ml和玉米赤霉烯酮濃度為8.1ng/ml)一定量混合，另外按一定比例分別取MRS、LB和YPD液體培養(yǎng)基和霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品混合(做空白對(duì)照)，37℃作用18h。按三種霉菌毒素ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法分別檢測(cè)各種毒素降解后殘留量；計(jì)算霉菌毒素降解率。霉菌毒素降解率(%)=(培養(yǎng)基空白對(duì)照中霉菌毒素濃度-降解后霉菌毒素濃度)/培養(yǎng)基空白對(duì)照中霉菌毒素濃度×100。

1.2.3 有益菌抗菌(抑菌)力實(shí)驗(yàn) 將致病性大腸桿菌O2株，4株沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌菌液分別用滅菌生理鹽水稀釋至1.0×107CFU/ml濃度，分別吸取100μl稀釋菌液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，均勻涂布。然后分別在涂布不同病原菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上放置8個(gè)牛津杯，牛津杯內(nèi)分別加入各株有益菌的過(guò)濾培養(yǎng)上清液，將平板水平放置于37℃培養(yǎng)箱18h，觀察、記錄抑菌圈直徑。

1.2.4 有益菌產(chǎn)酶效果實(shí)驗(yàn) 在分別含有一定量蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素的特殊瓊脂培養(yǎng)基板上打孔，8孔/每板；在每種培養(yǎng)基板孔內(nèi)分別加入8株有益菌的過(guò)濾培養(yǎng)上清液一定量，將平板放置于37℃孵育，觀察測(cè)量(蛋白酶圈可直接測(cè)量，淀粉酶采用革蘭氏碘液染色后觀察測(cè)量，纖維素酶平板先用剛果紅染色，再用醋酸液固定后測(cè)量酶解圈)、記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同有益菌株對(duì)霉菌毒素降解效果

表1 各株有益菌對(duì)三種霉菌毒素的降解效果(ng/ml、%)

由表1可知，對(duì)黃曲霉毒素降解效果最好的菌株為J-4和J-6，降解率分別達(dá)90.57%和73.21%，其次是Y-2、R-3和R-2，分別為58.72%和54.51%和44.55%；對(duì)嘔吐毒素降解效果較好的菌株為Y-2(51.57%)和Y-1(48.62%)；對(duì)玉米赤霉烯酮降解效果較好的菌株是Y-2(70.70%)和Y-1 (56.57%)；其中Y-2對(duì)三種霉菌毒素均有較好的降解作用。

2.2 有益乳酸菌對(duì)病原菌的抑制效果

表2 乳酸菌對(duì)病原菌的抑菌圈直徑 (mm)

由表2結(jié)果顯示，2株乳酸菌對(duì)致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，R-3株乳酸菌效果較好。

2.3 有益芽胞菌和酵母菌對(duì)病原菌的殺滅效果

表3 芽胞菌和酵母菌對(duì)病原菌的抑菌圈直徑 (mm)

由表3結(jié)果可見(jiàn)，芽胞菌Y-1和Y-2株對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌均有較好的抑制、殺滅作用，Y-3、Y-4株效果最差。4株芽胞菌對(duì)金黃色葡萄球菌均具有較好的殺滅作用，2株酵母菌對(duì)各病原菌均沒(méi)有抑制作用。

2.4 有益菌的產(chǎn)酶效果

由表4結(jié)果顯示，芽胞菌具有一定的產(chǎn)酶能力，其中Y-1、Y-2株芽胞菌可分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶三種酶，Y-3和Y-4株芽胞菌僅分泌一定量的纖維素酶；而2株乳酸菌和2株酵母菌對(duì)三種酶均不分泌。

表4 有益菌產(chǎn)酶圈直徑 (mm)

3 討論

3.1 霉菌毒素降解菌的篩選

霉菌毒素在地球上的存在年限甚至比人類(lèi)的歷史還要悠久，雖然其性質(zhì)穩(wěn)定，但并未因毒素的積累而造成災(zāi)害，故推斷自然界本身存在可降解霉菌毒素的微生物或其它因素[6, 7]。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)許多有益菌及其代謝產(chǎn)生的酶能夠降解霉菌毒素。李冰等[8]篩選到的黑曲霉菌，對(duì)黃曲霉毒素B1的降解率高達(dá)93.28%，研究發(fā)現(xiàn)降解黃曲霉毒素B1的活性成分主要是胞外酶。關(guān)心[9]用香豆素作為黃曲霉毒素B1的替代物成功到一株芽孢桿菌(菌株F6)，其對(duì)黃曲霉毒素B1降解率高達(dá)83.2%。王燕等[10]用香豆素為唯一碳源和能源篩選得到一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(菌株WZ-4)，其對(duì)黃曲霉毒素B1降解率為75.25%。左瑞雨等[11]采用黃曲霉毒素B1作為唯一能源和碳源的方法進(jìn)行初篩，然后通過(guò)分離、富集培養(yǎng)，篩選得到對(duì)黃曲霉毒素B1降解率高達(dá)77.05%的真菌Y8，真菌 26S rDNA菌種鑒定和同源序列分析結(jié)果顯示，真菌Y8為米曲霉。本研究采用先進(jìn)的霉菌毒素微量殘留檢測(cè)技術(shù)，對(duì)初選的多株有益菌的降解霉菌毒素效果進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芽胞菌Y-2株對(duì)黃曲霉毒素、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮均有較好的降解作用(降解率分別達(dá)58.72%、51.57%和70.70%)，還有抑菌功能的乳酸菌R-3株對(duì)黃曲霉毒素的降解率達(dá)54.5%，另外，酵母菌J-4株和J-6株對(duì)黃曲霉毒素的降解率也分別達(dá)到90.57%和73.21%。

3.2 霉菌毒素降解菌的抑菌作用

益生菌不但能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，而且其在生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中含有抗菌肽，具有廣譜抗菌活性，對(duì)多種有害菌均有抑制作用。細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有桿菌肽(Bacitracin)、短桿菌肽S(Gramicidin S)、多粘菌素E(Polymyxin E)和乳鏈菌肽(Nisin)4種類(lèi)型。田召芳等[12]從健康雞、兔、仔豬腸道內(nèi)容物及新鮮糞便中分離篩選出5株有明顯抑菌活性代謝產(chǎn)物的乳酸菌，其中4株屬于乳桿菌屬，1株屬于鏈球菌屬，并通過(guò)試驗(yàn)證明抑菌物質(zhì)中含有蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì)菌素。張輝華等[13]從雞糞便中分離到6株乳酸菌，采用牛津杯法與單層瓊脂擴(kuò)散法對(duì)乳酸菌的體外抑菌能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)雞大腸桿菌O78、雞白痢沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，其中，LHCK菌株對(duì)雞大腸桿菌O78的抑菌圈直徑達(dá)17.96mm，O2株對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌抑菌圈直徑達(dá)22.94mm，IF15菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為17.70mm。潘文杰等[14]從健康成年豬糞便中分離到一株產(chǎn)淀粉酶的芽胞桿菌(SY200)，采用濾紙片法和牛津杯法研究該菌對(duì)動(dòng)物病原菌的生物拮抗作用，結(jié)果顯示，該菌的全菌培養(yǎng)液和培養(yǎng)上清液對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的生物拮抗作用，其上清液對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為17.14、18.03和20.03mm。本研究中篩選的兩株酵母菌(J-4、J-6)對(duì)有害菌均沒(méi)有抑制能力，可能由于這兩株菌生長(zhǎng)過(guò)程中不能代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、抗菌肽、過(guò)氧化氫等對(duì)病原菌有抑制作用的物質(zhì)有關(guān)。本研究所篩選的2株乳酸菌和4株芽胞菌對(duì)致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的殺菌效果，其中R-3株乳酸菌對(duì)致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球的最大抑菌圈直徑分別為15、15、18mm；Y-1株芽胞菌對(duì)致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球的最大抑菌圈直徑分別為14、13、18mm。

3.3 霉菌毒素降解菌的產(chǎn)酶性能

益生菌代謝產(chǎn)物中含有蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶等酶類(lèi)，能夠促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體對(duì)影響物質(zhì)的吸收，提高生產(chǎn)性能。張韻等[15]從健康仔豬糞便中分離篩選到4株凝結(jié)芽孢桿菌，通過(guò)試驗(yàn)證明均具有一定的產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶的能力。郭政宏等[16]從藏綿羊糞便中分離到了一株既能產(chǎn)蛋白酶、又能產(chǎn)纖維素酶的短小芽胞桿菌。本研究成功篩選到能夠同時(shí)產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶的兩株芽孢菌(Y-1、Y-2)，其中Y-1菌產(chǎn)蛋白酶能力好于Y-2，酶解圈直徑為13mm；Y-2菌產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶的能力好于Y-1，淀粉酶和纖維素酶的酶解圈直徑分別為14mm和11mm；試驗(yàn)篩選的兩株酵母菌、兩株乳酸菌均沒(méi)有產(chǎn)生三種消化酶的能力。

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（2020–05–06）

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