程咪咪，汪秋月，呂艷秋，金 一

（延邊大學農學院，吉林延吉 133000）

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-Proteasome System，UPS）介導的蛋白降解是通過小分子伴侶蛋白泛素（Ubiquitin，Ub）共價連接，對靶蛋白進行穩(wěn)定、可逆的翻譯后修飾，負責執(zhí)行這個調控過程的關鍵組分包括泛素激活酶（E1）、泛素結合酶（E2）、泛素連接酶（E3）以及去泛素化酶（DUB）和26S 蛋白酶體[1-3]。E2 具有高度保守的泛素結合結構域（UBC），UBC 上有象征活性的半胱氨酸位點，可以接受被 E1 激活的Ub，并與Ub 之間形成硫酯鍵。隨后，Ub-E2 與已識別待降解靶蛋白的E3 相結合，E3 介導Ub 從E2 轉移到靶蛋白上，E2 和E3 繼續(xù)重復上述過程，直到靶蛋白上的多個Ub連接成一條多聚鏈，最后該靶蛋白被26S 蛋白酶體識別和降解。Uev1A 屬于E2 家族的一員，因為不存在活性E2 所必需的半胱氨酸位點，所以只能與Ubc13 結合形成Ubc13-Uev1A 復合物發(fā)揮作用。NSC697923 是一種細胞選擇透過性Ubc13-Uev1A 復合物抑制劑，能抑制Ub-E2 硫酯鍵的形成，從而阻止Ub 向底物的轉移[4]。

獲能是精子成熟的重要步驟之一，最具代表性的變化是超激活運動。在獲能期間，即精子與卵母細胞質膜融合之前，精子獲得識別、結合并穿透透明帶的能力[5-6]。目前對人類和哺乳動物精子的研究揭示了UPS 可能參與精子超激活運動和獲能并由此調節(jié)精子與卵母細胞相互作用[7-11]，但UPS 調節(jié)精子獲能的具體機制尚不清楚。因此本研究通過在豬精子獲能液中添加E2 抑制劑NSC697923，探究精子蛋白泛素化水平對精子獲能狀態(tài)和精卵結合能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取延吉市某豬場年齡相似，健康無疾病的3 頭種豬。

1.2 主要試劑 實驗所用試劑無特殊說明均購自美國Sigma 公司，實驗所用水均制自超純水器（Milli-Q Academic A10），NSC697923 購自Selleckchem 公司，精子獲能液（每1L 配6.61 g NaCl、0.223 g KCl、1.102 g CaCl2、1.98g葡萄糖、1.942 9 g咖啡因、0.55 g丙酮酸鈉，2.42 g Tris、1g BSA、0.065 g 青霉素、0.05 g 鏈霉素），IVM 液（每1L 配15 g TCM-199l、0.549 6 g 葡萄糖、0.1 g丙酮酸、2.106 g NaHCO3、1 g 聚乙烯醇、0.075 g 青霉素、0.05 g 鏈霉素），TCM-washing 液（每1L IVM 液配6 g Hepes）和PBS-PVA 液（每1 L 配10g PBS 和1g PVA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 精液獲取 從種豬場取回的新鮮精液在室溫下平衡30 min，用PBS 調節(jié)精子密度為1×108個/mL。取出一部分進行常規(guī)檢測（精子質量分析儀，購自圣普醫(yī)療設備有限公司），其中活力≥85%，精子畸形率≤20%，顏色呈淺灰或者乳白色，氣味略帶有腥味的樣品方可進行后續(xù)實驗。

1.3.2 精子獲能 采用精子上浮法進行精子獲能。取6個1.5 mL 無菌離心管，編號1～6，分別為空白對照組（未添加任何試劑）、陰性對照組（添加DMSO）和4 個NSC697923 處理組（5、10、15、20 μmol/L NSC697923），依次往6 個無菌離心管中加入經(jīng)PBS 清洗后的精液1 mL，600 r/min 離心2～3 min，棄去上清液，向各組沉淀中依次加入1 mL 精子獲能液，混勻，調整精子密度為1×108個/mL，除空白對照組外依次添加DMSO、不同濃度的E2 抑制劑NSC697923（5、10、15、20 μmol/L），將所有的離心管傾斜45°放入恒溫培養(yǎng)箱（TC2323）中，38.5℃，5%的CO2濃度下孵育45～60 min。

1.3.3 誘導精子頂體反應（Acrosomal Reaction，AR）及考馬斯亮藍染色 分別將最終濃度為2 μmol/L 的鈣離子載體（誘導組）和DMSO（未誘導組）加入到已獲能的精子中，并在38.5℃、5% CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育30 min，后用考馬斯亮藍R250 避光染色30 min，流水沖洗甩干后，于光學顯微鏡下觀察精子發(fā)生AR 的比例。

1.3.4 卵丘-卵母細胞復合體（Cumulus-Oocyte-Complex es，COCs）的獲取及卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)（In Vitro Maturation，IVM）挑選直徑3～6 mm 卵泡用注射器（20 mL）吸取其內的卵泡液。將抽取到的卵泡液緩緩打入無菌的15 mL 離心管內，放入37℃水浴鍋中。在收集所有卵泡液后，將離心管置于38.5℃培養(yǎng)箱中靜置30 min，然后用巴士吸管吸出并棄上清，之后緩慢加入10 mL TCM-washing 液，輕輕混勻后放入38.5℃培養(yǎng)箱中靜置10 min，取出，棄去上清液，緩慢加入8 mL TCM-washing 液，倒入90 mm 培養(yǎng)皿中，在附帶38.5℃恒溫板的顯微鏡下挑選3 層以上、卵丘細胞致密、胞質均勻的COCs。用撿卵針將若干COCs 依次用在38.5℃培養(yǎng)箱中預平衡2 h 以上的TCM-washing 液、PBSPVA 液和IVM 液清洗3～5 次，然后將所選的優(yōu)質COCs放入IVM 成熟滴，25～30 個/小滴（IVM 液70 μL/小滴，覆蓋礦物油，平衡2 h 以上），于38.5℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 卵母細胞的成熟判定 培養(yǎng)44 h 后進行 IVM 判定，在0.1%透明質酸酶中用1 mL 移液器輕輕反復吸吹COCs，在體式顯微鏡下挑選排出第一極體的M Ⅱ期成熟卵母細胞。

1.3.6 精子蛋白的提取 將各組精子懸浮液3 000 r/min離心3 min，棄上清，按1:100（v/v）的比例加入蛋白酶抑制劑PMSF 和裂解液RIPA 并混勻，用振蕩器震蕩3 min后，置于搖床40 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，吸取上清，提取精子蛋白于-80℃冰箱中保存待用。

1.3.7 免疫印跡 用15%梯度凝膠SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分離各組的蛋白，PVDF 膜經(jīng)TBST 最后清洗3 次后，添加一抗（兔抗Ub 抗體、小鼠抗GAPDH 抗體）在4℃下孵育14～18 h。再用TBST清洗3 次后，添加二抗（山羊抗兔IgG 過氧化物酶抗體、山羊抗小鼠IgG 過氧化物酶抗體）在室溫下?lián)u床上孵育2 h。用ECL 法處理PVDF 膜顯現(xiàn)蛋白條帶，固定拍照保存。通過ImageJ 軟件對PVDF 膜條帶進行灰度值分析。

1.3.8 精子黏附率檢測 分別吸取20 μL 各組精液，注入到M Ⅱ期卵母細胞10 個/受精滴的90 mm 培養(yǎng)皿（依次按分組標記）中，進行精子-卵母細胞結合試驗，然后置于38.5℃、5% CO2，最大飽和濕度培養(yǎng)箱中共孵育6 h，取出各組的卵母細胞用0.1% PVA-PBS 液洗滌3～5 次，然后用5%的戊二醛固定30 min，再用PVAPBS 液清洗3～5 次，最后用Hoechst 33342（碧云天生物技術研究公司）染色15 min，在熒光顯微鏡下對每個組的卵母細胞的附著精子數(shù)進行拍照并計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析 使用Image J 軟件對WB 條帶灰度值和Hoechst 33342 熒光染色結果進行分析，所得數(shù)據(jù)使用SPSS 24 軟件進行單因素方差分析，結果均表示為平均值±標準差，差異顯著標準為P＜0.05。

2 結果

2.1 精子發(fā)生獲能和頂體反應判定 精子經(jīng)獲能和頂體反應處理后，經(jīng)考馬斯亮藍染色，已發(fā)生頂體反應的精子頂體未被染色，未發(fā)生頂體反應的精子頂體呈現(xiàn)藍紫色（圖1-A），鈣離子載體誘導組的頂體反應率顯著高于未誘導組（圖1-B）。然后分別對鮮精、獲能精子以及頂體反應精子進行免疫印跡分析，用p32 酪氨酸磷酸化一抗和酶標二抗孵育后，結果如圖2-A 所示，分子量約為32 ku 處出現(xiàn)蛋白條帶；分析蛋白條帶的灰度值結果如圖2-B 所示，獲能精子和頂體反應精子的p32 酪氨酸磷酸化水平顯著高于鮮精組。

2.2 獲能對精子蛋白泛素化水平的影響 檢測精子獲能狀態(tài)后，對鮮精、獲能精子、頂體反應精子蛋白重新進行免疫印跡分析，結果如圖3 所示，鮮精組在30 ku 處標記出Ub-蛋白條帶，而獲能和頂體反應組在30 ku 和46 ku 處均標記出Ub-蛋白條帶；獲能精子組和頂體反應組精子蛋白總泛素化水平顯著高于鮮精組，表明精子獲能或頂體反應時伴隨著精子蛋白泛素化水平上調。

2.3 不同濃度E2 抑制劑對精子蛋白泛素化水平的影響如圖4 所示，在30 ku 和46 ku 處均標記出Ub-蛋白條帶，空白對照組和陰性對照組間精子蛋白泛素化水平差異不顯著，NSC697923 處理組與對照組相比精子蛋白泛素化水平差異顯著。

2.4 不同濃度E2 抑制劑對精子獲能狀態(tài)的影響 如圖5所示，分子量約為32 ku 處僅有對照組出現(xiàn)蛋白條帶，NSC697923 處理組與對照組相比沒有精子蛋白磷酸化，表明獲能液中添加E2 抑制劑未能真正引起獲能。

2.5 不同濃度E2 抑制劑對精卵結合能力的影響 如圖6所示，隨著NSC697923 濃度的增加，藍色熒光點數(shù)逐漸增加。使用 Lane1 軟件進行分析，結果如圖7 所示，添加NSC697923 處理組的精子黏附率顯著低于對照組。

3 討 論

Tardif 等[12]研究發(fā)現(xiàn)在豬精子獲能期間，p32 的酪氨酸磷酸化含量增加。在此基礎上，Kwon 等[13]提出p32 的磷酸化在調節(jié)精子獲能方面起著關鍵作用，并可作為精子獲能的生物標志物，這一觀點目前已得到公認。本實驗發(fā)現(xiàn)精子獲能標志物的p32 酪氨酸磷酸化水平顯著高于新鮮精液，表明精子得到有效獲能。

由于UPS 在生物體的生理和病理過程中發(fā)揮了重要的作用，泛素化異常會導致疾病發(fā)生，特別是腫瘤的發(fā)生。因此，近年來研究人員已經(jīng)開始逐漸將腫瘤的治療靶點轉向了UPS[4]，尤其是針對 E3、26S 蛋白酶體和DUB 而研發(fā)了新型的抗腫瘤藥物。針對UPS進行的藥物開發(fā)中，E2 抑制劑主要有兩大類：一是從海綿動物中提取出的環(huán)狀肽 Leucettamol A、化合物Manadosterols A 和B，都被證實能通過阻斷 Ubc13 與UEV1A 的相互作用，從而抑制 Ubc13-UEV1A 復合體的形成，最終阻止K63 型多聚泛素鏈的形成，抑制底物降解。另有2 種Ubc13 抑制劑NSC697923 和BAY 11-7082，被證實可以通過在 Ubc13 活性位點半胱氨酸殘基上，經(jīng)過邁克爾加成反應形成共價加合物，分別抑制 DNA 損傷和 NF-κB 信號通路[14]。本研究中，NSC697923 處理組精子蛋白泛素化水平顯著低于對照組，且有劑量依賴性，說明NSC697923 確實抑制了UPS，與Huang 等[15]的研究結果一致。

UPS 參與哺乳動物精子獲能已得到證實[16]。Hillman 等[17]研究發(fā)現(xiàn)26S 蛋白酶體降解A 激酶錨定蛋白（AKAP 3），部分調節(jié)蛋白激酶A（PKA）的釋放，這是通向獲能所必需的步驟。此外，也有研究表明在精子獲能時，可能會發(fā)生頂體內和頂體表面相關蛋白的從頭泛素化和蛋白酶體降解相關靶蛋白，如精子黏附素（AQN1、AWN1）和頂體酶抑制劑（SPINK2）[11]、DQH 蛋白[16]、乳糖黏附蛋白（MFGE-8、P47）、去整合素和金屬蛋白酶5（ADAM5）和頂體結合蛋白（ACRBP）[10,18]等。本實驗中，在精子獲能和頂體反應后的蛋白泛素化水平明顯上調的情況下，向獲能液中添加E2 抑制劑NSC697923 抑制UPS 后，檢測精子蛋白p32 酪氨酸磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)僅有對照組在32 ku 處出現(xiàn)蛋白條帶，表明添加NSC697923 后UPS 途徑得到抑制的精子均未獲能。以上結果表明，獲能確實伴隨著精子蛋白泛素化水平上調，說明UPS 參與了精子的獲能過程，且必不可少，這與Zigo 等[16]的研究結果相符。

UPS 在哺乳動物精子發(fā)生和體外受精過程中都具有重要的作用[16,19]。在UPS 參與精子獲能的證據(jù)方面，目前研究最多的是26S 蛋白酶體。添加蛋白酶體抑制劑如MG-132 和環(huán)氧霉素可抑制頂體外膜重塑，改變獲能，防止發(fā)生頂體反應，顯著降低體外受精能力[19-20]。此外，還有E1 抑制劑PyR-41 在獲能過程中也改變頂體外膜重構，降低獲能能力，在體外受精中防止精子穿透透明帶，降低精子體外受精卵母細胞的能力[11]。目前已鑒定出更多的精子蛋白酶體/UPS 底物，并揭示了UPS 調節(jié)的性質[5]。但還沒有關于這些蛋白質在獲能過程中是如何被UPS 調控的確切證據(jù)。本研究中，NSC697923處理組的精卵結合能力顯著低于對照組，且隨著E2 抑制劑濃度下降，黏附率也隨之下降。說明抑制精子UPS會降低精子體外受精的精卵結合能力。

4 結 論

本研究結果表明，豬獲能精子的蛋白泛素化水平顯著上調，而在豬精子獲能液中添加E2 抑制劑NSC697923 則能顯著抑制精子獲能，且隨著抑制劑濃度的增加，精子黏附率顯著下降，說明UPS 是豬精子獲能必不可少的環(huán)節(jié)。本研究支持了UPS 在精子獲能中有重要作用這一前人的研究結果，進而提出了將精子蛋白泛素化水平作為檢測精子獲能指標的可能性，但精子蛋白質泛素化水平能否作為精子獲能的標志還有待于進一步研究。