宋居易 劉昱辰 張?zhí)K楠 江高偉 楊華衛(wèi)

摘要：利用反向點(diǎn)雜交技術(shù)，研制靈敏度較高的南美白對(duì)蝦4種病原體檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)指標(biāo)包括致對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（VpAHPND）、對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）、對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）、對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP），用重組質(zhì)粒分別對(duì)其進(jìn)行了最低檢測(cè)限測(cè)試，并與現(xiàn)有推薦方法進(jìn)行比較。本研究研發(fā)的檢測(cè)試劑盒對(duì)4種病原體的最低檢測(cè)限為1 μl 10～100 拷貝。特異性檢測(cè)結(jié)果表明，4種病原體彼此不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性良好，與各病原體推薦檢測(cè)方法的結(jié)果相比，陽(yáng)性符合率完全一致。本研究研發(fā)的檢測(cè)試劑盒具有操作方便，靈敏度高，特異性好，檢測(cè)時(shí)間短，設(shè)備要求簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適合應(yīng)用于南美白對(duì)蝦VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP的檢測(cè)、篩查工作中。

關(guān)鍵詞：南美白對(duì)蝦;病原體;生物芯片法;反向點(diǎn)雜交技術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：S945.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）03-0656-10

Development of a rapid visualization detection kit （biochip method） for four pathogens in Penaeus vannamei

SONG Ju-yi1，LIU Yu-chen2，ZHANG Su-nan2，JIANG Gao-wei2，YANG Hua-wei2

（1.Jiangsu Institute of Agriculture Sciences for Region along the Yangtze River， Rugao 226541， China;2.Jiangsu Huntarray Biological Technology Co.， Ltd.， Nantong 226400， China）

Abstract：The reverse hybridization technique was used to develop the rapid visualization detection kit （biochip method） for four pathogens in Penaeus vannamei. The detection indices included acute hepatopancreatic necrosis disease-causing Vibrio parahaemolyticus （VpAHPND）， white spot syndrome virus （WSSV）， infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV）， Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）. The recombinant plasmid was used to test the minimum detection limit， and the results based on kits were compared with those based on the common methods. The minimum detection limit of four pathogens based on this detection kit was 10-100 copies per microliter. In addition， the results of specificity tests showed that there was no cross-reaction among four pathogens. Compared with the results of the recommended detection methods， the positive coincidence rate was completely consistent. The detection kit introduced in this study has the characteristics of easy operation， high sensitivity， good specificity， short detection time and simple equipment. It is suitable for the screening and detection of VpAHPND， WSSV， IHHNV and EHP in Penaeus vannamei.

Key words：Penaeus vannamei;pathogen;biochip method;reverse hybridization technique

南美白對(duì)蝦是重要的經(jīng)濟(jì)蝦品種，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，病害對(duì)于漁業(yè)產(chǎn)值的影響僅次于臺(tái)風(fēng)、洪澇等自然災(zāi)害[4]。致對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（VpAHPND）、對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）、對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）、對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）是導(dǎo)致許多地區(qū)南美白對(duì)蝦大批量死亡的主要原因之一[5-6]，對(duì)蝦一旦被這些病原體侵入，便無(wú)法治愈，造成大量損失。所以從源頭防止攜帶這些病原體的蝦苗進(jìn)入養(yǎng)殖環(huán)境極其重要，這就需要采用準(zhǔn)確、高效、靈敏的檢測(cè)手段進(jìn)行檢測(cè)，及時(shí)處理攜帶病原體的蝦苗。苗種檢測(cè)往往要求快速、高效、全面、準(zhǔn)確，但是目前使用的核酸檢測(cè)手段無(wú)法滿(mǎn)足這些要求，各種分子檢測(cè)手段還有很大的局限性。各病原體檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)多采用PCR或者巢式PCR法，但是PCR法的最低檢測(cè)限較低[7]，巢式PCR法的步驟較為繁瑣，檢測(cè)指標(biāo)單一，并且容易產(chǎn)生核酸污染[8-10]。熒光定量PCR法使用染料法對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法對(duì)提取過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制，并且在指標(biāo)較多時(shí)采用熔解曲線(xiàn)法容易造成誤讀。探針?lè)ǖ臋z測(cè)指標(biāo)少，對(duì)于大多數(shù)四通道的熒光定量PCR儀而言，無(wú)法實(shí)現(xiàn)單管檢測(cè)4個(gè)以上病原體指標(biāo)[11-12]，并且成本較高，不利于大規(guī)模推廣。本研究擬在前人研究基礎(chǔ)上，針對(duì)VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP的基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物、探針，構(gòu)建生物芯片檢測(cè)體系，以期研發(fā)出一種能夠高效、快速檢測(cè)這4種對(duì)蝦病原體的理想試劑盒產(chǎn)品。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑及儀器動(dòng)物組織基因組提取試劑盒、核酸雜交液、前處理液、后處理液、雜交洗滌液1、雜交洗滌液2、顯色液、酸雜交晶格均購(gòu)自江蘇獵陣生物科技有限公司，PCR擴(kuò)增試劑（10×Buffer、Taq DNA 聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、脫氧尿嘧啶、脫氧核糖核苷三磷酸）、硝酸纖維素膜購(gòu)自賽多利斯集團(tuán)，微孔板恒溫振蕩器購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司。

1.1.2供試樣本含有WSSV、EHP病原體的對(duì)蝦組織樣本及VpAHPND樣本來(lái)源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，含有IHHNV病原體的對(duì)蝦組織樣本以及無(wú)病原體的健康對(duì)蝦組織樣本從江蘇省南通市當(dāng)?shù)夭蓸荧@得。其中，含有IHHNV病原體的對(duì)蝦組織經(jīng)過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)為IHHNV陽(yáng)性，無(wú)病原體的健康對(duì)蝦組織樣本經(jīng)過(guò)4種病原體的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法或世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）和亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)（NACA）推薦方法檢測(cè)為陰性。

1.1.3供試質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性供試質(zhì)粒由江蘇獵陣生物科技有限公司前期獲得，分別取VpAHPND、WSSV、EHP、IHHNV的特異性基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，再將片段插入到pUCm-T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行陽(yáng)性菌落篩選后提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒質(zhì)量濃度測(cè)定并將其稀釋至1 ng/μl，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，-20 ℃保存，使用PCR驗(yàn)證并測(cè)序[由生工生物工程（上海）股份有限公司完成]的方法檢測(cè)是否正確插入了目的片段。采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度和純度，根據(jù)摩爾定律計(jì)算單位體積質(zhì)粒所含的DNA拷貝數(shù)。質(zhì)?？截悢?shù)=[質(zhì)粒質(zhì)量濃度×質(zhì)粒體積×6.02×1 023.00]/[（載體長(zhǎng)度+片段長(zhǎng)度）×660.00]

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1供試引物、探針的設(shè)計(jì)根據(jù)4種對(duì)蝦病原體（VpAHPND、WSSV、EHP、IHHNV）及對(duì)蝦18S rDNA特異性基因序列，設(shè)計(jì)該基因的擴(kuò)增引物序列和檢測(cè)探針序列，利用在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)Blast進(jìn)行比對(duì)，確保引物、探針的特異性，并將設(shè)計(jì)好的序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體信息見(jiàn)表1、表2。

1.2.2多重PCR擴(kuò)增體系的建立 利用單因素控制法將合成的引物依據(jù)不同的上下游配比進(jìn)行混合，對(duì)Mg2+濃度、脫氧核糖核苷三磷酸用量、上下游引物濃度配比以及一輪、二輪PCR的2種退火溫度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行探索，利用瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶的擴(kuò)增情況，得到最優(yōu)的擴(kuò)增條件。

1.2.3芯片制備工藝的建立利用江蘇獵陣生物科技有限公司獨(dú)有的反向點(diǎn)雜交技術(shù)研發(fā)平臺(tái)建立芯片制備工藝技術(shù)。使用15×檸檬酸鈉緩沖液（SSC）浸泡硝酸纖維素膜，60 ℃烘干，用稀釋液稀釋探針后滴加到芯片上，在0.4 mol/L NaOH溶液中變性，15×SSC浸泡10 min，80 ℃烘干，其探針排布如圖1顯示。

1.2.4芯片檢測(cè)體系的建立以對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)特異性基因質(zhì)粒3 fg/μl為PCR擴(kuò)增模板，利用已經(jīng)成熟的擴(kuò)增體系和芯片制備生產(chǎn)工藝研究合適的雜交條件（雜交時(shí)間、雜交溫度、洗滌時(shí)間、洗滌次數(shù)、顯色溫度、顯色時(shí)間等），最終獲得合適的芯片檢測(cè)體系。

1.2.5對(duì)蝦組織樣本提取根據(jù)江蘇獵陣生物科技有限公司提供的海洋動(dòng)物組織基因組提取試劑盒（磁珠法）的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取20 mg對(duì)蝦組織加至混有50 μl磁珠、200 μl裂解液1、200 μl裂解液2、50 μl蛋白酶K的試管中，60 ℃ 1 500 r/min恒溫振蕩20 min，取出后放入磁力架中，靜置數(shù)秒后用移液器吸出液體并棄置，加入70 μl洗脫液，置于72 ℃恒溫振蕩器中5 min，取出放入磁力架中，取上清液即可。

1.2.6最低檢測(cè)限試驗(yàn)用三羥甲基氨基甲烷（Tris）-乙二胺四乙酸（EDTA）緩沖液（TE）對(duì)含有4種病原體靶標(biāo)基因堿基序列的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)♂屩?0.000 pg/μl（約1 μl 3.3×106拷貝）、0.300 fg/μl（約1 μl 100.0拷貝）、0.030 fg/μl（約1 μl 10.0拷貝）、0.003 fg/μl（約1 μl 1.0拷貝），然后進(jìn)行生物芯片檢測(cè)，共進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。根據(jù)探針排布情況觀察是否出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的信號(hào)點(diǎn)，確定其最低檢測(cè)限及特異性。確定各指標(biāo)最低檢測(cè)限后，采用提取的陰性蝦基因組，將含有4種病原體（VpAHPND、WSSV、EHP、IHHNV）靶標(biāo)基因堿基序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍梯度稀釋至其最低檢測(cè)限質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，以模擬正常染病的蝦基因組檢測(cè)情況，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7特異性試驗(yàn)用TE對(duì)含有本研究4種病原體靶標(biāo)基因堿基序列的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)♂屩?0.000 pg/μl，與陰性蝦基因組共同進(jìn)行生物芯片檢測(cè)，共進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.2.8生物芯片法與推薦方法的對(duì)比驗(yàn)證以含有VpAHPND、WSSV、EHP、IHHNV的對(duì)蝦組織樣本為試驗(yàn)材料，比較其推薦方法[9，13-15]與本研究所述生物芯片法的檢測(cè)結(jié)果。分別利用現(xiàn)有的推薦方法（所使用的引物見(jiàn)表3）和本研究所述生物芯片法檢測(cè)供試樣本，比較陽(yáng)性符合率，并將巢式PCR或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，從而對(duì)試劑盒性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1多重PCR擴(kuò)增體系的建立

通過(guò)一系列優(yōu)化（包括Mg2+濃度的梯度優(yōu)化和正反向引物的比例優(yōu)化等）確定18 μl五重PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的組分，每個(gè)組分加入3 μl含4種病原體靶標(biāo)基因堿基序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒質(zhì)量濃度為10 pg/μl，并且根據(jù)退火溫度的梯度試驗(yàn)結(jié)果確定合適的擴(kuò)增條件。通過(guò)雙鏈擴(kuò)增退火溫度梯度試驗(yàn)結(jié)果，確定一輪PCR退火溫度為55 ℃。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min;95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s;68 ℃ 30 s，72 ℃ 5 s，3個(gè)循環(huán)。圖2顯示，當(dāng)一輪PCR退火溫度為55 ℃時(shí)，分別擴(kuò)增含有本研究4種病原體靶標(biāo)基因堿基序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，均可見(jiàn)明顯的擴(kuò)增條帶。

2.2生物芯片檢測(cè)體系的建立

對(duì)雜交時(shí)間、雜交溫度、顯色時(shí)間、顯色溫度等進(jìn)行研究，確立合適的雜交檢測(cè)條件：雜交時(shí)間9 min，雜交溫度45 ℃，顯色時(shí)間3 min，顯色溫度45 ℃。圖3顯示，生物芯片檢測(cè)條件為：雜交時(shí)間分別為3 min、6 min、9 min、12 min;雜交條件為45 ℃，1 500 r/min;洗滌條件為：45 ℃，2 min，采用洗滌液洗滌2次;顯色條件為：45 ℃，1 500 r/min，3 min。模板為3 fg/μl EHP質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。雜交時(shí)間為9 min和12 min時(shí)，信號(hào)點(diǎn)較為明顯且信號(hào)相差不大，所以選擇9 min作為最終的雜交時(shí)間。

2.3最低檢測(cè)限分析

最低檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，生物芯片法對(duì)VpAHPND的最低檢測(cè)限為1 μl 1拷貝，對(duì)IHHNV、WSSV的最低檢測(cè)限為1 μl 10拷貝，對(duì)EHP的最低檢測(cè)限為1 μl 100拷貝。

圖5顯示，將最低檢測(cè)限濃度的質(zhì)粒與陰性蝦基因組混合，VpAHPND、WSSV、IHHNV的最低檢測(cè)限可達(dá)到1 μl 10拷貝，EHP的最低檢測(cè)限為1 μl 100拷貝，VpAHPND、IHHNV、WSSV、EHP在最低檢測(cè)限下的信號(hào)均明顯增強(qiáng)。

A：對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（VpAHPND）;B：對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）;C：對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）;D：對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）。M：Marker DL2000;1～8：退火溫度分別為51 ℃、52 ℃、53 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃。

1st：第一次試驗(yàn)結(jié)果;2nd：第二次試驗(yàn)結(jié)果;3rd：第三次試驗(yàn)結(jié)果。

2.4特異性分析

對(duì)本研究4個(gè)病原體較高濃度的質(zhì)粒和陰性蝦基因組用生物芯片法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖6）顯示，較高濃度的質(zhì)粒及陰性蝦基因組均未產(chǎn)生非特異性信號(hào)，證明特異性良好。

2.5生物芯片法與推薦方法結(jié)果的對(duì)比驗(yàn)證

VpAHPND檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，利用AP4巢式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，陰性對(duì)照組無(wú)明顯條帶，陽(yáng)性對(duì)照組有明顯條帶，表明檢測(cè)結(jié)果是有效的。1號(hào)、4號(hào)、6號(hào)樣本在巢式PCR一輪擴(kuò)增即出現(xiàn)目的條帶，為強(qiáng)陽(yáng)性或中陽(yáng)性樣本，2號(hào)樣本在二輪擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶，為弱陽(yáng)性樣本，對(duì)AP4巢式PCR二輪產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)陽(yáng)性樣本為1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)樣本。利用生物芯片法檢測(cè)時(shí)，雜交質(zhì)控信號(hào)點(diǎn)出現(xiàn)說(shuō)明生物芯片檢測(cè)成功，結(jié)果顯示，1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)樣本出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明2種方法的檢測(cè)結(jié)果一致。

A：1 μl 1 000拷貝質(zhì)粒模板;B：1 μl 100拷貝質(zhì)粒模板;C：1 μl 10拷貝質(zhì)粒模板;D：1 μl 1拷貝質(zhì)粒模板。VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP見(jiàn)圖2注。1st：第一次試驗(yàn)結(jié)果;2nd：第二次試驗(yàn)結(jié)果;3rd：第三次試驗(yàn)結(jié)果。

VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP見(jiàn)圖2注。1st：第一次試驗(yàn)結(jié)果;2nd：第二次試驗(yàn)結(jié)果;3rd：第三次試驗(yàn)結(jié)果。

EHP檢測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，利用EHP巢式PCR法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，陰性對(duì)照組無(wú)條帶，陽(yáng)性對(duì)照組有明顯條帶。使用十足目引物擴(kuò)增提取的蝦基因組出現(xiàn)明顯條帶，說(shuō)明基因組提取成功，檢測(cè)結(jié)果有效。5號(hào)樣本在PCR一輪擴(kuò)增即出現(xiàn)目的條帶，為強(qiáng)陽(yáng)性或中陽(yáng)性樣本，1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)樣本在PCR二輪擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶，為弱陽(yáng)性樣本，對(duì)PCR二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)EHP陽(yáng)性樣本為1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)樣本。利用生物芯片法檢測(cè)時(shí)，雜交質(zhì)控、全程質(zhì)控均出現(xiàn)信號(hào)點(diǎn)說(shuō)明檢測(cè)成功，結(jié)果顯示，1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)樣本出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明2種方法檢測(cè)結(jié)果一致。

VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP見(jiàn)圖2注。N：陰性蝦基因組。1st：第一次試驗(yàn)結(jié)果;2nd：第二次試驗(yàn)結(jié)果;3rd：第三次試驗(yàn)結(jié)果。

A：AP4巢式PCR法;B：生物芯片法。M：DL2000 marker;1-1至1-6：1至6號(hào)樣本第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;P1：陽(yáng)性對(duì)照組第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;N1：陰性對(duì)照組第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2-1至2-6：1至6號(hào)樣本第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;P2：陽(yáng)性對(duì)照組第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;N2：陰性對(duì)照組第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

A：EHP巢式PCR法;B：生物芯片法。M：DL2000 marker;1-1至1-6：1至6號(hào)樣本第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;P1：陽(yáng)性對(duì)照組第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;N1：陰性對(duì)照組第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2-1至2-6：1至6號(hào)樣本第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;P2：陽(yáng)性對(duì)照組第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;N2：陰性對(duì)照組第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;S1至S6：1至6號(hào)樣本十足目引物擴(kuò)增產(chǎn)物。

WSSV檢測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，利用文獻(xiàn)[13]的套式PCR檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，陰性對(duì)照組無(wú)條帶，陽(yáng)性對(duì)照組有明顯條帶。使用十足目引物擴(kuò)增提取的蝦基因組出現(xiàn)明顯條帶，說(shuō)明基因組提取成功，檢測(cè)結(jié)果有效。1號(hào)、3號(hào)樣本在PCR一輪擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶，為強(qiáng)陽(yáng)性或中陽(yáng)性樣本，對(duì)PCR二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)WSSV陽(yáng)性樣本為1號(hào)、3號(hào)樣本。利用生物芯片法檢測(cè)時(shí)，雜交質(zhì)控、全程質(zhì)控均出現(xiàn)信號(hào)點(diǎn)表明檢測(cè)成功，結(jié)果顯示，1號(hào)、3號(hào)樣本出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明2種方法檢測(cè)結(jié)果一致。

IHHNV檢測(cè)結(jié)果（圖10）顯示，利用文獻(xiàn)[14]的普通PCR方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，陰性對(duì)照組無(wú)條帶。由于所取的樣本為先前標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)的陽(yáng)性樣本，故復(fù)檢的樣本1～8均有目的條帶，為強(qiáng)陽(yáng)性或中陽(yáng)性樣本，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)IHHNV陽(yáng)性樣本為1～8號(hào)樣本。利用生物芯片法檢測(cè)時(shí)，雜交質(zhì)控、全程質(zhì)控均出現(xiàn)信號(hào)點(diǎn)表明檢測(cè)成功，1～8號(hào)樣本出現(xiàn)非常明顯的陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明2種方法檢測(cè)結(jié)果一致。

綜上所述，本研究生物芯片法分別與4種病原體的推薦檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果一致，陽(yáng)性符合率均為100%。

A：巢式PCR法;B：生物芯片法。M：DL2000 marker;1-1至1-4：1至4號(hào)樣本第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;P1：陽(yáng)性對(duì)照組第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;N1：陰性對(duì)照組第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2-1至2-4：1至4號(hào)樣本第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;P2：陽(yáng)性對(duì)照組第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;N2：陰性對(duì)照組第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;S1至S4：1至4號(hào)樣本十足目引物擴(kuò)增產(chǎn)物。

A：普通PCR法;B：生物芯片法。M：DL2000 marker;1～8：1～8號(hào)樣本;N：陰性對(duì)照。

3討論

生物芯片檢測(cè)方法在各領(lǐng)域均發(fā)揮一定作用，特別是在人體的體外診斷中應(yīng)用較為廣泛，如新生兒耳聾遺傳基因診斷、人乳頭瘤病毒基因分型診斷、結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping（48型）分型診斷等[16-18]，其優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)指標(biāo)多，區(qū)分度高（可以區(qū)分單堿基突變）[19]，但由于其靈敏度相對(duì)較低，手動(dòng)操作較繁瑣，自動(dòng)化儀器設(shè)備成本高，極大制約了該方法在其他領(lǐng)域的發(fā)展[20]。

本研究將多重PCR單鏈擴(kuò)增技術(shù)和獨(dú)特的生物芯片制備技術(shù)相結(jié)合，具有成本低，檢測(cè)指標(biāo)多，速度快，靈敏度高等特點(diǎn)，不同于傳統(tǒng)生物芯片通過(guò)熱變性產(chǎn)生單鏈的方法，而是利用引物量和退火溫度的雙重不對(duì)稱(chēng)性，產(chǎn)生大量單鏈[21-22]，提高檢測(cè)效率的同時(shí)，簡(jiǎn)化了操作步驟。由于引物標(biāo)有生物素，所以單鏈中同樣存在生物素標(biāo)記，在雜交過(guò)程中，目標(biāo)單鏈可以與探針結(jié)合，而一端的生物素與標(biāo)記有磷酸脂酶的鏈酶親和素結(jié)合，在底物顯色液的作用下顯色，從而達(dá)到可視化檢測(cè)的目的。

利用不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增產(chǎn)生單鏈，相較于常用的熱變性方法，效率更好，操作更加方便[23-24]。在研發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在兩輪退火溫度不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增體系下，單鏈擴(kuò)增情況與雙鏈擴(kuò)增情況呈一定程度的正相關(guān)，故可以通過(guò)雙鏈擴(kuò)增條帶的檢測(cè)結(jié)果來(lái)判斷單鏈擴(kuò)增情況。這可能是因?yàn)樵诙哖CR中，單鏈的產(chǎn)生同樣來(lái)源于雙鏈。正是由于良好的單鏈產(chǎn)生效率才使得雜交系統(tǒng)僅需要很短的雜交、洗滌、顯色時(shí)間即可完成多個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)，省去了熱變性的步驟，結(jié)合配套的基因組提取試劑盒，僅需要3.5 h即可完成對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌、對(duì)蝦白斑綜合征病毒、對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)4個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)，在目前同類(lèi)的反向點(diǎn)雜交檢測(cè)技術(shù)中，處于領(lǐng)先水平[25-26]。前期大量的試驗(yàn)摸索，使該生物芯片法實(shí)現(xiàn)較高的檢測(cè)靈敏度，在目前已發(fā)表的核酸分子檢測(cè)技術(shù)相關(guān)的文章中，其最低檢測(cè)限處于較高水平[27-28]，可以與目前流行的巢式PCR[29]、熒光定量PCR[30]、等溫聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）和數(shù)字PCR等相媲美[31-32]，并且具有其他方法所不具備的優(yōu)勢(shì)，包括試劑成本低，儀器要求簡(jiǎn)單等。不僅如此，該方法所有原材料、儀器、試劑均可以實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)自主化生產(chǎn)，可以有效抵御由于國(guó)際貿(mào)易大環(huán)境所導(dǎo)致的貿(mào)易風(fēng)險(xiǎn)。所以，具有較好的實(shí)用性和市場(chǎng)前景。

在試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性方面，生物芯片法同樣具有一定程度的優(yōu)勢(shì)。在試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的PCR方法，特別是多重PCR或者巢式PCR，即使是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法或者OIE/NACA推薦方法也可能會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，影響最終結(jié)果的判讀。生物芯片法是通過(guò)探針雜交來(lái)判斷靶標(biāo)基因堿基序列的，相較于傳統(tǒng)的PCR或巢式PCR法，出現(xiàn)非特異性信號(hào)點(diǎn)的可能性較低，即使產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，由于探針與非特異性單鏈的不互補(bǔ)也不會(huì)產(chǎn)生非特異性信號(hào)點(diǎn)，是較為穩(wěn)定的檢測(cè)系統(tǒng)。在產(chǎn)品設(shè)計(jì)時(shí)，為了使產(chǎn)品更加完善，在研發(fā)之初就加入了全程質(zhì)量控制體系，即在引物-探針體系中加入十足目特異性引物和探針，在對(duì)蝦組織提取檢測(cè)過(guò)程中，根據(jù)該質(zhì)控信號(hào)點(diǎn)來(lái)進(jìn)一步判斷是否存在假陰性結(jié)果。同時(shí)，為了防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，加入了dUTP-UNG防污染系統(tǒng)，一定程度上減少了擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生污染的可能性。

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（責(zé)任編輯：王妮）