孫瑞萍 王峰 晁哲 劉海隆 鄭心力 劉圈煒 黃麗麗 邢漫萍 魏立民

摘要：為研究microRNA（miRNA）在五指山豬和長白豬肌肉生長發(fā)育中的差異和探究差異miRNA對(duì)骨骼肌發(fā)育轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的影響，以1月齡的五指山豬和長白豬背最長肌為材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析篩選與骨骼肌發(fā)育相關(guān)的差異miRNA。結(jié)果顯示，從2個(gè)文庫中共鑒定獲得318種己知的豬miRNA，五指山豬和長白豬分別鑒定出312個(gè)和306個(gè)已知miRNA，同時(shí)分別發(fā)現(xiàn)了83個(gè)和88個(gè)新的miRNA。獲得17個(gè)差異顯著的miRNA，其中16個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，1個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。靶基因預(yù)測和生物學(xué)功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異miRNA，共預(yù)測到535個(gè)靶基因，靶向作用于mTOR信號(hào)通路和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控的ssc-miR-486，ssc-miR-204，ssc-miR-338和ssc-miR-885-3p 4個(gè) miRNA可能參與骨骼肌生長發(fā)育過程。

關(guān)鍵詞：五指山豬; 骨骼肌; miRNA;高通量測序

中圖分類號(hào)：S828.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）03-0620-06

Comparative analysis on miRNA transcriptomes of skeletal muscle between one-month-old Wuzhishan pig and Landrace

SUN Rui-ping1，2，WANG Feng1，CHAO Zhe1，2，LIU Hai-long1，2，ZHENG Xin-li1，LIU Quan-wei1，2，HUANG Li-li1，XING Man-ping1，WEI Li-min1，2

（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Hainan Academy of Agricultural Science， Haikou 571100， China;2.Hainan Key Lab of Tropical Animal Reproduction & Breeding and Epidemic Disease Research， Haikou 571100， China）

Abstract：To investigate the differences of microRNA （miRNA） in growth and development of skeletal muscle between Wuzhishan pig and Landrace and to explore the effects of differential miRNAs on post-transcriptional regulation of skeletal muscle development， the longissimus dorsi muscles of one-month-old Wuzhishan pig and Landrace were used as materials to screen their differential miRNAs related to skeletal muscle development by transcriptome sequencing and bioinformatics analysis. A total of 318 known porcine miRNAs were identified from two libraries， 312 and 306 known miRNAs were identified in Wuzhishan and Landrace pigs respectively， and 83 and 88 new miRNAs were found at the same time. Seventeen differential miRNAs were obtained， of which 16 miRNAs were up-regulated and one miRNA was down-regulated. A total of 535 target genes were predicted by 17 differential miRNAs， targeting ssc-miR-486， ssc-miR-204， ssc-miR-338 and ssc-miR-885-3p， which were regulated by the mTOR signaling pathway and actin cytoskeleton. The four miRNAs can participate in the growth and development of skeletal muscle.

Key words：Wuzhishan pig;skeletal muscle;microRNA;high-throughput sequencing

豬是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，其骨骼肌發(fā)育與肉類生產(chǎn)和肉質(zhì)形成密切相關(guān)，其肌肉生長發(fā)育的機(jī)理一直為豬遺傳改良研究的熱點(diǎn)。五指山豬具有體型矮小、生長速度慢、瘦肉率低但肉質(zhì)優(yōu)良等特征，而國外引進(jìn)的長白豬具有體型高大、生長速度快、肉質(zhì)差但瘦肉率高等特點(diǎn)，這2個(gè)品種之間存在極端顯著的性狀差異，是研究品種差異的理想模型。

小分子RNA（microRNA，miRNA）是生物體內(nèi)一類重要的特殊分子，通過靶向mRNA的3′端來調(diào)控靶基因的表達(dá)，它的發(fā)現(xiàn)為研究生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。研究證實(shí)，miRNA在參與豬肌肉發(fā)育和生長過程中發(fā)揮重要作用，主要包括肌肉細(xì)胞的增殖和分化、骨骼肌發(fā)育階段肌纖維增值及轉(zhuǎn)換，以及一些肌肉疾病的發(fā)生等。如Sodhi等[1]通過RNA-Seq技術(shù)分析了濟(jì)州島本地豬（JNP）和來自美國伯克希爾（Berkshire）的豬背最長肌組織的轉(zhuǎn)錄組，共發(fā)現(xiàn)了39個(gè)差異表達(dá)基因，它們富集到代謝、免疫反應(yīng)和蛋白質(zhì)結(jié)合等通路上。陳偉[2]利用 RNA-seq 技術(shù)分析 miRNA 在萊蕪豬與大白豬中的表達(dá)模式，總共篩選出 265 個(gè)已知 miRNA，還預(yù)測到 94 個(gè)新 miRNA，在萊蕪豬與大白豬骨骼肌中顯著差異表達(dá)的有 25 個(gè) miRNA，這些miRNA的靶基因主要被富集到代謝過程等信號(hào)通路中。因此研究miRNA在五指山豬和長白豬出生后骨骼肌生長發(fā)育和肉質(zhì)性狀差異等方面所起的調(diào)控作用及其分子機(jī)理具有重要的意義。本研究通過比較分析1月齡五指山豬和長白豬背部骨骼肌生長發(fā)育差異miRNA的表達(dá)情況，為進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iRNA在豬生長發(fā)育中的功能和解析品種間肌肉生長發(fā)育差異分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集與文庫構(gòu)建

6頭1月齡的去勢(shì)雄性五指山豬（1W）采自海南五指山豬國家級(jí)保種場，6頭1月齡去勢(shì)長白豬（1C）購買自海南羅牛山種豬育種有限公司。試驗(yàn)豬屠宰后，分別采集同一部位的背最長肌組織樣品于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每個(gè)樣品提取總RNA， 經(jīng)質(zhì)量檢測合格的每個(gè)品種的RNA樣品分別混池構(gòu)建成一個(gè)RNA文庫用于后期的測序和生物信息學(xué)分析。該工作委托深圳市恒創(chuàng)基因科技有限公司完成。

1.2miRNA測序結(jié)果的生物信息學(xué)分析

miRNA測序得到原始數(shù)據(jù)（Raw reads），經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾獲得Clean reads。運(yùn)用Bowtie2軟件將 Clean tag比對(duì)到豬參考基因組上，統(tǒng)計(jì) Clean tag 的比對(duì)率以及在基因組上的分布情況。為確定已知miRNA，將剩余高質(zhì)量讀段與miRbase 21.0（http：//www.mirbase.org）中已知的豬 miRNA 前體/miRNA 成熟序列進(jìn)行比對(duì)。對(duì)于比對(duì)上的基因組外顯子反義鏈、內(nèi)含子、基因間區(qū)且未注釋上任何RNA類型的 Clean tag，結(jié)合miRNA的生物學(xué)特征，運(yùn)用 mireap 軟件預(yù)測新miRNA。

1.3差異miRNA篩選及其靶基因功能分析

對(duì)于有 Clean tag 比對(duì)上的miRNA，綜合前體和成熟體兩方面比對(duì)情況得到2個(gè)試驗(yàn)組豬miRNA 的表達(dá)量，然后利用 TPM（Tag per million）進(jìn)行表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用DEGseq和DESeq2軟件找出不同樣本間差異表達(dá)的 miRNA，以差異倍數(shù)大于等于2和Q值小于等于0.01作為差異miRNA篩選條件。運(yùn)用RNAhybrid、miRanda、TargetScan 3種miRNA靶基因預(yù)測軟件，預(yù)測差異miRNA的靶基因。對(duì)多個(gè)預(yù)測軟件結(jié)果取交集，作為最終的結(jié)果。使用KEGG pathway在線軟件對(duì)靶基因的代謝通路或者信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行富集分析。

2結(jié)果

2.1五指山豬和長白豬miRNA測序數(shù)據(jù)

經(jīng)過對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw data）的過濾篩選和質(zhì)量評(píng)估，共構(gòu)建了五指山小型豬和長白豬的2個(gè)背最長肌miRNA文庫。從2個(gè)miRNA文庫中分別獲得21 178 739條和20 725 847條miRNA原始序列，去除低質(zhì)量Read后，分別獲得高質(zhì)量Clean reads 20 165 360條和19 565 284條，分別占總Read的95.22%和94.4%。能夠定位到豬基因組上的特異性Unique序列分別有420 645條和678 594條，分別達(dá)到59.47%和61.44%。由圖1可知，這些讀段序列長度大多數(shù)分布在20～23 nt，其中序列長度22 nt所占比例最大，與典型的miRNA長度分布相符。同時(shí)我們對(duì)已知miRNA 堿基偏向性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)五指山豬和長白豬背肌中18～26 nt miRNA首位堿基對(duì)U具有強(qiáng)烈的偏好性（圖2），與前人的研究結(jié)果相同[3]。

2.2已知的豬miRNA的鑒定和統(tǒng)計(jì)分析

首先，將測序所得的Clean reads與miRbase21.0中已知的豬miRNA前體序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，從2個(gè)文庫中共鑒定獲得318種己知的豬miRNA，從五指山豬和長白豬中分別鑒定出312個(gè)和306個(gè)已知miRNA，其中有300個(gè)miRNA共表達(dá)，這些miRNA分別能被定位到280個(gè)和277個(gè)已知的豬miRNA前體上。對(duì)于比對(duì)上的豬基因組但未注釋上任何RNA類型的Clean reads，結(jié)合miRNA的生物學(xué)特征，運(yùn)用Mireap 預(yù)測軟件對(duì)其進(jìn)行新miRNA預(yù)測分析，在五指山豬中發(fā)現(xiàn)了83個(gè)新miRNA，在長白豬中發(fā)現(xiàn)了88個(gè)新miRNA。對(duì)miRNA表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)， ssc-miR-206、ssc-miR-1、ssc-miR-let7家族、ssc-miR-26a、ssc-miR-10a等多個(gè)miRNA在1月齡五指山豬和長白豬背肌組織中均高表達(dá)（圖3）。而作為肌肉特異性ssc-miR-133a-3p在1月齡五指山豬和長白豬背肌組織樣品中表達(dá)量分別排在第14和20位。這些新發(fā)現(xiàn)的miRNA表達(dá)量都很低，RPKM>300的miRNA僅有2個(gè)，分別為ssc-novel-miR-4和novel-miR-45。

2.3五指山豬和長白豬的差異miRNA

選擇差異倍數(shù)大于等于2和Q值小于等于0.01作為差異miRNA的選擇標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)五指山豬和長白豬的差異miRNA進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有17個(gè)miRNA符合上述條件，其中在五指山豬中表現(xiàn)上調(diào)的有16個(gè)，僅有1個(gè)miRNA （ssc-miR-376a-3p）表現(xiàn)為下調(diào)。由于ssc-miR-205在1月齡長白豬種表達(dá)量很低，所以差異倍數(shù)最大。而表達(dá)量較高、差異倍數(shù)最大的為ssc-miR-486和ssc-miR-9家族（表1）。

2.4五指山豬和長白豬差異miRNA的功能分析

運(yùn)用miRNA靶基因預(yù)測軟件RNAhybrid、miRanda和TargetScan預(yù)測五指山豬和長白豬差異miRNA的靶基因，17個(gè)差異miRNA共預(yù)測到535個(gè)靶基因。為深入了解這些基因的生物學(xué)功能，對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，共富集到249條生物學(xué)通路，其中有18個(gè)顯著富集通路（P<0.05）。這些顯著富集通路中，有已報(bào)道的在介導(dǎo)肌肉生長中起重要作用的mTOR信號(hào)通路和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控（表2）。

3討論

豬肌肉的生長發(fā)育受到許多因素的影響且具有明顯的時(shí)空特性，時(shí)空特異性表達(dá)基因間相互調(diào)控的信息傳遞網(wǎng)絡(luò)是決定豬生長速度和肌肉品質(zhì)的分子基礎(chǔ)。作為一類廣泛存在于動(dòng)、植物體內(nèi)具有調(diào)控功能的非編碼RNA，miRNA不僅參與生物機(jī)體內(nèi)的多種生命活動(dòng)，包括細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等[4-6]，miRNA對(duì)肌肉的形成和生長也是必不可少的[7]。許多研究團(tuán)隊(duì)使用高通量測序的方法檢測并分析了不同豬種骨骼肌中miRNA在不同生長階段和不同肌肉組織中的表達(dá)情況，不僅在豬的肌肉組織中鑒定出一批新的miRNA，而且發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性[8-10]。其中miR-1、miR-133a、miR-206 是研究最多的肌特異性miRNA[11]。miR-206在豬胚胎的不同發(fā)育階段和成年豬中表達(dá)豐度非常高，但在肌肉衛(wèi)星細(xì)胞增殖期無表達(dá)[12]。miR-1在豬胚胎各個(gè)發(fā)育階段中度表達(dá)，但在成年豬中高表達(dá)，而miR-133在豬的整個(gè)胚胎發(fā)育階段以及新生仔豬發(fā)育階段幾乎檢測不到，但在豬成年期miR-133的表達(dá)量適中[13];miR-432在豬胚胎發(fā)育階段表達(dá)量最高，出生后隨著年齡增長逐漸下降。miR-378、miR-1和 miR-206在骨骼肌和心肌中均高豐度表達(dá)[13]。與許多學(xué)者的研究結(jié)果一致，本研究中1月齡背肌中表達(dá)量排名前第1和第2的miRNA分別為mi-206、miR-1，而miR-133a相對(duì)于這2個(gè)miRNA表達(dá)量較低，但在背肌中也屬于高表達(dá)的miRNA。五指山豬小型豬與長白豬由于遺傳背景和環(huán)境的差異形成了不同的體型外貌和肌肉特性。

越來越多的miRNA被確認(rèn)參與豬品種間肌肉發(fā)育和肉質(zhì)差異相關(guān)的重要信號(hào)調(diào)控通路。miR-1和miR-206可以通過靶向Pax7基因影響骨骼肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)肌肉的生長[13];miR-133不僅可以促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖，還可以抑制骨骼肌細(xì)胞的分化[14]。我們?cè)?月齡五指山豬和長白豬的背肌組織中共發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異顯著表達(dá)的miRNA，其中只有ssc-miR-376a-3p在五指山豬背肌中表達(dá)下調(diào)，其余16個(gè)miRNA表達(dá)均上調(diào)，ssc-miR-486 的表達(dá)量最高。有報(bào)道稱[15]，ssc-miR-486在豬肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，在1、60、90、180日齡巴馬小型豬中的表達(dá)量高于長白豬，可能通過靶向p85α、PTEN和FoxOl調(diào)控豬骨骼肌IGF1-PI3K/AKT-mTOR信號(hào)通路。陳偉[2]利用高通量測序技術(shù)分析了萊蕪豬與大白豬骨骼肌中差異表達(dá)miRNA與差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)ssc-miR-486在生長緩慢的萊蕪豬中表達(dá)量顯著上調(diào)，此外，ssc-miR-486可通過靶向AKT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子磷酸酶基因（PTEN）影響骨骼肌再生，過表達(dá)ssc-miR-486會(huì)導(dǎo)致包括PTEN在內(nèi)的許多靶基因錯(cuò)誤調(diào)控而使骨骼肌再生異常。在飼糧中持續(xù)添加共軛亞油酸（Conjugated linoleic acids，CLA）后腿肌中miR-452的表達(dá)量顯著上調(diào)4倍以上，CLA可能通過影響肌肉中miR-452的表達(dá)量調(diào)控重要肌肉代謝通路[3]。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)的差異miR-204和miR-34c也已被報(bào)道與骨骼肌的發(fā)育相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與骨骼肌的發(fā)育，可以使成肌細(xì)胞從增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)變進(jìn)入分化狀態(tài)，miR-204通過作用于Wnt/β-catenin信號(hào)通路而發(fā)揮對(duì)骨骼肌發(fā)育的調(diào)控，在C2C12細(xì)胞成肌分化過程中過表達(dá)miR-204能明顯抑制肌細(xì)胞的融合程度和肌管的形成速度[16]。miR-34c可通過YY1基因調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的增殖及分化[17]。本研究中17個(gè)差異表達(dá)miRNA的535個(gè)靶基因共富集到249條生物學(xué)通路，其中有18個(gè)富集通路差異顯著，其中包括在肌肉生長中起重要作用的mTOR信號(hào)通路和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控。mTOR信號(hào)通路在多種疾病中扮演著不可忽視的角色，具有促進(jìn)物質(zhì)代謝、參與細(xì)胞凋亡、自噬等功能，它能夠?qū)⒏惺艿降纳嫌涡盘?hào)分子傳遞給下游的S6K1和4E-BP1 2個(gè)效應(yīng)分子，促進(jìn)細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)而增加肌肉蛋白質(zhì)合成。Guertin等[18]的試驗(yàn)結(jié)果也已證明mTOR信號(hào)通路在動(dòng)物出生后肌肉發(fā)育、肌肉再生、肌細(xì)胞分化和肌纖維生長中起重要作用。若特異性敲除肌肉中的mTOR，動(dòng)物在出生后慢肌纖維生長受阻，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的肌肉疾病[19]。在本研究中靶向mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的差異miRNA除了與已報(bào)道的肌肉生長發(fā)育相關(guān)的ssc-miR-486和ssc-miR-204外，還有ssc-miR-338和ssc-miR-885-3p，這2個(gè)miRNA是否與肌肉生長發(fā)育相關(guān)，還需進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。

本研究通過RNA-Seq得到1月齡五指山豬和長白豬背最長肌肉組織中miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫，并比較了兩者之間的差異。通過靶基因預(yù)測和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，很多miRNA（ssc-miR-486、ssc-miR-204、ssc-miR-338和ssc-miR-885-3p）可能影響一些與動(dòng)物肌肉發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路，尤其是靶向mTOR信號(hào)通路和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控，它們可能部分揭示了1月齡五指山豬和長白豬骨骼肌功能的差異，同時(shí)也為進(jìn)一步研究miRNA調(diào)控豬肌肉發(fā)育相關(guān)的研究提供了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：張震林）