朱耀磊,侯紅漫,張公亮,郝洪順

(1.大連工業(yè)大學食品學院,遼寧 大連 116034;2.洛陽師范學院食品與藥品學院,河南 洛陽 471934;3.遼寧省水產(chǎn)品加工質量安全與控制重點實驗室,遼寧 大連 116034)

群體感應是細菌間交流的一種方式,通過分泌到胞外的信號分子進行[1]。革蘭氏陰性菌間的群體感應是由高絲氨酸內酯類(N-acylhomoserine lactones,AHLs)介導,其中LuxR/I系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌中較為典型的模式群體感應調控系統(tǒng)。luxI基因編碼AHLs合成酶,調控AHLs的合成,當環(huán)境中的菌群數(shù)量達到一定密度時,合成的AHLs會分泌到胞外,AHLs濃度達到一定的閾值后,會進入胞內,與LuxR蛋白結合,激活細菌的LuxR/I調控系統(tǒng),進而對下游相關基因控制的性狀進行調控[1-2]。研究表明,細菌的群體感應LuxR/I系統(tǒng)對胞外蛋白酶的分泌、生物被膜的形成、泳動性以及生物發(fā)光等性狀具有調控作用[2]。

蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧菌,屬于腸桿菌科的條件性致病菌,有鞭毛,能運動,適應生長的溫度范圍較廣(4～42 ℃),因此廣泛分布于自然環(huán)境中[3]。現(xiàn)階段對H. alvei的研究,主要圍繞其作為食品腐敗菌進行。據(jù)報道,H. alvei經(jīng)常分離自低溫冷藏的牛肉、雞肉、原料乳、真空包裝、低溫貯藏的肉制品以及生鮮海產(chǎn)品中[4-6],并在這些產(chǎn)品的腐敗變質中扮演著重要角色。研究表明該菌具有較強的群體感應活性,能夠分泌多種AHLs,對其致腐特性具有潛在的調控作用[7]。

生物被膜是細菌為抵抗外界環(huán)境的變化而形成,為其本身的一種自我保護機制。它是細菌分泌的胞外多糖,可以茹附到接觸物體的表面,進而茹連并包裹自身細胞,并促進細菌的傳播和污染[8]。研究表明,H. alvei具有形成強生物被膜的能力[7-8],能夠在與食品接觸的器械表面形成,進而在加工過程中進入到食品中,導致食品在貯存過程中發(fā)生腐敗變質。通過研究H. alvei群體感應系統(tǒng)對生物被膜形成的調控作用,以更好地控制H. alvei在食品加工過程中的污染和傳播,減少由其造成的食品腐敗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H. alvei H4野生型菌株分離自腐敗即食海參;luxRI基因缺失型H. alvei株?luxRI,由本實驗室構建,詳見Zhu Yaolei等[9]方法;紫色桿菌CV026菌株(Chromobacterium violaceum 026)由中國農業(yè)科學院周志剛教授惠贈,用于檢測AHLs;實驗菌株均用LB培養(yǎng)基在30 ℃條件下培養(yǎng)。其中培養(yǎng)?luxRI菌株時需添加20 μg/mL的氯霉素。

氯霉素 北京索萊寶科技有限公司;無水甲醇、冰醋酸(均為分析純) 天津市科密歐化學試劑有限公司;結晶紫 生工生物工程(上海)股份有限公司;RNA提取試劑盒(DP430) 天根生化科技有限公司;SYBR Green I Ex Taq酶(RR420)、反轉錄試劑盒(RR047) 寶日醫(yī)生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

UV 2102分光光度計 日本島津公司;M2酶標儀美國分子儀器有限公司;7500熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國應用生物系統(tǒng)公司;PCR儀 伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司;凝膠成像儀 美國UVP公司;場發(fā)射掃面電鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 生長曲線測定

取H. alvei H4和?luxRI菌株過夜培養(yǎng)的菌液1 mL,分別接種到滅菌的液體100 mL LB培養(yǎng)基中,于160 r/min、30 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng),每隔2 h測定其OD600nm。

1.3.2 AHLs的測定

采用報告平板法測定H. alvei H4和?luxRI菌株AHLs[10]。

AHLs的提取:取100 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的H. alvei H4和?luxRI菌株的菌液,4 ℃、8 000 r/min離心15 min,取上清液,用旋轉蒸發(fā)儀將其濃縮至10 mL,加入30 mL 1%甲酸溶液酸化的乙酸乙酯,充分振蕩混均勻后靜置3 h。取上層溶液蒸干,加入1 mL超純水充分溶解,取出后置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

AHLs檢測:取10 mL過夜培養(yǎng)的紫色桿菌CV026菌液,加入到冷卻至60 ℃左右的固體LB培養(yǎng)基中,混勻,傾注到平板中,待其凝固,用1 mL槍頭頂端在平板中央打孔,隨后加入60 μL AHLs提取液,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),根據(jù)孔周圍有無紫色變化,判斷AHLs是否存在。

1.3.3 生物被膜的測定

1.3.3.1 結晶紫染色方法測定生物膜形成

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的H. alvei H4和?luxRI菌株的菌液用LB溶液按1∶100比例稀釋,分別吸取200 μL稀釋后的菌液加入到96 孔板中,30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后,測定其OD600nm,之后棄去孔中菌液,每孔加入250 μL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗3 遍。隨后加入250 μL無水甲醇固定15 min,棄去孔中廢液,置于60 ℃烘箱中烘干。取出冷卻后,加入250 μL 0.1%結晶紫溶液染色15 min,然后棄去廢液,用去離子水清洗3 遍,洗去殘余的結晶紫溶液,60 ℃烘干,加入200 μL 33%冰醋酸溶液,在96 孔板振蕩器上振蕩15 min。最后讀取其590 nm波長處吸光度[8]。以OD590nm/OD600nm表示生物膜的形成。

1.3.3.2 生物被膜掃描電鏡觀察

將玻璃蓋片(1 cm×1 cm)用洗滌劑清洗干凈后,置于HCl溶液中過夜浸泡,去離子水清洗干凈,放入平板中滅菌,備用。將處理好的玻璃蓋片置于24 孔板中,加入1.3.3.1節(jié)稀釋好的菌液,培養(yǎng)48 h,從24 孔板中取出玻片,用滅菌的0.1 mol/L PBS充分清洗,洗掉浮游細菌,再用2.5%戊二醛-PBS過夜固定,之后用PBS沖洗數(shù)遍,隨后用1%鋨酸溶液固定1 h,依次用50%、70%、80%、90%乙醇溶液脫水10 min,無水乙醇脫水2 次,每次15 min,再經(jīng)乙酸異戊酯置換2 次,每次15 min,臨界點干燥儀干燥,取出后噴金,掃描電鏡進行觀察[11-12]。

1.3.4 泳動性的測定

將滅菌好的泳動性培養(yǎng)基傾注到平板中,每個平板20 mL。平板凝固后,用移液器吸取3 μL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的H. alveiH4和?luxRI菌株的菌液,點到泳動性平板中央,小心移至30 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)[13]。

1.3.5 生物膜相關基因表達的實時聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)測定

1.3.5.1 RNA的提取

取1 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的H. alveiH4和?luxRI菌株的菌液,離心并棄去上清液,用滅菌的0.1 mol/L PBS清洗菌體沉淀2 次,離心棄去上清液。根據(jù)天根RNA提取試劑盒說明書進行操作,提取RNA。

1.3.5.2 cDNA的合成

分別取500 ng上述提取的RNA,利用寶生物的反轉錄試劑盒將其合成cDNA,稀釋10 倍作為real-time PCR的模板。

1.3.5.3 real-time PCR條件及體系

采用real-time PCR測定群體感應LuxR/I系統(tǒng)對H. alvei生物膜和泳動性相關基因flgA、flgE、fliA、flhD、flhC表達量的變化。反應體系20 μL:1.6 μL cDNA,0.4 μL上下游引物,7.6 μL DEPC水,10 μL SYBR Green IEx Taq酶。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,59 ℃退火31 s,40 個循環(huán)。16S rRNA作為內參基因,采用2-??Ct的方法對結果進行分析[14]。real-time PCR引物信息見表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1Primers used for real-time PCR

2 結果與分析

2.1 H. alvei H4和?luxRI菌株的生長曲線

圖1 H. alvei H4和ΔluxRI菌株的生長曲線Fig. 1 Growth curves of H. alvei H4 and ΔluxRI

由圖1可知,H. alveiH4的群體感應相關基因luxRI敲除后,該菌的生長狀況在對數(shù)期略低于野生型菌株,在對數(shù)后期,2 株菌的生長密度達到一致,進入到穩(wěn)定期后,二者的生長狀況保持相同,無明顯差別。

2.2 H. alvei H4和?luxRI菌株AHLs產(chǎn)生對比

圖2 H. alvei H4和ΔluxRI菌株AHLs的產(chǎn)生Fig. 2 Production of AHLs by H. alvei H4 and ΔluxRI

如圖2所示,在添加有H. alveiH4 AHLs提取液的平板中央出現(xiàn)了一個圓形的紫色區(qū)域,表明生長在瓊脂中的紫色桿菌CV026受到AHLs的誘導作用產(chǎn)生了紫色素,進而說明H. alveiH4能夠產(chǎn)生AHLs。而在加有?luxRI菌株提取液的平板則與對照相同,其中央則沒有發(fā)現(xiàn)紫色區(qū)域,表明?luxRI菌株不能產(chǎn)生AHLs。

2.3 生物被膜的形成

圖3 H. alvei H4和ΔluxRI菌株生物膜的形成Fig. 3 Biofilm formation of H. alvei H4 and ΔluxRI

圖4 H. alvei H4和ΔluxRI菌株生物膜的微觀結構Fig. 4 Biofilm formation of H. alvei H4 and ΔluxRI revealed by SEM

如圖3所示,luxRI基因缺失后,?luxRI菌株形成生物膜的能力顯著低于H. alveiH4(P＜0.05)。圖4A1顯示,茹附在玻片表面的細菌數(shù)量較多,而圖4B1中茹附在玻片上?luxRI菌株數(shù)量明顯減少。并且對比圖4A2、B2可知,H. alveiH4能夠產(chǎn)生大量胞外多糖,茹附在玻片表面形成較厚的網(wǎng)狀結構的生物膜,而?luxRI菌株分泌的胞外多糖相比于H. alveiH4則明顯減少,形成的網(wǎng)狀結構并不明顯。

2.4 泳動性的變化

圖5 H. alvei H4（A）和ΔluxRI（B）菌株的泳動性Fig. 5 Swimming motilities of H. alvei H4 (A) and ΔluxRI (B)

圖6 H. alvei H4和ΔluxRI菌株在泳動性平板上的擴散直徑Fig. 6 Diffusion diameters of H. alvei H4 and ΔluxRI strains spread on swimming plates

圖5 顯示,H. alveiH4在泳動性平板表面培養(yǎng)48 h后,能夠向四周擴散,形成圓形的暈圈,表明該菌具有運動性。?luxRI菌株同樣可以在泳動性平板表面擴散,然而其擴散形成圓形暈圈明顯小于H. alveiH4。圖6表明,在培養(yǎng)相同時間的條件下,?luxRI菌株的擴散半徑明顯(P＜0.05)小于野生型H. alveiH4,即其泳動性受到顯著抑制。

2.5 生物膜和泳動性相關基因的表達

2.5.1 RNA的提取

圖7 H. alvei H4和ΔluxRI菌株RNA的提取結果Fig. 7 Electrophoregram of RNA isolated from H. alvei H4 and ΔluxRI

RNA提取結束后,經(jīng)電泳檢測(圖7),在泳道1和2均有兩條明亮的條帶,并且條帶清晰、完整,沒有發(fā)生降解現(xiàn)象,經(jīng)酶標儀檢測,OD260nm/OD280nm值在2.0左右,質量濃度均高于200 ng/μL。可用于接下來的cDNA合成。

2.5.2 基因表達的變化

圖8 H. alvei H4和ΔluxRI菌株生物膜和泳動性相關基因的表達Fig. 8 Relative expression levels of biofilm- and motility-related genes in H. alvei H4 and ΔluxRI

如圖8所示,H. alvei群體感應相關基因luxRI缺失后,其生物膜和泳動性相關基因flgA、flgE、fliA、flhD和flhC相對表達量均顯著下調。其中flgE基因的相對表達量下調了近65%,變化最大。其次是flhC基因,下調了近50%。fliA基因下調了約40%,flgA和flhD基因的相對表達量較f l gE、f l iA和f l hC基因變化較小,下調了近25%。

3 討 論

研究表明,AHLs是由AHLs合成酶合成的,編碼基因為luxI,當luxI缺失后,細菌本身無法產(chǎn)生AHLs,因此細菌間的交流會受到影響,進而導致受群體感應調控性狀的變化[15]。當H. alveiH4的luxRI基因敲除后,該菌無法產(chǎn)生AHLs(圖2),Liu Li等[16]報道中同樣得出相似的結論。生物被膜的形成主要包括5 個階段,分別為初始茹附、表面附著、形成初期、成熟期和脫落期,其中細菌的泳動性直接影響生物膜形成的第一個階段,與介質表面的接觸[8,17],H. alvei H4在luxRI基因敲除后,其泳動性顯著降低(圖5、6),從而影響了細菌與介質表面的接觸,進一步導致生物膜形成的減少。在Khajanchi等[18]研究中,同樣發(fā)現(xiàn)Aeromonas hydrophila菌的群體感應AhyRI系統(tǒng)的缺失,會顯著抑制該菌生物膜形成和泳動性;同時,Oh等[19]研究發(fā)現(xiàn)將Acinetobacter nosocomialis菌株群體感應相關anoR基因敲除后,亦會導致該菌株生物被膜形成的顯著性降低。上述學者的研究與本研究結論相同。

細菌的運動性主要依賴于其本身的鞭毛的移動和布朗運動[20],根據(jù)Lee[21]、Wang Yao[22]、陳雪鳳[23]等報道,fliA、flhD和flhC為鞭毛轉錄調控因子,這些基因的缺失均會導致細菌生物膜形成和泳動性受到抑制,flgA和flgE為細菌鞭毛合成蛋白的編碼基因,直接反映細菌鞭毛的合成狀況,影響生物膜形成和泳動性。本研究H. alvei H4群體感應LuxR/I系統(tǒng)的缺失,使得f l gA、f l gE、fliA、flhD和flhC基因的相對表達量被顯著抑制(圖8),表明上述基因的表達受該菌群體感應的調控,并進一步調控生物膜的形成和泳動性。Atkinson等[24]報道表明,Yersinia pseudotuberculosis菌株泳動性的變化是其群體感應YpsRI和YtbRI系統(tǒng)通過調控flhD/C和fliA基因實現(xiàn)的。在對Sinorhizobium meliloti菌株群體感應系統(tǒng)的研究中[25],發(fā)現(xiàn)當其群體感應相關基因sinI缺失后,泳動性基因flaA和flaB的表達受到抑制。在對Pseudomonas fluorescens KM120[26]和Agrobacterium tumefaciens[21]的研究中發(fā)現(xiàn),當其群體感應系統(tǒng)受到抑制而影響生物膜形成時,flgA和flgE基因的表達同樣受到抑制作用。同樣的,在關于Acidovorax citrulli[27]和Enterococcus faecalis[28]菌株群體感應調控作用的研究中,均表明生物膜、泳動性及相關基因的表達亦受到群體感應的調控作用,研究結果與本實驗一致。

在對由細菌導致的食品腐敗的研究中,群體感應己逐漸成為一個不可忽略的因素[29],根據(jù)研究結果,H. alvei H4群體感應LuxR/I系統(tǒng)對該菌生物被膜的形成和泳動性具有顯著的調控作用,因此可以通過作用于群體感應系統(tǒng),進而控制生物膜的形成以減少腐敗細菌在食品加工過程中的傳播和污染。近年來,越來越多的研究集中于群體感應抑制劑[30],能夠在不抑制細菌生長的條件下,通過影響細菌的群體感應系統(tǒng),進而抑制細菌生物膜、泳動性等腐敗相關特性,達到控制腐敗的作用。本研究為控制H. alvei在食品加工過程中生物膜的形成,減少由其造成的食品污染和腐敗提供了新的理論支持。