姜帥銘,馬臣臣,游政凱,張家超

(海南大學食品科學與工程學院,海南 海口 570228)

隨著近年對益生菌[1]研究的不斷深入,益生菌在醫(yī)學、食品行業(yè)以及畜牧業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[2-3],而益生菌的主要作用靶點便是腸道,在近十年里對腸道微生物的認知更是有了極大提高。腸道微生物數(shù)量龐大,基因數(shù)量大約是人類基因組數(shù)量的100 倍[4],這些微生物的結(jié)構(gòu)和組成同時影響著宿主的營養(yǎng)加工、免疫功能、胃腸道發(fā)育及其他多種生理活動[5-6],且可以通過飲食、手術(shù)或抗生素人為干預(yù)改變[7]。腸道微生物的失衡與各類疾病有著千絲萬縷的聯(lián)系,如腎臟疾病[8]、代謝疾病[9]、心血管疾病[10]及神經(jīng)疾病[11]等。目前,腸道成為了預(yù)測疾病甚至干預(yù)疾病的新“靶點”[12],而益生菌更是成為塑造微生物群落組成和功能、預(yù)治疾病的“新工具”。

雙歧桿菌和乳桿菌為最常見的益生菌菌屬[13],其中,屬于乳桿菌屬的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),具有免疫調(diào)節(jié)、降低血清膽固醇含量、抑制動脈粥樣硬化、維持腸道內(nèi)菌群平衡[14]、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收及緩解乳糖不耐癥等功能[15]。而益生菌是否真正發(fā)揮益生作用還要基于菌株水平進行考量,L. plantarum ZDY04菌株可以通過調(diào)節(jié)小鼠中Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Bacteroidaceae科和Mucispirillum屬的相對豐度,顯著降低血清氧化三甲胺和盲腸三甲胺水平,從而抑制動脈粥樣硬化[16]。Malik等[17]對20 例冠心病患者每日補充L. plantarum菌株299v持續(xù)6 周,發(fā)現(xiàn)可改善患者冠心病血管內(nèi)皮功能、降低炎癥。L. plantarum P8被證明可緩解壓力和焦慮,改善記憶認知[18]。以上研究對L. plantarum益生功效的研究都基于菌株水平進行評估。而益生菌是否能夠活著進入腸道,并在其中發(fā)揮作用,甚至定植于腸道[19],是判斷益生菌是否具有益生功效的主要標準。

鑒于目前業(yè)界對菌株水平益生菌功效評價的共識[20-22],在開展腸道內(nèi)益生菌相關(guān)研究時,需要基于菌株水平對其進行定性定量分析,定性判斷是否活著進入腸道,定量判斷是否達到一定劑量。目前基于菌株水平對益生菌在腸道內(nèi)定性和定量評價相關(guān)研究報道仍較匱乏,也尚未建立合理有效的評價方法。而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法效率低且無法從外觀形態(tài)鑒定到菌株水平,因此建立對益生乳桿菌基于菌株水平的定性定量分析方法尤為重要。

本研究以1 株具有潛在益生功效的L. plantarum HNU082為例,對其在菌株水平上基于腸道定性以及定量分析,建立宿主腸道內(nèi)L. plantarum HNU082菌株水平的定性定量研究方法,每個菌株都具有自己獨特的基因特征,這也是從腸道內(nèi)能夠?qū)⒃摼暾业降睦碚撘罁?jù)[23]。首先從基因?qū)用嬲业皆摼晏禺愋云?設(shè)計特異性引物,同時注釋抗生素相關(guān)抗性基因,并對其進行驗證,找到其能耐受的抗生素及最小耐受濃度[24],利用抗生素對糞便中的微生物進行第一步篩選,并分離篩選疑似菌落,而后用特異性引物擴增該菌株用于在腸道水平上的定性,并通過實時聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)定量分析。real-time PCR用于特定基因片段的定量研究己經(jīng)有大量文獻報道,有一定的準確性[25]。最后用實例對該定性定量方法驗證。本研究旨在建立完善宿主腸道內(nèi)L. plantarum HNU082定性定量研究方法,為腸道內(nèi)對益生菌的益生功效評價以及益生菌產(chǎn)品功效評價提供新的衡量指標,也將為益生乳桿菌的體內(nèi)研究方法提供重要理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L. plantarum HNU082于2016年分離自海南特色發(fā)酵魚茶樣本[26],23 種參考菌株分離自海南特色發(fā)酵蔬菜[27]及海南特色發(fā)酵海產(chǎn)品樣本中[28],保藏于海南大學食品學院熱帶有益微生物菌種資源庫,用于特異性引物篩選。

MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;諾氟沙星、鹽酸克林霉素、紅霉素、羅紅霉素、鹽酸四環(huán)素、氧四環(huán)素、鹽酸萬古霉素、羧芐青霉素鈉、頭孢唑啉鈉、氯霉素、利福平 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、酚、乙酸鈉(均為分析純) 廣州化學試劑廠;甲醇、異丙醇、硼酸、氯仿、異戊醇(均為分析純) 西隴科學股份有限公司;6×DNA loading buffer 北京康為世紀生物科技有限公司;2×Taq Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司;核酸染料(Goldview) 美國Amerco公司;瓊脂糖北京天根生化科技有限公司;瓊脂 上海百賽生物技術(shù)有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)上海吉至生化科技有限公司;pUC-T TA cloning kit北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A300 Fast Thermal Cycler PCR擴增儀 杭州朗基科學儀器有限公司;SW-CJ-1C標準型雙人凈化工作臺 蘇州蘇凈集團公司;DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠;FA-1604電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;AlphaImage HP型Cell Biosciences凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司;UV759紫外-可見分光光度計上海奧譜勒儀器有限公司;G154DW高壓蒸汽滅菌鍋廈門致微儀器有限公司;FST-RO精密型超純水機 普利菲爾應(yīng)用材料有限公司;85-1恒溫磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;StepOne Plus real-time PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;G20電動組織研磨器 生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1L.plantarumHNU082定性分析

1.3.1.1L.plantarumHNU082基因水平分析

采用CTAB凍融法提取菌株DNA[29],并溶于TE(Tris-EDTA)緩沖液中,于-80 ℃保存,而后送樣至上海美吉生物有限公司進行單分子PacBio測序分析,經(jīng)過質(zhì)控拼接后組裝并進行基因預(yù)測,并與抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫進行比對,找到其存在的抗生素抗性基因,注釋后選取對應(yīng)抗生素進行驗證。與23 株NCBI數(shù)據(jù)庫中己鑒定且有完整基因序列的L.plantarum進行同源基因聚類,找到L.plantarumHNU082特有的特異性片段用于特異性引物設(shè)計。

1.3.1.2 特異性片段設(shè)計及定性分析

同源基因聚類找到L.plantarumHNU082的特異性片段,通過Primer軟件設(shè)計特異性引物,并利用實驗室保存的其他菌株進行PCR擴增驗證。經(jīng)引物設(shè)計、驗證等過程,選用A7作為HNU082的特異性引物,上游引物序列5’-TGTTTCGGTTAGATAGCGTGTC-3’,下游引物序列5’-TTAGCCCAACTACCTTCCTG-3’,擴增片段長度190 bp。反應(yīng)體系50 μL:1 μL DNA模板,1 μL上游引物,1 μL下游引物,20 μLTaqMix,27 μL dd H2O。PCR條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,62 ℃退火45 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)26 次;72 ℃末端延伸10 min。PCR擴增結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.3.2L.plantarumHNU082定量分析

1.3.2.1L.plantarumHNU082基因水平分析

實驗步驟同1.3.1.1節(jié)。

1.3.2.2 real-time PCR和定量反應(yīng)系統(tǒng)特異性評定

在ABI StepOne Plus real-time PCR儀上以待測樣本DNA為模板,進行L.plantarumHNU082特異性引物的PCR擴增和檢測。擴增程序:94 ℃預(yù)變性20 s;94 ℃變性5 s,58 ℃退火35 s,72 ℃延伸50 s,循環(huán)40 次。將溶解曲線設(shè)定從60 ℃緩慢加熱至95 ℃,溫度每增加0.2 ℃檢測一次信號強度,進行連續(xù)熒光采集,得到熔融曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. plantarum HNU082全基因組水平分析

對菌株全基因組進行測序及基因預(yù)測(表1),該菌株基因組由1 條染色體和4 個質(zhì)粒組成。染色體長度為3 303 679 bp,總GC含量為44.51%,共編碼3 203 個開放閱讀框。該菌株基因組編碼了豐富的碳水化合物代謝基因和磷酸轉(zhuǎn)移酶基因復(fù)合體,這些特點有利于該菌株在營養(yǎng)限制的環(huán)境中生長,也有利于該菌株在腸道內(nèi)參與碳水化合物競爭時更具優(yōu)勢。

表1 基因預(yù)測結(jié)果Table 1 Gene prediction results

文獻中己經(jīng)測序全基因組L.plantarum的平均基因組大小約為3 200 kb,編碼基因數(shù)量為3 000 個左右,平均GC含量為44.5%左右[30]。本實驗所用參考菌株的基因組大小,編碼基因數(shù)量更為豐富,而GC含量與其他NCBI中己鑒定的L.plantarum菌株基本一致。

圖1 L. plantarum HNU082基因組圖Fig. 1 Genome-wide map of L. plantarum HNU082

根據(jù)基因預(yù)測結(jié)果,用Circos v0.64軟件繪制基因組圈圖(圖1)。圈圖的最外圈為基因組大小的標識,每一個刻度為0.1 Mb;第2圈和第3圈為正鏈、負鏈上的編碼區(qū),不同顏色表示編碼區(qū)不同的COG(clusters of orthologous groups of proteins)功能分類;第4圈為rRNA和tRNA;第5圈為GC含量,向外的紅色部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量,峰值越高表示與平均GC含量差值越大,向內(nèi)的藍色部分表示該區(qū)域GC含量低于全基因組平均GC含量,峰值越高表示與平均GC含量差值越大;最內(nèi)一圈為GC skew值,即為(G-C)/(G+C),在生物意義上該值為正值時正鏈越更傾向于轉(zhuǎn)錄編碼區(qū),為負值時負鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)。

2.2 抗性基因注釋與驗證

將L.plantarumHNU082的拼接序列與抗性基因數(shù)據(jù)庫CARD(Comprehensive Antibiotic Research Database)比對,注釋抗性基因并選取對應(yīng)抗生素驗證結(jié)果,由圖2可見,L.plantarumHNU082對萬古霉素及諾氟沙星的耐受性較好,最大耐受質(zhì)量濃度可達到1 280 μg/mL,經(jīng)平板驗證后選取萬古霉素與諾氟沙星作為屏蔽腸道中其他微生物的抗生素,具體驗證過程見文獻[24]。

圖2 培養(yǎng)12 h不同抗生素濃度下L. plantarum HNU082吸光度Fig. 2 Absorbance of L. plantarum HNU082 with different concentrations of antibiotics after culture for 12 hours

多數(shù)乳酸菌都存在對萬古霉素的先天性抗性基因,L.plantarum的細胞壁上一種五肽末端的D-丙氨酸殘基被D-乳酸或D-絲氨酸取代,而D-乳酸或D-絲氨酸對糖肽類抗生素產(chǎn)生耐藥性,阻止了萬古霉素的結(jié)合,從而使菌株對萬古霉素產(chǎn)生抗性[31]。因此,抗生素的選用只能殺滅部分糞便中的微生物,不能作為對糞便中L.plantarumHNU082定性篩選的指標。糞便中微生物經(jīng)抗生素培養(yǎng)篩選后的單菌落仍需要特異性引物進行特異性擴增鑒別。

2.3 特異性引物設(shè)計及驗證

首先從NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫選取與L.plantarumHNU082進化距離相近的23 株L.plantarum,并下載完整基因序列與標準菌株進行同源基因聚類,聚類結(jié)果如圖3所示,中間重疊的部分指24 株菌株共有的基因,每一片“花瓣”邊緣位置數(shù)字表示該菌株獨有的基因數(shù)量,L.plantarumHNU082與其他菌株相比具有大量菌株特異性片段。

圖3 同源基因聚類韋恩圖Fig. 3 Venn map of homologous gene clustering

以L.plantarumHNU082獨有的200 個基因片段為模板設(shè)計特異性引物,以實驗室保存的L.plantarum提取的DNA為特異性檢測模板,以L.plantarumHNU082提取的DNA為陽性對照,進行PCR擴增,檢測方法的特異性。并利用實驗室保存的L.plantarum進行驗證(圖4),L.plantarumHNU082在250 bp左右有明亮條帶,其他L.plantarum菌株在250 bp未出現(xiàn)明亮條帶,證明引物特異性良好,可用于腸道內(nèi)容物的定性研究。

圖4 特異性引物驗證情況Fig. 4 Verification of the primer specificity

從菌株水平看,盡管各個菌株在種水平上進化距離相近,但每一個菌株在基因水平上都會有其獨特的序列作為身份標簽,需要找到該菌株獨特的序列,根據(jù)其設(shè)計大小合適的特異性引物用作腸道內(nèi)定性的篩選標準。

2.4 L. plantarum HNU082 定量方法的建立

圖5 樣本擴增溶解曲線Fig. 5 Dissociation curves of samples

以初始模板量為橫坐標(X),Ct值為縱坐標(Y),繪制出L.plantarumHNU082的real-time PCR標準曲線,方程Y=-3.192X+38.536,建立的L.plantarumHNU082標準曲線符合real-time PCR的要求。為區(qū)分產(chǎn)物中的特異性產(chǎn)物以及非特異性產(chǎn)物,繪制了L. plantarum HNU082的擴增熔解曲線,表示隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度。從圖5可以看出,擴增產(chǎn)物的熔解曲線一致,在82.74 ℃達到最高峰,且曲線都為單一峰形,證明熒光定量反應(yīng)的特異性良好,無特異性引物,可以用于L. plantarum HNU082的熒光定量。

2.5 腸道內(nèi)L. plantarum HNU082定性定量結(jié)果實例驗證

對大鼠進行為期4 周的灌胃,每周對糞便進行采樣,停止灌胃后,仍在每周對糞便進行采樣,持續(xù)到第8周。糞便分為2 份,一份用于定性分析,選用MRS乳酸菌限制性培養(yǎng)基混合萬古霉素及諾氟沙星對糞便進行稀釋涂布,稀釋梯度選擇10-3～10-6,37 ℃培養(yǎng)24 h,對單菌落進行特異性引物PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳圖譜驗證,圖6為大鼠糞便中稀釋梯度為10-6時,37 ℃培養(yǎng)24 h的菌落以及用特異性引物進行菌落PCR后的凝膠電泳圖。從培養(yǎng)結(jié)果看,平板無明顯雜菌,菌落呈白色圓形凸起且邊緣整齊,符合乳桿菌屬形態(tài)特征,可見抗生素對雜菌的屏蔽效果較好,凝膠電泳圖可見膠板存在一條明亮條帶,可認為是L. plantarum HNU082;另一份用于定量分析,提取糞便微生物總DNA,應(yīng)用real-time PCR的方法對L. plantarum HNU082進行定量(圖7)。

圖6 L. plantarum HNU082定性分析結(jié)果Fig. 6 Qualitative analysis of L. plantarum HNU082

real-time PCR分析灌胃后不同時間點大鼠糞便中L. plantarum HNU082數(shù)量[32],前4 周持續(xù)灌胃的同時檢測,如圖7所示,該菌株在第4周數(shù)量達到最大值,為(7.51±0.32)(lg(CFU/g))。而后停止灌胃,可以看出L. plantarum HNU082出現(xiàn)了明顯下降趨勢,而后數(shù)量穩(wěn)定在第8周,為(5.30±0.31)(lg(CFU/g))。由此可知real-time PCR用于L. plantarum HNU082的在腸道內(nèi)定量的方法可行。

圖7 灌胃后L. plantarumHNU082在腸道內(nèi)real-time PCR結(jié)果Fig. 7 Real-time PCR results of L. plantarum HNU082 in intestine after intragastric administration

3 結(jié) 論

本研究通過基因組層面設(shè)計菌株的特異性引物,并利用抗生素進行第一步篩選,對分離出單菌落進行特異性擴增進行定性分析,通過real-time PCR定量分析,建立了一種基于菌株水平對腸道內(nèi)L. plantarum定性定量的分析方法,并以L. plantarum HNU082為例進行了驗證,效果良好。本方法的建立在菌株層面從腸道水平對體內(nèi)的益生菌株含量進行定性定量工作,適用于所有益生菌的相關(guān)定性定量研究,該方法可以從定義出發(fā),評價菌株是否能以一定劑量活著進入腸道,達到益生菌的標準,優(yōu)化益生菌市場,并作為評價指標用于益生菌的益生功效評價以及多元化益生菌產(chǎn)品功能評價中,也將為益生乳桿菌的體內(nèi)研究方法提供重要理論支持,為益生菌類保健食品的產(chǎn)業(yè)技術(shù)的發(fā)展以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)法律法規(guī)的制定提供參考指標,促進我國益生菌產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。