張佳嬋，邵 卿，王 倩，王昌濤,*，趙 丹，李 萌，孫寶國，劉繼濤

（1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，植物資源研究開發(fā)北京市重點實驗室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；3.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；4.云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650000）

如今，快節(jié)奏的工作生活環(huán)境使機體極易處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。在正常條件下，機體的酶防御體系發(fā)揮著非常重要的作用，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等通過清除多余的自由基來減緩氧化損傷[1]。當(dāng)活性氧自由基大量產(chǎn)生，其在體內(nèi)的聚集程度超過機體抗氧化系統(tǒng)自身的清除能力時，則會誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、DNA損傷以及蛋白質(zhì)表達(dá)異常。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是衰老的早期階段[2-5]。近年來，人們不斷尋求具有防護(hù)氧化應(yīng)激損傷作用的天然活性成分。

靈芝（Ganoderma lucidum）在中國有悠久的使用歷史，素有“仙草”的美名[6]。在《本草綱目》中有“補中益氣，增智慧，好顏色，久食輕身不老，延年神仙”的描述[7]。靈芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP）是靈芝的重要活性成分之一，已有研究發(fā)現(xiàn)GLP在抗氧化功效方面具有出色的表現(xiàn)[8-12]。以往GLP的提取來源多為子實體，因其木質(zhì)化嚴(yán)重、提取率較低。而從靈芝菌絲體中提取多糖的研究，因其較短的周期以及較高的提取效率越來越引起人們的重視[13-15]。與此同時，GLP常因其來源不同而在單糖組成上存在明顯差異[16]。通常高生物活性的GLP大多擁有主鏈長、側(cè)鏈變異頻率高、分子質(zhì)量較大等特點。一般認(rèn)為，分子質(zhì)量高于10 kDa的GLP具有較高生物活性，小于此值則活性很低[17]。因此，高活性GLP的篩選及其機制研究則顯得尤為重要。

除了機體自身抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮防護(hù)氧化應(yīng)激的作用機制外，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）-核因子-E2相關(guān)因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號通路被認(rèn)為是機體最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路。Keap1-Nrf2/ARE途徑表達(dá)的蛋白質(zhì)分子為機體提供了重要的防御作用，是對抗環(huán)境有害物質(zhì)損傷和內(nèi)源性應(yīng)激的有力武器[18-23]。分析該信號通路中重要活性分子的表達(dá)水平變化，對于深入分析物質(zhì)發(fā)揮防護(hù)氧化應(yīng)激損傷的內(nèi)在機制具有非常重要的意義。

鑒于此，本研究以實驗室保存靈芝菌種G055為研究對象，采用常規(guī)熱水浸提法[24]對GLP進(jìn)行工藝條件的優(yōu)化，并進(jìn)一步初步純化及分析。同時以H2O2誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞（human skin fibroblasts，HSF）損傷模型為研究載體，分析GLP及其組分對細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及相關(guān)抗氧化酶的作用效果，評價GLP對H2O2誘導(dǎo)的HSF氧化應(yīng)激的保護(hù)及修復(fù)功效；最后，以Keap1-Nrf2/ARE信號通路上下游關(guān)鍵調(diào)控因子為重要考察對象，探究其在mRNA水平的變化。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

靈芝菌種G055來自于實驗室保藏菌種；HSF 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；抗壞血酸（純度≥99.7%）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.25%（含乙二胺四乙酸）胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、FM培養(yǎng)基、新生牛血清、PBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素美國Gibco生命技術(shù)公司；EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；GSH-Px、MDA、SOD、CAT、ROS檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WJ-80A-II型CO2恒溫培養(yǎng)箱 上海圣科儀器設(shè)備有限公司；熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Infinite M200 PRO熒光酶標(biāo)儀、Sunrise酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；SPx-250BF-2生化培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；Anke 3-30K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；1200高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司；DEAE-52陰離子交換層析柱 北京英萊克科技發(fā)展有限公司；DHL-A電腦恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GLP提取工藝的確定

將經(jīng)過活化的G055靈芝液體菌種以體積比1∶10的接種量接種于土豆培養(yǎng)基培養(yǎng)中，置于28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。將所得靈芝菌絲體水洗2 遍，冷凍干燥得到靈芝菌絲體凍干粉。取1 g樣品粉末，并按表1條件進(jìn)行單因素試驗，每組重復(fù)3 組，5 000 r/min離心10 min，按照苯酚-硫酸法[25]測定提取液中的多糖含量。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計三因素三水平正交試驗（表2），通過正交試驗得到最優(yōu)提取條件。

表1 單因素試驗條件Table 1 Independent variables and their levels used in one-factor-at-a-time design

表2 三因素三水平正交試驗Table 2 Independent variables and their levels used in orthogonal array design

1.3.2 GLP的初步純化及鑒定

采用Sevag法[26]將熱水浸提后的粗多糖溶液進(jìn)行脫蛋白處理，具體操作如下：10 g/L的粗多糖溶液以體積比1∶5加入Sevag試劑（氯仿-正丁醇體積比5∶1）中，電磁攪拌30 min后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置10 min，除去兩相交界處的變性蛋白質(zhì)。水層取樣測蛋白質(zhì)量濃度和多糖質(zhì)量濃度[25]，分別按照公式（1）、（2）計算多糖損失率及蛋白去除率。

采用DEAE-52離子交換柱對脫蛋白后的粗多糖進(jìn)行初步分離[26]，具體操作如下：取脫蛋白后的GLP配制成10 g/L的多糖溶液，上樣量20 mL。上樣前過0.22 μm孔徑聚醚砜濾膜，除去不溶物。分別用去離子水和0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl以1.0 mL/min的流速分步洗脫，每種洗脫液收集30 管，每管10 mL。用苯酚-硫酸法檢測OD值，作洗脫曲線。合并相同峰組分。透析過夜后在-80 ℃ 0.03 mbar條件下冷凍干燥成粉末。對所得各組分進(jìn)行純度測定。

采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對各組分進(jìn)行單糖組成分析測定，具體方法為：稱取2 mg純化后的多糖，加入2 mol/L三氟乙酸5 mL，充氮氣排除空氣，然后120 ℃水解反應(yīng)4 h，加入無水甲醇，反復(fù)旋蒸除去有機溶劑，最后溶于2 mL去離子水中，混勻，取100 μL于新的離心管中，加入氘標(biāo)記的琥珀酸（10 μL、1.5 g/L）真空冷凍干燥。在凍干樣品中加入20 g/L的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液50 μL，40 ℃水浴反應(yīng)80 min，反應(yīng)結(jié)束后加入80 μLN-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40 ℃水浴在反應(yīng)80 min，然后12 000 r/min離心5 min，取上清液放入進(jìn)樣瓶，室溫放置2 h后，進(jìn)行GC-MS分析[27]。GC-MS條件：采用HP-5 GC柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量1 μL；分流比為10∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測溫度240 ℃；載氣N2，流速1 mL/min；升溫程序為初始溫度110 ℃，保持2 min，8 ℃/min升到160 ℃，再以2 ℃/min升到230 ℃，最后5 ℃/min升到250 ℃，保持2 min。

1.3.3 GLP對HSF細(xì)胞抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

細(xì)胞模型的建立：將HSF細(xì)胞以孔1×104個/孔接種于96 孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)基，分別添加100 μL含不同濃度H2O2（1、25、50、100、250、500、1 000 μmol/L）的培養(yǎng)基，各組均設(shè)5 個平行，對照組不添加H2O2。刺激1、2、3、4 h后，采用四甲基偶氮唑鹽法[28]，于490 nm波長處測定各孔OD值。得出HSF細(xì)胞存活率，選擇細(xì)胞存活率為50%的H2O2溶液濃度作為建模濃度，最終確定的建模條件為100 μmol/L H2O2處理細(xì)胞2 h。

GLP及其各組分、陽性對照VC處理濃度的確定：將HSF細(xì)胞以1×104個/孔接種于96 孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法[28]，探討不同濃度GLP及其各組分、陽性對照VC對細(xì)胞活力的影響（條件參照細(xì)胞模型的建立方法，即用100 μL不同濃度樣品替代H2O2，其他條件不變）。選擇細(xì)胞存活率為80%以上的樣品濃度作為下一步實驗濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLP、GLP I、GLP II的質(zhì)量濃度均為1.25 g/L時，其活力均在80%以上（數(shù)據(jù)未展示）；陽性對照VC的IC80為86 mg/L（數(shù)據(jù)未展示）。

GLP及其組分對HSF細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的保護(hù)和修復(fù)：修復(fù)組為先加入H2O2刺激2 h后，每孔加入100 μL樣品培養(yǎng)24 h；用無血清DMEM代替樣品處理細(xì)胞作為修復(fù)作用中的模型組（Model組）。保護(hù)組為先加入100 μL樣品培養(yǎng)24 h后，再以H2O2刺激2 h；用無血清DMEM來代替樣品處理細(xì)胞作為保護(hù)作用中的模型組（Model組）。以無樣品、無H2O2刺激、無血清DMEM處理的細(xì)胞為空白組（Control組）。處理結(jié)束參照各項指標(biāo)的試劑盒說明書完成GSH-Px、MDA、SOD、CAT以及ROS水平的測定。

1.3.4 GLP對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型Keap1-Nrf2/ARE信號通路的影響

根據(jù)NCBI中發(fā)布的基因序列，通過Primer Express軟件設(shè)計引物，以管家基因β-actin作為內(nèi)參基因，共5 個基因的特異性引物序列見表3。

表3 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列Table 3 Primer sequences used for real-time polymerase chain reaction

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，所得結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLP的提取及純化工藝

2.1.1 GLP的提取工藝優(yōu)化

固定料液比為1∶50（m/V），浸提溫度為70 ℃，浸提1 次，考察浸提時間對多糖提取率的影響。從圖1A可知，提取時間為1 h時，GLP提取率最高；提取時間在1.5～2.5 h范圍內(nèi)，提取率無顯著性差異（P＞0.05）；當(dāng)提取時間延長至3 h時，GLP提取率最低。因此，從節(jié)約角度出發(fā)，選擇1 h作為最優(yōu)提取時間。

固定料液比為1∶50（m/V），浸提時間為2 h，浸提1 次，考察浸提溫度對GLP提取率的影響，實驗結(jié)果見圖1B?？梢钥闯?，70 ℃時多糖提取率達(dá)到最大，且與其他條件相比差異顯著（P＜0.05），故確定最佳浸提溫度為70 ℃。

固定浸提時間為2 h，浸提溫度為70 ℃，浸提1 次，考察料液比對GLP提取率的影響，實驗結(jié)果見圖1C。當(dāng)料液比為1∶30和1∶60（m/V）時，多糖提取率最高，兩者之間無顯著性差異（P＞0.05），但與其他條件相比顯著提高了GLP提取率（P＜0.05）?？紤]原料成本因素，在該條件下的最優(yōu)單因素提取條件確定為料液比1∶30（m/V）。

固定料液比為1∶50（m/V），浸提時間為2 h，浸提溫度為70 ℃，考察浸提次數(shù)對多糖提取率的影響，實驗結(jié)果見圖1D。隨提取次數(shù)的增加，多糖提取率大幅下降，第二次提取率僅為（8.05±1.34）%，綜合考慮，選擇浸提次數(shù)為1 次。

圖1 不同提取條件對GLP提取率的影響（n＝3）Fig. 1 Effects of different extraction conditions on the extraction yield of GLPs (n = 3)

參照單因素試驗結(jié)果，以浸提時間、浸提溫度、料液比為考察因素，以GLP提取率為考察指標(biāo)，按照表2中的因素設(shè)計并進(jìn)行正交試驗，結(jié)果見表4、5。

表4 正交試驗結(jié)果分析Table 4 Orthogonal array design with analysis of experimental results

表5 正交試驗方差分析Table 5 Analysis of variance for the effect of various extraction conditions on the extraction yield of GLPs

由表4可知，這3 個因素的最佳組合為A3B1C3。由表5可知，F(xiàn)A＝113.29、FB＝103.19、FC＝68.26，依照影響強度由大到小的順序排列，得到三因素對GLP提取率的影響強弱順序（由強到弱）為A＞B＞C。在最優(yōu)提取工藝條件（料液比1∶35，m/V），浸提溫度65 ℃，浸提時間1.5 h下進(jìn)行驗證，得到GLP提取率為（47.70±0.50）%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%，再現(xiàn)性良好。利用該方法提取靈芝菌絲體多糖，其提取率遠(yuǎn)高于靈芝子實體[29]。這是由于靈芝菌絲體易于破壁，胞內(nèi)多糖可快速溶出，且靈芝入土生長成為子實體期間自身代謝會消耗多糖，造成多糖總含量的降低[30]。

2.1.2 GLP的純化工藝

通過溶劑提取法所獲的粗多糖通常蛋白質(zhì)含量較多。用于除去蛋白的傳統(tǒng)方法包括三氯乙酸法、單寧酸法和Sevag法[31-32]。采用三氯乙酸法去除蛋白質(zhì)的效率很高，但不可避免的是三氯乙酸容易引起多糖的糖苷鍵斷裂，增大多糖損失率。單寧酸法在去除蛋白質(zhì)過程中多糖的損失率低，可能源于單寧酸與蛋白質(zhì)間可發(fā)生特異性反應(yīng)，不會破壞到多糖，但其去除蛋白能力不強。Sevag法去除蛋白質(zhì)的效率最高，也是當(dāng)前最受歡迎的一種除蛋白的方法[32]。

圖2 Sevag法除蛋白質(zhì)效果Fig. 2 Removal efficiency of proteins by Sevag regent

本實驗對GLP進(jìn)行了8 次去蛋白處理，結(jié)果如圖2所示。蛋白的脫除率與處理次數(shù)呈正相關(guān)，首次處理后脫除率僅為（12.31±0.24）%，第8次可達(dá)（72.87±1.90）%。當(dāng)用Sevag處理6 次后，蛋白質(zhì)的脫除率變化不明顯?？紤]到多糖成分與有機試劑長時間接觸可能會影響其生物活性，因此共進(jìn)行6 次處理，此時蛋白的脫除率可達(dá)（66.68±1.13）%。

圖3 GLP柱層析洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of GLPs by DEAE-52 column chromatography

用DEAE-52離子交換樹脂對脫蛋白后的GLP進(jìn)行初步分離純化，得到洗脫曲線。由圖3可知，共4 個洗脫峰（I～I(xiàn)V）分別出現(xiàn)在90、390、690、990 mL處，收集合并各組分?？紤]到GLP III和GLP IV吸光度較低，故僅選用第一組分（GLP I）和第二組分（GLP II）進(jìn)行后續(xù)實驗。將收集的組分透析后冷凍干燥，得到GLP I、II。

圖4 GLP（A）、GLP I（B）、GLP II（C）的GC圖譜Fig. 4 GC spectrum of GLPs (A), GLP I (B), and GLP II (C)

表6 單糖相對分子質(zhì)量及標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 6 Monosaccharide molecular masses and standard curves

表7 GLP樣品單糖組成及物質(zhì)的量比例Table 7 Monosaccharide composition and molar ratio in GLP samples

對GLP及其組分GLP I、GLP II進(jìn)行衍生反應(yīng)，利用GC-MS測定單糖組成。圖4為GLP（A）、GLP I（B）、GLP II（C）的GC圖譜。經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量及標(biāo)準(zhǔn)曲線（表6）對比，GLP及其組分的單糖組成及物質(zhì)的量比例如表7所示。其中GLP I較GLP、GLP II多出鼠李糖和巖藻糖兩種單糖，考慮為純化后的富集作用所引起的。

2.2 GLP對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型的保護(hù)和修復(fù)作用

2.2.1 GLP對氧化損傷細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積累情況的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的最典型的終產(chǎn)物。MDA含量增加是過氧化作用加劇、細(xì)胞脂膜受到損傷的重要表現(xiàn)，其含量越高表明脂質(zhì)過氧化作用越強[33-34]。圖5A、B分別為保護(hù)和修復(fù)作用下GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細(xì)胞內(nèi)MDA含量影響的結(jié)果。結(jié)果表明，100 μmol/L H2O2處理細(xì)胞2 h處理后Model組能夠極顯著提高細(xì)胞內(nèi)MDA含量（P＜0.01）。與Model組相比，GLP、GLP I、GLP II、VC均能極顯著減少HSF細(xì)胞內(nèi)MDA的積累（P＜0.01）。在本實驗所考察作用濃度下，各保護(hù)作用處理方式中，樣品減少MDA積累的能力由高到低依次為GLP II＞VC＞GLP＞GLP I，修復(fù)作用中，樣品降低MDA積累的能力由高到低依次為VC＞GLP II＞GLP＞GLP I，兩種作用中VC與GLP II均不具有顯著性差異（P＞0.05）。

圖5 GLP對HSF細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響Fig. 5 Effect of GLPs on MDA content in HSF cells

2.2.2 GLP對HSF細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

圖6 GLP對HSF細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA積累情況的影響Fig. 6 Effect of GLPs on the levels of MDA and ROS in HSF cells

保護(hù)與修復(fù)兩種處理方式下GLP及其組分（GLP I和GLP II）與VC對細(xì)胞活性氧水平的影響結(jié)果如圖6A、B所示。與Control組相比，H2O2處理后極顯著提高了細(xì)胞內(nèi)ROS水平（P＜0.01）?？傮w上看，兩種作用方式下，GLP、GLP I和GLP II均能極顯著降低HSF細(xì)胞內(nèi)ROS的含量（P＜0.01），與陽性對照VC相比，GLP I在保護(hù)作用方面具有更為優(yōu)異的表現(xiàn)。

2.2.3 GLP對氧化損傷細(xì)胞抗氧化酶水平的影響

SOD是機體內(nèi)重要的O2-·清除劑，它可以把有害的O2-·轉(zhuǎn)化為H2O2，CAT可將H2O2分解為分子氧和水，與SOD具有協(xié)同作用，能夠清除體內(nèi)過剩自由基清除。而GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，三者共同構(gòu)成了體內(nèi)的主要抗氧化酶體系，維持機體內(nèi)部自由基的相對穩(wěn)定，起到抗氧化的作用。

圖7A1、A2分別為保護(hù)和修復(fù)兩種方式下，GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細(xì)胞內(nèi)CAT活性影響的結(jié)果。與Model組相比，兩種作用方式處理下，GLP、GLP I、GLP II、VC均能極顯著提高HSF細(xì)胞內(nèi)CAT的活力（P＜0.01）；在本實驗所考察作用濃度下，在保護(hù)作用處理方式中，各樣品提高CAT的能力由高到低依次為：GLP I＞VC＞GLP＞GLP II，修復(fù)作用處理方式中為：GLP I＞GLP II＞VC＞GLP。

圖7B1、B2分別為保護(hù)和修復(fù)兩種方式下，GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活力影響的結(jié)果。結(jié)果表明，兩種作用方式處理下，GLP、GLP I、GLP II與VC均能顯著提高HSF細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px活力。在保護(hù)作用處理方式下，1.25 g/L GLP I處理HSF細(xì)胞24 h再進(jìn)行H2O2損傷處理，其最終的GSH-Px活力達(dá)到（12.19±0.61）U/g，比Model組提高了36.84%；在修復(fù)作用處理方式下，GLP I組GSH-Px活力為Model組的7.56 倍，且3 種靈芝多糖處理后的GSH-Px水平均高于陽性對照VC。

圖7C1、C2分別為保護(hù)和修復(fù)兩種方式下，GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細(xì)胞內(nèi)SOD活力影響的結(jié)果。與Control組相比，Model組細(xì)胞內(nèi)SOD活力顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，GLP、GLP I、GLP II和VC均能極顯著提高HSF細(xì)胞內(nèi)SOD活力（P＜0.01）；并且GLP及其兩組分的促進(jìn)能力均高于陽性對照VC；GLP I的保護(hù)和修復(fù)能力最高，保護(hù)處理方式下，GLP I組SOD活力為Model組的2.39 倍；修復(fù)處理方式下，GLP I組的SOD水平為Model的2.92 倍，具有較好的提高SOD活力的能力。

圖7 GLP對HSF細(xì)胞內(nèi)SOD活力的影響Fig. 7 Effects of GLP on SOD activity in HSF cells

2.3 GLP對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型Keap1-Nrf2/ARE信號通路的影響

Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激體系中的關(guān)鍵信號因子，在細(xì)胞質(zhì)中受到抑制性結(jié)合蛋白Keap1控制。Nrf2與Keap1的解離是Nrf2-ARE途徑發(fā)揮活性的關(guān)鍵步驟。當(dāng)細(xì)胞受到ROS刺激后，Nrf2與Keap1發(fā)生解離，活化的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，在Maf蛋白作用下與抗氧化原件ARE結(jié)合，激活靶基因表達(dá)，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用[35-37]。血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化還原酶-1（NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1，NQO1）是該信號通路的下游效應(yīng)基因編碼的蛋白，HO-1在清除ROS，抵御過氧化物、過氧亞硝酸鹽、羥基和超氧化物自由基方面發(fā)揮著重要作用[38]。NQO1可以催化醌還原成氫醌，以促進(jìn)醌的排泄，阻斷醌參與ROS的產(chǎn)生，減少對DNA的氧化損傷程度。

由前期實驗可知，GLP、GLP I、GLP II的質(zhì)量濃度均為1.25 g/L時，其活力均在80%以上，因此設(shè)定低（0.5 g/L）、中（1.5 g/L）和高（2.5 g/L）3 個劑量來探究GLP對Keap1-Nrf2/ARE信號通路各因子表達(dá)水平的影響。

圖8為保護(hù)作用處理方式下，不同樣品對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關(guān)鍵信號分子的表達(dá)情況影響。由圖8A可知，各靈芝多糖（GLP、GLP I和GLP II）處理后，Nrf2mRNA表達(dá)量均極顯著高于Model組（P＜0.01），并且顯著高于陽性對照VC組。由圖8B可知，與Model組相比，負(fù)調(diào)控因子Keap1的相對表達(dá)量變化趨勢并不一致，在GLP低劑量組、GLP中劑量組、GLP I中劑量組、GLP II組高劑量組、GLP II組低劑量組中，Keap1表達(dá)受到極顯著抑制（P＜0.01），而在其他組中顯著高于Model組；陽性對照VC組的Keap1mRNA相對表達(dá)量與Model組相比差異不顯著（P＞0.05）?？赡苁谴嬖谄渌蚝托盘柾吩诎l(fā)揮抗氧化作用。

在保護(hù)作用研究中，除GLP I中劑量組極顯著降低了下游抗氧化因子HO-1的表達(dá)量，其他樣品均能極顯著提高HO-1的表達(dá)量（P＜0.01）（圖8C）。GLP中劑量組、高劑量組的NQO1表達(dá)提高，且與Model組相比差異極顯著（P＜0.01），GLP I、GLP II組在中劑量組顯著表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）（圖8D）。

圖8 保護(hù)作用下GLP對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關(guān)鍵基因相對表達(dá)量的影響Fig. 8 Relative gene expression of key genes in the Keap1-Nrf2/ARE signaling pathway in cells protected from oxidative stress damage by GLPs

圖9 修復(fù)作用下GLP對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關(guān)鍵基因相對表達(dá)量的影響Fig. 9 Relative gene expression of key genes in the Keap1-Nrf2/ARE signaling pathway in cells repaired by GLPs against oxidative stress damage

圖9 為修復(fù)作用處理方式下，不同樣品對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關(guān)鍵信號分子的表達(dá)情況影響。由圖9A可知，在修復(fù)作用中，各靈芝多糖組除高劑量組外，Nrf2的表達(dá)量均極顯著提高（P＜0.01）；陽性對照VC修復(fù)后，并沒有提高Nrf2的相對表達(dá)量，可能原因是細(xì)胞受損嚴(yán)重，VC的修復(fù)作用沒有激活Nrf2的表達(dá)。由圖9B可知，負(fù)調(diào)控因子Keap1在各靈芝多糖處理組中均極顯著低于Model組（P＜0.01）。由圖9C可知，GLP I、GLP II組中HO-1的表達(dá)量隨質(zhì)量濃度的增加先降低后升高，而HO-1僅在GLP低劑量組中極顯著表達(dá)（P＜0.01）。由圖9D可知，GLP高劑量組，GLP I、GLP II中劑量組的NQO1極顯著表達(dá)（P＜0.01）。

3 討 論

20世紀(jì)90年代，有研究者提出了“氧化應(yīng)激”的概念。當(dāng)機體處于不利環(huán)境時，ROS大量產(chǎn)生，超過人體自身的清除速度，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)不平衡，大量的ROS進(jìn)入細(xì)胞參與生化反應(yīng)，誘發(fā)氧化應(yīng)激。通過破壞DNA，生物體失去了細(xì)胞基本生理活動所涉及的基因，導(dǎo)致細(xì)胞衰老和組織損傷[4-5]。機體內(nèi)眾多信號通路在氧化應(yīng)激過程中起著調(diào)節(jié)作用。其中，Keap1-Nrf2/ARE信號通路被認(rèn)為是機體最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路。Nrf2-ARE途徑表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，為機體提供了重要的防御作用，是對抗環(huán)境有害物質(zhì)損傷和內(nèi)源性應(yīng)激的有力武器[19-23]。

許多天然活性成分通過參與調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2/ARE信號通路從而達(dá)到防護(hù)氧化應(yīng)激損傷的作用效果。白藜蘆醇是一種Nrf2的激活劑，可以通過激活Nrf2-HO-1-NOQ-1和SIRT1-AMPK-PGC-1alpha通路發(fā)揮抗炎、對抗氧化應(yīng)激的作用[39]。Patwardhan等發(fā)現(xiàn)秋葵黃酮通過Nrf2-ARE-HO-1防護(hù)UVB誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞的DNA損傷[40]。多糖類成分也被報道具有激活Nrf2因子的作用。從大型褐藻羊棲菜中提取得到的多糖可以通過JNK1-β2-NRF2的相互作用激活Nrf2/ARE信號通路，并啟動Nrf2下游相關(guān)抗氧化和解毒酶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高機體整體的抗氧化能力，最終延緩小鼠的衰老進(jìn)程[41]。此外，有文獻(xiàn)也報道了在防護(hù)氧化應(yīng)激損傷方面具有顯著效果的其他植物多糖，如杏鮑菇多糖[42]、膠秋藻多糖[43]、枸杞多糖[44]、銀耳多糖[44]等。靈芝作為一種名貴中草藥，在中國已有了2 000多年的應(yīng)用歷史。靈芝多糖作為靈芝的一種重要活性成分，在抗氧化、抗衰老方面的研究已深入開展。邱玉芳等[46]報道了靈芝多糖可以上調(diào)血清中SOD水平。此外，周婕[47]和陳玉勝[48]等研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖除了可以清除羥自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧陰離子自由基以及過氧化氫外，還可以通過減輕脂質(zhì)過氧化從而保護(hù)因輻照所造成的肝損傷。在本研究中，來源于菌種wG055的靈芝多糖GLP及其組分GLP I和GLP II同樣具有顯著的防護(hù)氧化應(yīng)激損傷的功效。在保護(hù)和修復(fù)兩種處理方式上，GLP及其組分顯著降低了HSF損傷細(xì)胞MDA的積累和ROS水平，與文獻(xiàn)[47]報道相符；并且，GLP可以顯著提高細(xì)胞抗氧化酶的水平，對Keap1-Nrf2/ARE關(guān)鍵信號因子具有顯著的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步解釋了其發(fā)揮防護(hù)氧化應(yīng)激方面的作用機制。

本實驗為GLP在食品、藥品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的理論參考。但是，在機制研究方面可能還不全面，盡管Keap1-Nrf2/ARE信號通路是一條重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路，但是機體的內(nèi)在平衡是多因子、多信號通路復(fù)雜調(diào)控的結(jié)果。后期可以借助組學(xué)技術(shù)對GLP的深層機制進(jìn)行更系統(tǒng)、更全面的分析，闡明GLP發(fā)揮作用的深層機制。