謝銀丹，趙添玉，許 巖，任皓威，安晶晶，劉 寧*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150000）

三唑酮是一種廣譜抗真菌農(nóng)藥，化學(xué)名稱為1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-l-基)-α-丁酮，它被廣泛應(yīng)用于多種作物的病害防治[1-3]。但是該農(nóng)藥可能在農(nóng)作物[4]、土壤[5]和水體[6]中殘留，給生物安全與人類健康帶來(lái)負(fù)面的影響[7]。三唑酮可以通過(guò)職業(yè)性接觸、日常接觸和食物經(jīng)呼吸系統(tǒng)、皮膚和消化道到達(dá)人體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮具有神經(jīng)毒性[8]、胚胎發(fā)育毒性[9]和內(nèi)分泌毒性[10]，并具有致癌和致畸[11-12]作用。Al-Sarar等[13]用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)證明三唑酮的細(xì)胞毒性具有時(shí)間依賴性；劉少穎[14]所做急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三唑酮對(duì)斑馬魚胚胎的半致死濃度為12.2 μg/mL，表明三唑酮對(duì)斑馬魚胚胎具低毒性。孫瑞娟等[15]進(jìn)行的人肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)三唑酮質(zhì)量濃度高于20.998 μg/mL時(shí)會(huì)顯著抑制細(xì)胞的增殖，隨著質(zhì)量濃度的增大毒性逐漸增大。目前有關(guān)三唑酮的研究大多著重于水生生物，對(duì)哺乳動(dòng)物的研究較少，三唑酮對(duì)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。BMSCs作為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞共同的前體細(xì)胞，對(duì)于維系二者之間的均衡起著至關(guān)重要的作用，在維持正常的骨代謝均衡方面也具有十分重要的意義。乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）是一種由上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生分子質(zhì)量約為80 kDa的鐵結(jié)合糖蛋白，普遍存在于哺乳動(dòng)物的乳汁中，其理化性質(zhì)獨(dú)特，具有抑菌、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)鐵離子的吸收等諸多生物學(xué)功能。已有研究證明乳鐵蛋白具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用[16-19]，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Lf及其消化產(chǎn)物都能促進(jìn)BMSCs向成骨分化[20]。BMSCs是骨重建中新骨形成的主要來(lái)源[21]，在三唑酮作用下，BMSCs發(fā)生損傷，Lf修復(fù)損傷后的BMSCs活性及增殖能力成為關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)利用三唑酮作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞建立BMSCs損傷模型，研究Lf對(duì)三唑酮損傷BMSCs 的修復(fù)作用，以期為今后三唑酮?dú)埩魧?duì)BMSCs定向分化的影響研究提供量化參考，也為L(zhǎng)f的深度開發(fā)和調(diào)控個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（提取自2 周齡雄性SD大鼠）北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

三唑酮 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所；乳鐵蛋白新西蘭Westland Milk Products公司；DMEM-H培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國(guó)Gibco公司；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒 北京蘭杰柯科技有限公司；大鼠堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒、大鼠骨鈣素（osteocalcin，OCN）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；茜素紅染液、油紅O染液 廣州賽業(yè)生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒 北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HF-90 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)力康公司；HVD-1320超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；JEM-1200EX電子顯微鏡 日本日立公司；Sorvall Legeng Micro 17R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司；Model 680酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Step One PlusTM熒光定量PCR儀 美國(guó)Life Technologies公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取培養(yǎng)參考宮宇等[22]的細(xì)胞培養(yǎng)方法。

1.3.2 BMSCs損傷模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細(xì)胞接種密度為6×103個(gè)/孔，貼壁培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含有三唑酮的完全培養(yǎng)液，三唑酮的質(zhì)量濃度分別為0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL，培養(yǎng)時(shí)間分別為1、3、5、7 d。設(shè)調(diào)零組（完全培養(yǎng)液）、對(duì)照組（BMSCs＋完全培養(yǎng)液）、實(shí)驗(yàn)組（BMSCs＋含三唑酮的完全培養(yǎng)液）。棄去培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，細(xì)胞的增殖活性以細(xì)胞存活率表示，按下式計(jì)算。

1.3.3 Lf對(duì)BMSCs增殖的影響

采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率[23-24]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，BMSCs貼壁生長(zhǎng)24 h后，加入100 μL含有Lf的完全培養(yǎng)液，Lf的質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、150、200 μg/mL，培養(yǎng)時(shí)間為1、3、5、7 d。設(shè)調(diào)零組（完全培養(yǎng)液）、對(duì)照組（BMSCs＋完全培養(yǎng)液）、實(shí)驗(yàn)組（BMSCs＋含Lf的完全培養(yǎng)液）。棄去培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，按1.3.2節(jié)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 Lf對(duì)損傷BMSCs存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，BMSCs貼壁生長(zhǎng)24 h后，加入100 μL含有20 μg/mL三唑酮的完全培養(yǎng)液，損傷培養(yǎng)3 d。棄去培養(yǎng)液，加入100 μL含有100 μg/mL Lf的完全培養(yǎng)液，作用時(shí)間分別為3、5、7 d。實(shí)驗(yàn)設(shè)置調(diào)零組（完全培養(yǎng)液）、空白對(duì)照組（BMSCs＋完全培養(yǎng)液）、三唑酮損傷組（BMSCs＋20 μg/mL三唑酮）、Lf修復(fù)組（BMSCs＋20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。棄去培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，按1.3.2節(jié)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 損傷BMSCs成骨分化過(guò)程中ALP質(zhì)量濃度的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3代融合度為80%的BMSCs接種于6 孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞接種密度為4×104個(gè)/mL，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，加入2 mL含藥成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換一次含藥誘導(dǎo)液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、三唑酮組（20 μg/mL三唑酮）、Lf組（100 μg/mL Lf）、Lf修復(fù)組（20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。成骨誘導(dǎo)分化時(shí)間共21 d，第7、14、21天檢測(cè)ALP質(zhì)量濃度。按照大鼠ALP測(cè)定試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行ALP質(zhì)量濃度的測(cè)定。

1.3.6 損傷BMSCs成骨分化過(guò)程中OCN質(zhì)量濃度的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)方法同1.3.5節(jié)，按照大鼠過(guò)程中骨鈣素測(cè)定試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行OCN質(zhì)量濃度的測(cè)定。

1.3.7 成骨分化礦化結(jié)節(jié)染色及觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3代融合度為80%的BMSCs接種于6 孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞接種密度為4×104個(gè)/mL，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿后，加入2 mL含藥成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換一次含藥誘導(dǎo)液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、三唑酮組（20 μg/mL三唑酮）、Lf組（100 μg/mL Lf）、Lf修復(fù)組（20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。成骨誘導(dǎo)分化時(shí)間共21 d，誘導(dǎo)分化結(jié)束后用茜素紅進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察。

1.3.8 成脂分化油紅O染色及觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3代融合度為80%的BMSCs接種于6 孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞接種密度為4×104個(gè)/mL，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，加入2 mL含藥成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液培養(yǎng)3 d，吸去6 孔板中的A液，加入2 mL含藥成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液，24 h后，吸去B液，換回A液進(jìn)行誘導(dǎo)，A液和B液交替作用4 次后，用B液維持培養(yǎng)5 d，B液維持培養(yǎng)期間，每隔2 d換一次新鮮B液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、三唑酮組（20 μg/mL三唑酮）、Lf組（100 μg/mL Lf）、Lf修復(fù)組（20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。成脂誘導(dǎo)分化時(shí)間共21 d，誘導(dǎo)分化結(jié)束后用油紅O進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察。

1.3.9 RT-qPCR分析成骨、成脂基因表達(dá)變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3代融合度為80%的BMSCs接種于6 孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞接種密度為4×104個(gè)/mL，放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、三唑酮組（20 μg/mL三唑酮）、Lf組（100 μg/mL Lf）、Lf修復(fù)組（20 μg/mL三唑酮＋100 μg/mL Lf）。細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

成骨分化誘導(dǎo)：BMSCs培養(yǎng)于6 孔板中，完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上，加入2 mL含藥成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換一次含藥誘導(dǎo)液。

成脂分化誘導(dǎo)：BMSCs培養(yǎng)于6 孔板中，完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上，加入2 mL含藥成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液培養(yǎng)3 d，吸走6 孔板中的A液，加入2 mL含藥成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液，24 h后，吸走B液，換回A液進(jìn)行誘導(dǎo)，A液和B液交替作用4 次后，用B液維持5 d，B液維持培養(yǎng)期間，每隔2 d換一次新鮮B液。

收集細(xì)胞至無(wú)RNA酶的離心管中，按照RNAprep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒說(shuō)明書的方法去除基因組DNA，提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的方法合成cDNA，最后進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、5 s，延伸60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線條件（95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s）。成骨分化及成脂分化基因引物序列分別見(jiàn)表1、2。

表1 RT-qPCR成骨分化方向基因引物Table 1 Primer sequences for osteogeneic differentiation genes used in RT-qPCR

表2 RT-qPCR成脂分化方向基因引物Table 2 Primer sequences for adipogenic differentiation primers used in RT-qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2007和Origin 85軟件作圖。采用SPSS 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以單因素方差分析和Duncan’s法比較數(shù)據(jù)間差異的顯著性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 三唑酮對(duì)BMSCs存活率的影響

圖1 三唑酮對(duì)BMSCs存活率的影響Fig. 1 Effect of triadimefon on the survival rate of BMSCs

由圖1可知，與對(duì)照組（0 μg/mL）比較，采用不同質(zhì)量濃度（0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL）的三唑酮處理1 d時(shí)，20 μg/mL三唑酮能對(duì)BMSCs造成損傷，其余較低質(zhì)量濃度三唑酮會(huì)不同程度促進(jìn)BMSCs增殖；當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至3、5、7 d時(shí)，不同質(zhì)量濃度的三唑酮均能對(duì)BMSCs造成顯著損傷，且三唑酮對(duì)BMSCs的損傷作用在所選范圍內(nèi)呈現(xiàn)質(zhì)量濃度-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)三唑酮造成的細(xì)胞存活率的半數(shù)致死量，以及考慮到損傷時(shí)間的長(zhǎng)短，本研究選取20 μg/mL的三唑酮處理3 d作為構(gòu)建BMSCs損傷模型的條件，此條件下的細(xì)胞存活率為55.41%。

2.2 Lf對(duì)BMSCs增殖的影響

由圖2可知，與對(duì)照組（0 μg/mL）比較，采用不同質(zhì)量濃度的Lf處理BMSCs 1、3、5、7 d，均能不同程度地提高BMSCs的存活率。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Lf對(duì)BMSCs的增殖作用顯著增加，5 d時(shí)作用效果最明顯；這說(shuō)明Lf在10～200 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)BMSCs無(wú)毒性作用且能促進(jìn)其增殖，其中100 μg/mL的Lf作用最顯著。

圖2 Lf對(duì)BMSCs存活率的影響Fig. 2 Effect of Lf on the survival rate of BMSCs

2.3 Lf對(duì)損傷BMSCs存活率的影響

圖3 Lf對(duì)三唑酮損傷BMSCs增殖的影響Fig. 3 Effect of Lf on the proliferation of BMSCs treated with triadimefon

由圖3可知，與空白對(duì)照組比較，三唑酮損傷處理不同時(shí)間后，BMSCs存活率均顯著下降（P＜0.05）；對(duì)損傷模型加入Lf處理不同時(shí)間，結(jié)果顯示均能顯著提高BMSCs存活率（P＜0.05）。

2.4 Lf對(duì)損傷BMSCs成骨分化過(guò)程中分泌ALP的影響

表3 成骨誘導(dǎo)不同時(shí)間ALP質(zhì)量濃度的比較Table 3 ALP activity at different times of osteogenic induction

ALP作為骨形成和骨轉(zhuǎn)換的一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志性酶，1923年被首次發(fā)現(xiàn)，作為BMSCs成骨分化初期的標(biāo)志性酶，ALP在BMSCs增殖末期時(shí)質(zhì)量濃度開始增加，在礦化期前期階段質(zhì)量濃度達(dá)到最高，ALP質(zhì)量濃度在一定程度上顯示出細(xì)胞的成骨分化能力[25]。由表3可知，與空白對(duì)照組相比，三唑酮組誘導(dǎo)處理后，ALP質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）；Lf組和Lf修復(fù)組的ALP質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05）。由此可知，Lf可有效修復(fù)三唑酮對(duì)細(xì)胞成骨分化造成的損傷。

2.5 Lf對(duì)損傷BMSCs成骨分化過(guò)程中分泌OCN的影響

表4 成骨誘導(dǎo)不同時(shí)間OCN質(zhì)量濃度的比較Table 4 OCN contents at different times of osteogenic induction

OCN是成骨分化特異性表達(dá)的胞外基質(zhì)蛋白，可以結(jié)合鈣、磷離子形成礦化基質(zhì)，作為分化末期特異性標(biāo)志物，能調(diào)控骨礦物沉積以及轉(zhuǎn)移、促進(jìn)成骨分化成熟[26]。因OCN僅在成骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，故可以作為特異性指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)BMSCs的成骨分化能力。由表4可知，與空白對(duì)照組相比，三唑酮組誘導(dǎo)處理后，OCN質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）；Lf組和Lf修復(fù)組的OCN質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05）。由此可知，三唑酮會(huì)對(duì)細(xì)胞向成骨分化造成一定損傷，而Lf可有效修復(fù)這種損傷。

2.6 Lf對(duì)損傷BMSCs成骨誘導(dǎo)21 d后礦化結(jié)節(jié)形成的影響

礦化結(jié)節(jié)的形成是體外誘導(dǎo)BMSCs成骨分化能力最直接的表現(xiàn)，是BMSCs定向成骨分化的最后階段。BMSCs在成骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞外基質(zhì)具有大量的鈣沉積，是分化為骨的標(biāo)志，茜素紅可以和礦化結(jié)節(jié)中的鈣結(jié)合形成紅色的復(fù)合物。

圖4 成骨誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色結(jié)果（×100）Fig. 4 Alizarin red staining results after 21 days of osteogenic induction (× 100)

由圖4可以看出，與空白對(duì)照組相比，三唑酮組細(xì)胞形狀仍為長(zhǎng)梭形，極少有礦化結(jié)節(jié)形成，說(shuō)明三唑酮對(duì)BMSCs向成骨分化造成了損傷；Lf組形成的礦化結(jié)節(jié)最多，說(shuō)明Lf對(duì)BMSCs向成骨方向進(jìn)行分化具有促進(jìn)作用；Lf修復(fù)組和三唑酮組相比礦化結(jié)節(jié)數(shù)量更多，成骨分化較為明顯，說(shuō)明Lf可修復(fù)三唑酮對(duì)BMSCs向成骨分化造成的損傷。

2.7 Lf對(duì)損傷BMSCs成脂誘導(dǎo)21 d后脂滴形成的影響

圖5 成脂誘導(dǎo)21 d后油紅O染色結(jié)果（×100）Fig. 5 Oil red O staining results after 21 days of adipogenic induction (× 100)

由圖5可以看出，與空白對(duì)照組相比，三唑酮組出現(xiàn)脂滴數(shù)量最多，說(shuō)明三唑酮會(huì)使BMSCs向成脂方向進(jìn)行分化；Lf組脂滴數(shù)量最少，這說(shuō)明Lf能抑制脂滴生成；Lf修復(fù)組脂滴數(shù)量少于三唑酮組，說(shuō)明Lf對(duì)三唑酮促進(jìn)BMSCs向成脂分化的進(jìn)程有拮抗作用。

2.8 成骨誘導(dǎo)21 d后成骨分化基因的表達(dá)

表5 成骨誘導(dǎo)21 d BMSCs成骨分化基因的表達(dá)Table 5 Expression of osteogenic differentiation genes in BMSCs after osteogenic induction for 21 days

由表5可知，與空白對(duì)照組比較，Lf處理后成骨分化中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平都有所提高，Lf組ALP、BMP-2、Osteorix、Col I、Runx2、OCN基因表達(dá)分別上調(diào)52%、14%、50%、18%、70%、186%；Lf修復(fù)組上述基因分別上調(diào)28%、3%、50%、14%、17%、52%；三唑酮組上述基因分別下調(diào)24%、42%、50%、57%、50%、12%。Lf組成骨分化主要基因的上調(diào)比例大于Lf修復(fù)組。

2.9 成脂誘導(dǎo)21 d后成脂分化基因的表達(dá)

由表6可知，與空白對(duì)照組比較，Lf處理后都下調(diào)了成脂分化中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，Lf組PPAR-gamma、LPL、FABP4基因分別下調(diào)23%、26%、10%；Lf修復(fù)組上述基因分別下調(diào)4%、12%、0.5%；三唑酮組上述基因分別上調(diào)8%、25%、21%。

表6 成脂誘導(dǎo)21 d BMSCs成脂分化基因的表達(dá)Table 6 Expression of adipogenic differentiation genes in BMSCs after adipogenic induction for 21 days

3 討 論

本研究選擇BMSCs作為細(xì)胞模型研究三唑酮對(duì)細(xì)胞增殖分化損傷及Lf對(duì)此損傷的修復(fù)作用，選用6 個(gè)三唑酮質(zhì)量濃度梯度（0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL）作用于BMSCs，暴露時(shí)間1 d時(shí)，最高質(zhì)量濃度（20 μg/mL）三唑酮能對(duì)BMSCs造成損傷，其余較低質(zhì)量濃度三唑酮會(huì)不同程度促進(jìn)BMSCs增殖；當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)至3、5、7 d時(shí)，不同質(zhì)量濃度的三唑酮均能對(duì)BMSCs造成顯著的損傷，細(xì)胞存活率隨著暴露時(shí)間顯著降低，說(shuō)明三唑酮在所選劑量和時(shí)間范圍內(nèi)可抑制BMSCs增殖活性，對(duì)BMSCs具有損傷作用。其原因可能是細(xì)胞暴露于三唑酮導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞[27]。三唑酮細(xì)胞毒性作用隨暴露時(shí)間的逐漸增強(qiáng)，可能是由于通過(guò)酶的作用使三唑酮產(chǎn)生了毒性作用更強(qiáng)的代謝物三唑醇[28]。Lf可能對(duì)這種損傷具有修復(fù)作用，所以選用6 個(gè)Lf質(zhì)量濃度梯度（10、20、50、100、150、200 μg/mL）作用于BMSCs后計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果表明，Lf對(duì)BMSCs無(wú)毒性作用且能促進(jìn)BMSCs的增殖，其中100 μg/mL的Lf作用最顯著。分析Lf作用于BMSCs損傷模型后的細(xì)胞存活率、ALP質(zhì)量濃度、OCN質(zhì)量濃度、茜素紅染色、油紅O染色和定向分化基因表達(dá)變化，結(jié)果表明：三唑酮損傷BMSCs后，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞ALP、OCN質(zhì)量濃度顯著降低，礦化結(jié)節(jié)形成極少，脂滴數(shù)量增多，成骨分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)顯著降低，成脂分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)顯著增加。而100 μg/mL的Lf就能夠提高損傷BMSCs的細(xì)胞存活率，增加細(xì)胞ALP、OCN水平，增加細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)，減少脂滴的生成，增加成骨分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)，減少成脂分化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)。近年來(lái)也有報(bào)道證實(shí)Lf能夠促進(jìn)不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化，如Ta?li等[29]發(fā)現(xiàn)Lf具有促進(jìn)人源牙胚干細(xì)胞向牙源細(xì)胞分化的作用；Yagi等[30]研究發(fā)現(xiàn)Lf不僅能夠使間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP、OCN等水平提高，還可以促進(jìn)軟骨分化標(biāo)志物表達(dá)，而成脂分化標(biāo)志物的表達(dá)受到抑制，從而證實(shí)Lf能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化。

綜上所述，Lf能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，使BMSCs向成骨方向進(jìn)行分化，更好地促進(jìn)新骨形成，也對(duì)三唑酮所誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞損傷具有修復(fù)。本研究可以為今后三唑酮?dú)埩魧?duì)BMSCs定向分化的影響提供一定的理論依據(jù)，也為L(zhǎng)f調(diào)控個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育提供新的理論參考，對(duì)于三唑酮在體內(nèi)的代謝作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。