林 楊，楊 平，張 琦，郎宇曦，鄧皓天，孟憲軍,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

炎癥性腸病包括克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎兩種形式，是一種與腸道免疫相關(guān)的在結(jié)腸和直腸反復(fù)發(fā)作的炎癥性疾病[1]。在過(guò)去幾十年，炎癥性腸病在西方發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率很高，近年來(lái)，炎癥性腸病的發(fā)病率在發(fā)展中國(guó)家迅速增加，已經(jīng)發(fā)展成為一種全球性疾病[2]。炎癥性腸病是結(jié)腸癌的最主要誘因，炎癥性腸病患者的結(jié)腸癌發(fā)病率高達(dá)非炎癥性腸病患者的3 倍[3]。研究表明，包括白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-1β在內(nèi)的炎癥因子通過(guò)調(diào)控腸道上皮細(xì)胞的增殖、分化及存活而影響癌癥的發(fā)生[4]，而這一過(guò)程的發(fā)生與由腸道上皮細(xì)胞中活性氧失衡引起的氧化應(yīng)激密切相關(guān)[5]。目前，臨床通過(guò)手術(shù)切除結(jié)腸及服用一些抗炎或免疫調(diào)節(jié)藥物來(lái)治療炎癥性腸病，然而這些藥物因?yàn)橛泻軓?qiáng)的副作用而不適合長(zhǎng)期服用。因此，尋求一種副作用小且安全、有效、健康、綠色的天然替代品對(duì)于炎癥性腸病及其相關(guān)結(jié)直腸癌的防治具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞花色苷提取物[2]、蜂花粉多酚提取物[1]、霉菌胞外多糖提取物[6]、石榴提取物[7]等天然產(chǎn)物可以通過(guò)抑制炎癥因子，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化明顯的改善炎癥性腸病及其相關(guān)結(jié)直腸癌。

藍(lán)莓是杜鵑花科（Ericeceae）越橘屬（Vaccinium spp.）植物，因其富含生物活性化合物且具有很強(qiáng)的抗氧化能力而受到廣大消費(fèi)者青睞[8]，其主要活性化合物為花色苷。近年來(lái)，已有文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)源于其他植物的花色苷提取物具有抗腫瘤[9]、抗癌[10]、清除體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基[11]及改善腸道健康[12]的功效?；ㄉ找呀?jīng)在一些歐盟國(guó)家、澳大利亞及新西蘭被批準(zhǔn)作為‘E163’食品添加劑使用[13]?？寡趸芰?shù)據(jù)庫(kù)（http://oracdatabase.com）的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，每克藍(lán)莓提取物的氧化自由基吸收能力為234.7 μmol（以Trolox計(jì)，下同），明顯高于葡萄（5.18 μmol/g）、歐洲越橘（56.48 μmol/g）、石榴（188.00 μmol/g）等漿果提取物，研究表明該類(lèi)漿果中的抗氧化能力主要源自于花色苷[14]?？刂蒲装Y是預(yù)防和治療癌癥的有效手段，國(guó)內(nèi)外對(duì)于藍(lán)莓花色苷提取物的研究主要集中在提取[15]、純化[16]及穩(wěn)定性[17]方面。而就藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)炎癥、結(jié)腸癌的防治作用及機(jī)制方面鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥模型及結(jié)腸癌細(xì)胞模型，研究藍(lán)莓花色苷提取物對(duì)炎癥及結(jié)腸癌的功效，探討其可能的機(jī)制，為藍(lán)莓花色苷提取物預(yù)防炎癥性腸病及其結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓鮮果采購(gòu)于遼寧省大連市的有機(jī)藍(lán)莓基地，冷鏈運(yùn)回沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)漿果中心實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱凍存至制備提取物。

鹽酸（分析純）、甲醇（分析純）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、噻唑藍(lán)（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）、LPS 美國(guó)Sigma公司；MEM、DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；青霉素 美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán)；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)生命技術(shù)公司；對(duì)氨基苯甲酸、磷酸、N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽 北京鼎國(guó)生物試劑有限公司；IL-6、TNF-α試劑盒 美國(guó)BioLegend公司；鼠抗GAPDH單克隆抗體、兔抗一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）單克隆抗體、鼠抗環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）單克隆抗體、鼠抗細(xì)胞周期蛋白-2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）單克隆抗體、兔抗p53單克隆抗體 美國(guó)Proteintech公司。

1.2 儀器與設(shè)備

攪拌機(jī) 美的集團(tuán)；電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SB25-12DTN超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份公司；1100高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）、1100質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；CKX41倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；SANYAOM10-11AL CO2型恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本ANTYO公司；酶標(biāo)儀、C-Digit WB顯影儀 美國(guó)LI-COR Bioscience 公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓花色苷制備及含量測(cè)定

藍(lán)莓果實(shí)暗條件下自然解凍后、勻漿，按照前期的方法進(jìn)行藍(lán)莓提取物的制備[18]。將藍(lán)莓果實(shí)與體積分?jǐn)?shù)0.1%鹽酸酸化甲醇按照料液比1∶10混合，40 ℃超聲波輔助浸提60 min；真空抽濾，并重復(fù)浸提至提取液無(wú)色；合并濾液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃條件下濃縮至無(wú)甲醇?xì)埩?。純化可以去除藍(lán)莓提取物中除花色苷外的糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、果膠及弱極性的黃酮類(lèi)物質(zhì)[19]。本實(shí)驗(yàn)將填裝有X-AD7大孔樹(shù)脂的400 mL玻璃柱置于層析柜中，溫度設(shè)定為4 ℃，蒸餾水沖洗樹(shù)脂中的雜質(zhì)，用恒流泵以2 BV/h的流速注入提取物，靜置，吸附過(guò)夜。用去離子水將水溶性物質(zhì)洗脫后，用無(wú)水乙醇洗脫，流速為2 BV/h。收集并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙醇洗脫液至無(wú)醇味，將濃縮液冷凍干燥。將藍(lán)莓提取物凍干粉至于-80 ℃超低溫冰箱，凍存?zhèn)溆?。參照前期研究，采用pH示差法測(cè)定藍(lán)莓提取物中花色苷含量[18]。

1.3.2 高效液相色譜-電噴霧二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用分析

樣品準(zhǔn)備：準(zhǔn)確稱量5 mg藍(lán)莓提取物凍干粉，并溶解于2 mL色譜純甲醇溶液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

高效液相色譜-電噴霧二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)條件：分離柱：Dikma Platisil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.7 mL/min；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～10 min，85% A；10～55 min，85%～35% A；55～67 min，35%～85% A。在正離子模式下進(jìn)行全自動(dòng)二級(jí)質(zhì)譜掃描，掃描范圍為m/z 150～1 500；毛細(xì)管電壓為3 500 V；霧化氣體為氮?dú)?；霧化氣壓力為40 psi；干燥氣流速為12 L/min。使用矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)到的峰面積建立峰面積與物質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算藍(lán)莓花色苷中各單體的含量。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

稱取2 mg的DPPH粉末溶于50 mL甲醇溶液中，得到DPPH工作液。取兩塊96 孔板A和B，將100 μL樣品和空白溶液分別加入兩塊96 孔板，在A板中加入100 μL DPPH工作液，在B板中加入100 μL甲醇溶液。避光反應(yīng)30 min后，在517 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀對(duì)板A和B進(jìn)行讀數(shù)，并按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為樣品與DPPH工作液反應(yīng)的吸光度；A1’為樣品與甲醇溶液反應(yīng)的吸光度；A0為空白溶液與DPPH工作液反應(yīng)的吸光度；A0’為空白溶液與甲醇溶液反應(yīng)的吸光度。

1.3.4 藍(lán)莓提取物對(duì)細(xì)胞炎癥的作用

1.3.4.1 RAW 264.7細(xì)胞系培養(yǎng)

將RAW 264.7細(xì)胞置于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、1%青霉素）中，于培養(yǎng)箱中37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)。每2 d進(jìn)行換液、傳代，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為2～15 代。

1.3.4.2 RAW 264.7細(xì)胞存活率及NO釋放能力的測(cè)定

在96 孔板中加入200 μL混合均勻的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)2×104個(gè)/孔，過(guò)夜培養(yǎng)后，移去培養(yǎng)基并加入200 μL LPS和藍(lán)莓提取物溶液。實(shí)驗(yàn)分組包括：空白對(duì)照組、LPS（1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）＋不同質(zhì)量濃度（50、100、200、400、600、800 μg/mL）藍(lán)莓提取物組，空白對(duì)照組只加入完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次，在相同條件下培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液用于NO測(cè)定，再在每孔中加入100 μL MTT儲(chǔ)存液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處讀數(shù)。計(jì)算對(duì)照組細(xì)胞的存活率。

采用Griess方法測(cè)定收集的培養(yǎng)基上清液中NO含量[20]。即將培養(yǎng)基上清液與Griess試劑等體積混合，反應(yīng)5 min后，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)基上清液中NO含量。

1.3.4.3 細(xì)胞因子IL-6、TNF-α分泌水平測(cè)定

在6 孔板中加入2 mL混合均勻的細(xì)胞懸液，接種密度為2×105細(xì)胞/孔，并分組處理培養(yǎng)24 h。分為空白對(duì)照組（細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基）、LPS組（1 μg/mL）、LPS（1 μg/mL）＋400 μg/mL花色苷提取物組和LPS（1 μg/mL）＋600 μg/mL花色苷提取物組。于冰上收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟測(cè)定細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的含量。

1.3.4.4 RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2表達(dá)測(cè)定

將1.3.4.3節(jié)中所述細(xì)胞于冰上收集上清液后，加入100 μL RIPA裂解液提取細(xì)胞核蛋白。用Bradford法測(cè)定蛋白含量，計(jì)算上樣體積。每孔上樣15 μg蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳以200 V恒壓、400 mA恒定電流分離樣品，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST清洗后，加入一抗iNOS（1∶1 000）、COX-2（1∶2 000），4 ℃封閉過(guò)夜，TBST清洗后，加入稀釋5 000 倍的二抗室溫孵育1.5 h，TBST再次清洗，曝光顯影后拍照。

1.3.5 藍(lán)莓提取物對(duì)結(jié)腸癌的作用

1.3.5.1 HCT-116細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS、1%青霉素的MEM培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為2～15 代。

1.3.5.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存能力

在96 孔板中加入200 μL混合均勻的HCT-116細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/孔，過(guò)夜培養(yǎng)，移去培養(yǎng)基后加入不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200 μg/mL）的藍(lán)莓花色苷提取物分組培養(yǎng)24、48、72 h。按照1.3.4.2節(jié)中的方法檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5.3 HCT-116細(xì)胞中CDK2、p53蛋白表達(dá)測(cè)定

在6 孔板中加入2 mL混合均勻的HCT-116細(xì)胞懸液，接種密度為2×104個(gè)細(xì)胞/孔，過(guò)夜培養(yǎng)后，分別加入50、100、200 μg/mL藍(lán)莓提取物以及添加細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基作空白對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后，參照1.3.4.3節(jié)的方法收集蛋白并測(cè)定含量，Western blot檢測(cè)HCT-116細(xì)胞中CDK2、p53的表達(dá)水平。其中，CDK2一抗、p53一抗均按1∶1 000稀釋。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓提取物花色苷含量及組成鑒定結(jié)果

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（a）和藍(lán)莓提取物（b）中花色苷高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC profiles of standards (a) and anthocyanins (b) from BE

藍(lán)莓提取物總花色苷含量為312.75 mg/g（以矢車(chē)菊素3-葡萄糖苷質(zhì)量計(jì)，下同），高于文獻(xiàn)中報(bào)道的黑米、葡萄、紫薯等其他富含花色苷的植物提取物中花色苷含量[21]。Hwang等[22]使用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液提取制備的藍(lán)莓提取物花色苷含量?jī)H為11.8 mg/g。藍(lán)莓提取物總花色苷含量測(cè)定結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的提取、純化方法能夠有效地提取、富集花色苷。圖1為藍(lán)莓提取物花色苷組成色譜圖，共有12 個(gè)峰。參考文獻(xiàn)和MS數(shù)據(jù)（表1）可知：色譜峰1與色譜峰2有相同的分子離子峰（m/z465）和碎片峰（m/z303），Primetta等[23]報(bào)道了飛燕草素-3-半乳糖苷優(yōu)先于飛燕草素-3-葡萄糖苷洗脫，因此判斷色譜峰1為飛燕草素-3-半乳糖苷，色譜峰2為飛燕草素-3-葡萄糖苷；同理，判斷色譜峰3和色譜峰5分別為矢車(chē)菊素3-半乳糖苷和矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷，判斷色譜峰8和色譜峰10分別為芍藥色素-3-半乳糖苷和芍藥色素3-葡萄糖苷；色譜峰4和色譜峰7有離子峰（m/z435）、（m/z419）和分子離子峰（m/z303）、（m/z287），而碎片峰（M＋-132）代表分子離子峰缺少一個(gè)阿拉伯糖，因此色譜峰4為飛燕草素-3-阿拉伯糖苷，同理，判斷色譜峰7、9、12分別為矢車(chē)菊素-3-阿拉伯糖苷、牽?；ㄉ?3-阿拉伯糖苷和錦葵色素-3-阿拉伯糖苷；另外，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，在28.6 min，除了芍藥色素-3-半乳糖苷，還有錦葵色素-3-半乳糖苷出現(xiàn)，而在液相色譜圖中只有色譜峰10出現(xiàn)，因此推測(cè)二者為共同洗脫，同理推測(cè)色譜峰11為芍藥色素-3-葡萄糖苷和錦葵色素-3-葡萄糖苷的共同洗脫峰。這與文獻(xiàn)報(bào)道的在藍(lán)莓、藍(lán)靛果等漿果的花色苷組成分析中出現(xiàn)共同洗脫現(xiàn)象相似[24]。根據(jù)表1對(duì)液相色譜圖的峰面積統(tǒng)計(jì)可得：該藍(lán)莓提取物中質(zhì)量濃度最高的4 種花色苷為：飛燕草素-3-半乳糖苷（51.66 μg/mL）、飛燕草素-3-阿拉伯糖苷（34.33 μg/mL）、飛燕草素-3-葡萄糖苷（27.21 μg/mL）、矢車(chē)菊素-3-阿拉伯糖苷（28.08 μg/mL）。飛燕草素家族花色苷廣泛存在于果蔬中，已經(jīng)被證明能夠通過(guò)抗氧化作用抑制腫瘤的發(fā)生、遷移[25]，藍(lán)莓提取物中飛燕草素家族花色苷在總花色苷組成中占很大比例，因此推測(cè)藍(lán)莓提取物具有抑制炎癥、抗癌的作用。

表1 藍(lán)莓花色苷提取物中花色苷組成鑒定Table 1 Identification of anthocyanins in BE

2.2 藍(lán)莓提取物DPPH自由基清除能力

人體內(nèi)代謝產(chǎn)生的自由基和活性氧可以引起細(xì)胞膜脂質(zhì)、細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和酶的損傷，而具有抗氧化能力的活性物質(zhì)能夠有效清除這些自由基和活性氧[26]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定來(lái)分析藍(lán)莓提取物的抗氧化能力。

圖2 不同質(zhì)量濃度藍(lán)莓提取物對(duì)DPPH自由基清除率Fig. 2 DPPH radical scavenging capacity of BE at different concentrations

由圖2可知，藍(lán)莓提取物有很好的DPPH自由基清除能力，且隨著質(zhì)量濃度增加而顯著升高（P＜0.05），在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，藍(lán)莓提取物的DPPH自由基清除率高達(dá)（93.38±3.84）%。藍(lán)莓提取物DPPH自由基清除率的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為42.00 μg/mL，比多種黑醋栗（56.19～61.17 μg/mL）[27]和枸杞（784～1 254 μg/mL）[28]DPPH自由基清除率的IC50低，說(shuō)明其抗氧化性更高。

2.3 藍(lán)莓提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥的作用

2.3.1 藍(lán)莓提取物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的影響

腸道發(fā)生炎癥時(shí)，LPS的生成量會(huì)隨革蘭氏陰性菌數(shù)量而增加，影響炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展，炎癥和腫瘤有著十分緊密的聯(lián)系，長(zhǎng)期的炎癥是腫瘤發(fā)展的主要誘因，通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥也是常見(jiàn)的炎癥研究模型[29]。NO與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，是炎癥發(fā)病機(jī)制中的重要信使[30]。

圖3 藍(lán)莓提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的影響Fig. 3 Effect of BE on LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells

由圖3可知，與空白對(duì)照組相比，LPS組RAW 264.7細(xì)胞NO釋放水平顯著升高（P＜0.05）。藍(lán)莓提取物質(zhì)量濃度不高于100 μg/mL的處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO釋放水平無(wú)顯著影響（P＞0.05），而質(zhì)量濃度范圍為200～800 μg/mL的藍(lán)莓提取物顯著降低了LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放水平（P＜0.05），且藍(lán)莓提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)264.7細(xì)胞NO釋放水平隨質(zhì)量濃度增加而增加，說(shuō)明藍(lán)莓提取物具有抗炎作用。

2.3.2 藍(lán)莓提取物對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響

圖4 藍(lán)莓提取物抑制RAW 264.7細(xì)胞增殖的作用Fig. 4 Effect of BE on the proliferation of RAW 264.7 cells

腸道慢性炎癥是結(jié)直腸癌發(fā)病的一個(gè)主要誘因[31]。如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)1 μg/mL LPS處理24 h后，RAW 264.7細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明建模成功，LPS成功誘導(dǎo)了RAW 264.7細(xì)胞炎癥。與LPS組相比，50、100、200、400 μg/mL藍(lán)莓果實(shí)提取物處理組RAW 264.7細(xì)胞增殖率無(wú)顯著差異；而經(jīng)過(guò)24 h處理后，600、800 μg/mL藍(lán)莓提取物對(duì)RAW 264.7的抑制率分別增加至4.32%和41.94%，均顯著低于空白對(duì)照組和LPS組，因此選擇質(zhì)量濃度為400 μg/mL和600 μg/mL的藍(lán)莓提取物溶液處理RAW 264.7細(xì)胞以進(jìn)行炎癥因子調(diào)節(jié)作用的研究。

2.3.3 藍(lán)莓提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞中IL-6和TNF-α分泌的影響

圖5 藍(lán)莓提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-6（A）、TNF-α（B）的影響Fig. 5 Effect of BE on LPS-induced secretion of IL-6 (A) and TNF-α (B)in RAW 264.7 cells

細(xì)胞中促炎因子分泌的增加可加速炎癥的發(fā)展[32]。由圖5可知，LPS組中IL-6、TNF-α的水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），而400、600 μg/mL的藍(lán)莓花色苷提取物顯著降低了LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中IL-6、TNF-α的分泌水平（P＜0.05）。與LPS組比，600 μg/mL藍(lán)莓提取物處理使得LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中IL-6、TNF-α分泌分別下降了80.0%和66.21%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)莓提取物能夠通過(guò)下調(diào)RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子的分泌從而抑制炎癥。

2.3.4 藍(lán)莓提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞iNOS和COX-2表達(dá)的影響

如圖6所示，藍(lán)莓提取物能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞模型中COX-2的表達(dá)，且抑制效果隨質(zhì)量濃度增加而增加。在空白對(duì)照組中未檢測(cè)到COX-2蛋白的表達(dá)，與LPS組相比，400、600 μg/mL藍(lán)莓提取物處理后，COX-2的蛋白表達(dá)量下降至LPS組的89.7%和39.74%。研究表明，非甾體類(lèi)抗炎藥可以有效地抑制COX-2蛋白表達(dá)[33]，并且通過(guò)抗IL-6抗體阻斷IL-6的分泌可以減緩潰瘍性結(jié)腸炎患者的炎癥[34]。相似的，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷對(duì)COX-2蛋白的表達(dá)具有抑制作用。

圖6 藍(lán)莓提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of BE on LPS-induced expression of COX-2 in RAW 264.7 cells

圖7 藍(lán)莓提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of BE on LPS-induced expression of iNOS in RAW 264.7 cells

如圖7所示，LPS組中iNOS表達(dá)量高于空白對(duì)照組，藍(lán)莓提取物有效地降低了iNOS蛋白表達(dá)量，且600 μg/mL藍(lán)莓提取物處理后，iNOS的表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組。Serra等[35]發(fā)現(xiàn)矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷通過(guò)抑制NO、PGE2、IL-8的產(chǎn)生及iNOS、COX-2的表達(dá)降低HT-29細(xì)胞中促炎因子的水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了藍(lán)莓提取物可以調(diào)控NO的釋放以及炎癥因子IL-6、TNF-α和iNOS、COX-2的表達(dá)，對(duì)炎癥產(chǎn)生具有抑制作用。

2.4 藍(lán)莓提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用

2.4.1 藍(lán)莓提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

如圖8所示，藍(lán)莓提取物明顯抑制了HCT-116細(xì)胞的增殖，不同質(zhì)量濃度藍(lán)莓提取物處理相同時(shí)間后HCT-116細(xì)胞增殖率顯著減?。≒＜0.05），說(shuō)明藍(lán)莓提取物對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖作用具有劑量依賴性。藍(lán)莓提取物處理24、48 h和72 h后，HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50分別為196.86、191.52 μg/mL和153.36 μg/mL，其IC50隨時(shí)間延長(zhǎng)而減小，具有時(shí)間依賴性。藍(lán)莓提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用歸因于其中的花色苷、黃酮、多酚類(lèi)化合物，這些化合物已經(jīng)被證實(shí)對(duì)結(jié)腸癌有很強(qiáng)的抗增殖效果[10]。

圖8 藍(lán)莓提取物對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響Fig. 8 Effect of BE on the proliferation of HCT-116 cells

2.4.2 藍(lán)莓提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CDK2和p53蛋白表達(dá)的影響

誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯是控制癌癥發(fā)展的有效策略[36]，細(xì)胞周期激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）的表達(dá)水平可以很大程度影響細(xì)胞周期。作為細(xì)胞G1期的重要調(diào)節(jié)因子，CDK2被認(rèn)為是化學(xué)手段預(yù)防治療癌癥的重要靶點(diǎn)[37]。

圖9 藍(lán)莓提取物對(duì)HCT-116細(xì)胞中CDK2蛋白表達(dá)的影響Fig. 9 Effect of BE on the expression of CDK2 in HCT-116 cells

如圖9所示，藍(lán)莓提取物可以顯著降低HCT-116細(xì)胞中CDK2蛋白的表達(dá)量（P＜0.05），50、100 μg/mL和200 μg/mL的藍(lán)莓花色苷提取物處理48 h后，CDK2蛋白的表達(dá)水平分別下降至對(duì)照組的58.55%、52.83%和40.66%。研究表明，CDK2參與多個(gè)通路的調(diào)控，在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[38-39]。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是預(yù)防與治療癌癥的另一有效手段[40]。腫瘤抑制因子p53能夠抑制異常細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡[41]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，與空白對(duì)照組相比，藍(lán)莓提取物處理顯著上調(diào)了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)水平（P＜0.05）。隨著藍(lán)莓提取物質(zhì)量濃度的增加，p53蛋白的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。使用200 μg/mL藍(lán)莓提取物處理后，p53蛋白的表達(dá)水平是空白對(duì)照組的2.69 倍。結(jié)果表明藍(lán)莓提取物對(duì)p53蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。這與León-González等[25]的研究結(jié)果相似，黑醋栗花色苷提取物處理急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞，能夠抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)p53蛋白的激活并下調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Srivastava等[42]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷提取物能夠通過(guò)增加DNA的片段化及Caspase-3的活性誘導(dǎo)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡；體內(nèi)、體外研究說(shuō)明幾種花色苷單體對(duì)HCT-116和HT-29細(xì)胞無(wú)抑制作用，全食品具有協(xié)同作用，其對(duì)癌細(xì)胞的效果優(yōu)于幾種花色苷或酚類(lèi)化合物單體的效果[21]。

圖10 藍(lán)莓提取物對(duì)HCT-116細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的影響Fig. 10 Effect of BE on the expression of p53 in HCT-116 cells

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜-電噴霧二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定了藍(lán)莓提取物的花色苷組成，并通過(guò)測(cè)定DPPH自由基清除能力發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓提取物有很強(qiáng)的抗氧化能力；同時(shí)，構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)RAW.264.7細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓提取物可以通過(guò)抑制NO釋放，下調(diào)炎癥因子IL-6、TNF-α的水平，降低iNOS、COX-2蛋白表達(dá)來(lái)抑制炎癥；通過(guò)結(jié)腸癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷提取物能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，調(diào)控CDK2和p53蛋白的表達(dá)。因此，藍(lán)莓提取物能夠顯著地抑制炎癥及結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并且對(duì)與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，這為藍(lán)莓提取物在炎癥性腸病及相關(guān)結(jié)直腸癌的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。